靶向腫瘤細(xì)胞的相變型納米粒多模態(tài)顯像及其聲動(dòng)力治療的體外實(shí)驗(yàn)研究

易衡靜，張亮，王志剛，宋嬌，李雪霖，王琦，李興升

癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病之一，早期診斷和靶向治療對(duì)于提高癌癥患者的生存率具有重要意義[1-2]。研制一種兼具腫瘤靶向、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)(顯像)和選擇性治療效能的診療劑是目前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，七甲川花菁類熒光小分子IR780是一種近紅外(near-infrared，NIR)染料，同時(shí)也是一種聲敏劑[4]，它能夠選擇性地優(yōu)先聚集在腫瘤部位，在不添加任何特異性配體的情況下，可通過(guò)糖酵解、細(xì)胞膜電位及有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽(organic anion transporting peptides，OATP)等介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療[5-6]。本研究利用脂質(zhì)體包載聲敏劑IR780，以全氟戊烷(perfluoropentane，PFP)為核心，構(gòu)建了一種靶向相變型多功能脂質(zhì)納米粒(Lip-PFP-IR780)，使其能靶向性地與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，并實(shí)現(xiàn)多模態(tài)顯像，引導(dǎo)腫瘤的聲動(dòng)力治療，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine，DPPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(1,2-distearoylsn-glycero-3-phospho-(1-rac-glycerol)，DSPG)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)]-2000，DSPE-mPEG2000)：美國(guó)Avanti公司；膽固醇、IR780碘化物、PFP、瓊脂糖凝膠粉：美國(guó)Sigma公司；熒光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、高氯酸鹽(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI)：中國(guó)碧云天公司；單線氧熒光探針(oxygen sensor green reagent，SOSG)：美國(guó)Thermo Fisher公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)：日本同仁公司。聲振儀：美國(guó)Sonic公司；Malvern粒徑儀：美國(guó)Zetasize公司；M2型多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司；低強(qiáng)度聚焦超聲(low intensity focused ultrasound，LIFU)治療儀、DFY-Ⅱ型超聲圖像定量分析儀：重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所；百盛超聲診斷儀：意大利ESAOTES.P.A公司；光聲成像儀：加拿大Vevo公司；活體熒光成像儀：美國(guó)Kodak公司；TCSSP2激光共聚焦顯微鏡：德國(guó)Lecia公司；流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD Influx公司。4T1細(xì)胞株(小鼠乳腺癌細(xì)胞)由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所提供。

1.2 Lip-PFP-IR780納米粒的制備 采用乳化法制備，即將DPPC、DSPG、DSPE-mPEG2000、膽固醇和IR780按照10:4:4:2:1的比例共21mg溶解于20ml三氯甲烷中，于圓底燒瓶?jī)?nèi)置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，以55℃、100r/min減壓蒸發(fā)約120min，去除三氯甲烷，圓底燒瓶底部形成均勻的墨綠色薄膜，用4ml PBS洗脫水化，將所得的墨綠色混合液轉(zhuǎn)移至10ml管內(nèi)。在冰浴條件下向管中加入400μl PFP，并用聲振儀乳化(125W，5min，震5s停5s)，得到均勻的墨綠色混懸液。4℃離心3次(6000r/min，5min)去除未被包載的IR780，即獲得目標(biāo)脂質(zhì)納米粒(Lip-PFP-IR780)。用4ml PBS重懸置于4℃?zhèn)溆?。在制備過(guò)程中不包載IR780即得到非靶向相變型脂質(zhì)納米粒(Lip-PFP)。制備過(guò)程中添加熒光染料DiI即獲得熒光脂質(zhì)納米粒。

1.3 Lip-PFP-IR780納米?；咎匦詸z測(cè) 納米粒制備成功后，觀察其水溶液性狀。納米粒用PBS稀釋一定倍數(shù)后于光鏡下觀察其形態(tài)，Malvern粒徑儀檢測(cè)其粒徑大小、分布、電位。稱取適量IR780溶于二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，用PBS稀釋至不同濃度，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光特性，計(jì)算IR780的包封率。

1.4 凝膠模型的制備及Lip-PFP-IR780納米粒體外多模態(tài)顯像 稱取15g瓊脂糖凝膠粉，加入600ml去離子水，加熱至完全溶解，再反復(fù)加熱數(shù)次至氣泡完全排出，緩慢倒入5ml離心管盒或200μl槍頭盒，插入5ml離心管或200μl槍頭，待其凝固后取出離心管或槍頭即得到帶孔凝膠模型。在5ml凝膠模型中加入2mg/ml Lip-PFP-IR780納米粒PBS溶液，在不同功率(0.4、1.2、2.0W/cm2)和不同時(shí)間(1、2、3min)的LIFU輻照下，觀察其超聲顯像情況，并用DFY-Ⅱ型超聲圖像定量分析儀分析各靶區(qū)聲強(qiáng)值。在200μl凝膠模型中加入2mg/ml Lip-PFP-IR780納米粒PBS溶液，采用波長(zhǎng)680～970nm脈沖激光輻照，以步長(zhǎng)為5nm波長(zhǎng)采集光聲信號(hào)，尋找光聲(photoacoustic，PA)顯像最好的激發(fā)波長(zhǎng)；改變Lip-PFP-IR780納米粒PBS溶液的濃度(0.4～2mg/ml)，以最佳顯像波長(zhǎng)的脈沖激光輻照，采集各組光聲圖像，并定量分析各組的光聲信號(hào)值。取PBS及2mg/ml Lip-PFP-IR780納米粒PBS溶液各100μl，置于96孔板中，用活體熒光成像儀進(jìn)行掃描，激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)為745/820nm，沿各管內(nèi)徑勾畫(huà)感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，測(cè)得熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.5 4T1細(xì)胞的培養(yǎng)及體外尋靶實(shí)驗(yàn) 4T1細(xì)胞培養(yǎng)采用含10ml/L鏈霉素-青霉素、100ml/L胎牛血清的DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱(37℃，50ml/L CO2)常規(guī)培養(yǎng)。將4T1細(xì)胞按適宜濃度接種于共聚焦專用培養(yǎng)皿內(nèi)24h后，加入適量DiI標(biāo)記的Lip-PFP-IR780納米粒(靶向組)完全培養(yǎng)基稀釋液，或加入等量DiI標(biāo)記的Lip-PFP納米粒(非靶向組)完全培養(yǎng)基稀釋液，與細(xì)胞共同孵育2h后，用PBS沖洗未被吞噬的納米粒，再加入適量多聚甲醛固定細(xì)胞，用藍(lán)色熒光染料DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，再以PBS沖洗后，將培養(yǎng)皿置于錫箔紙內(nèi)避光送激光共聚焦成像。將4T1細(xì)胞按照適宜濃度接種于6孔板中24h后，加入等量DiI標(biāo)記的靶向或非靶向納米粒(n=3)與細(xì)胞共同孵育2h，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4T1細(xì)胞與納米粒的結(jié)合率。

1.6 體外聲動(dòng)力治療 以SOSG為單線態(tài)氧(1O2)指示劑，將Lip-PFP-IR780納米粒用PBS稀釋至0.4mg/ml，加入適量的SOSG甲醇溶液并充分混勻，再給予強(qiáng)度為2W/cm2的LIFU輻照不同時(shí)間(0、1、2、3、4、5min)，用M2型多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)為488/525nm)。將4T1細(xì)胞以適宜濃度接種于96孔板24h后，各孔加入等量不同濃度(0～0.1mg/ml，n=5)Lip-PFP-IR780納米粒完全培養(yǎng)基稀釋液，與細(xì)胞共同孵育2h后，用PBS沖洗未被吞噬的納米粒2～3次，分別給予強(qiáng)度為2W/cm2的LIFU輻照0s或90s，輻照完成后繼續(xù)孵育1h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩因素比較采用兩因素方差分析，并用Levene方差齊性檢驗(yàn)判斷方差齊性，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Lip-PFP-IR780納米粒的基本特性 制備的Lip-PFP-IR780納米粒水溶液呈墨綠色混懸液(圖1A)。光鏡下顆粒呈圓形，大小均一，分散性好(圖1B)。Malvern粒徑儀測(cè)得粒徑為(338.5±124.2)nm，電位為(–27.6±2.4)mV，分散度(polydispersity index，PDI)=0.087(圖1C)。紫外吸收光譜在近780nm處有最大吸收峰，并隨濃度的增加而增加(圖1D)，最大吸收峰處的線性回歸方程為：y=0.257x－0.009(r=0.9996)。由此計(jì)算IR780的包封率為91.6%。

2.2 Lip-PFP-IR780納米粒體外多模態(tài)顯像 體外超聲顯像示，Lip-PFP-IR780納米粒經(jīng)LIFU輻照后的超聲造影顯像明顯增強(qiáng)(圖2A)。定量分析顯示，Lip-PFP-IR780納米粒經(jīng)LIFU輻照1、2、3min，強(qiáng)度為0.4W/cm2的諧波回聲強(qiáng)度分別為(1.77±0.23)dB、(4.62±0.52)dB、(8.19±0.64)dB，強(qiáng)度為1.2W/cm2的諧波回聲強(qiáng)度分別為(5.46±0.31)dB、(9.50±0.78)dB、(27.29±1.03)dB，強(qiáng)度為2.0W/cm2諧波回聲強(qiáng)度分別為(10.01±0.32)dB、(19.11±0.67)dB、(44.78±1.34)dB。LIFU輻照3min，強(qiáng)度為1.2W/cm2或2.0W/cm2的諧波回聲強(qiáng)度與強(qiáng)度為0.4W/cm2比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，LIFU強(qiáng)度為2.0W/cm2輻照3min與1min比較，其諧波回聲強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2B)。在680～970nm激發(fā)波長(zhǎng)下，Lip-PFP-IR780納米粒均可表現(xiàn)出光聲信號(hào)，780nm處有最大吸收峰(圖2C)。體外光聲檢測(cè)結(jié)果顯示，780nm波長(zhǎng)激發(fā)下，隨著Lip-PFP-IR780納米粒濃度的增加，光聲信號(hào)值逐漸增強(qiáng)(圖2D)，呈線性改變：y=0.5929x－0.1205(r=0.997)。體外熒光顯像示Lip-PFP-IR780納米粒熒光強(qiáng)度為(37.43±1.51)×108，明顯高于PBS組[(1.37±0.11)×108]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2E)。

圖1 Lip-PFP-IR780納米粒的基本表征Fig.1 Basic representation of Lip-PFP-IR780 nanoparticles

圖2 Lip-PFP-IR780納米粒的體外多模態(tài)顯像Fig.2 The multimodal imaging of Lip-PFP-IR780 nanoparticles in vitro

2.3 Lip-PFP-IR780納米粒體外尋靶實(shí)驗(yàn) 激光共聚焦顯微鏡示靶向組(Lip-PFP-IR780)細(xì)胞膜周圍和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量納米粒聚集 (圖3A-D)，非靶向組(Lip-PFP)僅細(xì)胞膜周圍有少量納米粒聚集(圖3EH)。流式細(xì)胞術(shù)定量分析顯示4T1細(xì)胞與靶向納米粒的結(jié)合率為84.48%±2.73%，與非靶向納米粒的結(jié)合率為27.01%±3.40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3I、J)。

2.4 Lip-PFP-IR780納米粒體外聲動(dòng)力治療效果

隨著LIFU輻照時(shí)間的增加，產(chǎn)生的單線態(tài)氧(1O2)逐漸增多(圖4A)。CCK-8法測(cè)定結(jié)果顯示，納米粒濃度為0mg/ml時(shí)，LIFU輻照90s對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響(P＞0.05)；同一納米粒濃度組內(nèi)(0.02～0.10mg/ml)，經(jīng)LIFU輻照90s的輻照組與未輻照組(0s)比較，4T1細(xì)胞存活率均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4B)。

圖3 Lip-PFP-IR780納米粒體外尋靶實(shí)驗(yàn)Fig.3 Targeting ability in vitro of Lip-PFP-IR780 nanoparticles

圖4 Lip-PFP-IR780納米粒體外聲動(dòng)力治療效果Fig.4 Efficacy of sonodynamic therapy in vitro assisted by Lip-PFP-IR780 nanoparticles

3 討 論

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康，其高效診治至關(guān)重要。近年來(lái)，多模態(tài)分子顯像技術(shù)發(fā)展迅猛，特別是集診斷與治療于一體化的靶向分子探針，為腫瘤的早期診斷及高效治療提供了新的方法與思路[7-8]。PFP經(jīng)超聲輻照可以發(fā)生聲致相變(acoustic droplet vaporization，ADV)[9-10]，作為一種新型的超聲分子探針，在超聲的顯影與治療方面有良好的應(yīng)用前景[11]。IR780是具有腫瘤靶向性的聲敏劑，但它的強(qiáng)疏水性限制了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用[12]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)乳化法制備以PFP為核心、IR780及磷脂雙分子層為外殼、具有殼核結(jié)構(gòu)的液氣相變型脂質(zhì)納米粒(Lip-PFP-IR780)，其水溶液為墨綠色混懸液，光鏡下形態(tài)呈均一圓形，分散性好，粒徑為(338.5±124.2)nm，IR780包封率高達(dá)91.6%。在體外尋靶實(shí)驗(yàn)中，激光共聚焦顯微鏡示靶向組(Lip-PFP-IR780)納米粒較多聚集于4T1細(xì)胞膜周圍及細(xì)胞質(zhì)，而非靶向組(Lip-PFP)納米粒只有少量聚集于4T1細(xì)胞膜周圍。流式細(xì)胞術(shù)示4T1細(xì)胞對(duì)靶向組納米粒的結(jié)合率明顯高于非靶向組。上述結(jié)果均說(shuō)明IR780對(duì)4T1細(xì)胞具有良好的靶向作用，提示該納米?？梢酝ㄟ^(guò)被動(dòng)靶向效應(yīng)(enhanced permeation and retention effect，EPR)[13]及IR780靶向高效地聚集到腫瘤部位，用于腫瘤的進(jìn)一步顯影與治療。

在本實(shí)驗(yàn)的超聲顯像中，經(jīng)LIFU輻照后Lip-PFP-IR780納米粒發(fā)生液氣相變，實(shí)現(xiàn)了超聲造影，隨著輻照強(qiáng)度和時(shí)間的增加其回聲強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，不僅證實(shí)脂質(zhì)體成功包裹了PFP，也說(shuō)明了Lip-PFP-IR780納米粒可以在腫瘤部位進(jìn)行超聲造影顯像。同時(shí)，IR780是一種近紅外光敏劑，可應(yīng)用于光聲顯像和熒光顯像。體外光聲顯像實(shí)驗(yàn)中，PA值在780nm處有最大吸收峰，且光聲信號(hào)隨著Lip-PFP-IR780納米粒濃度增加而增強(qiáng)，說(shuō)明IR780被成功包載于脂質(zhì)體，Lip-PFP-IR780納米?？捎糜诠饴曪@像。在熒光顯像中，Lip-PFP-IR780納米粒組熒光信號(hào)明顯高于PBS組，亦說(shuō)明IR780成功包載于脂質(zhì)體中，Lip-PFP-IR780納米?？捎糜跓晒怙@像。Lip-PFP-IR780脂質(zhì)納米粒能夠進(jìn)行超聲/光聲/熒光多模態(tài)顯像，為腫瘤的聲動(dòng)力治療提供定位、指導(dǎo)和檢測(cè)。

聲動(dòng)力治療是一種新發(fā)展起來(lái)的腫瘤治療方法，于1989年首次提出[14]，主要是通過(guò)聲敏劑聯(lián)合超聲波的協(xié)同作用[15]，即通過(guò)聲敏劑在靶組織部位聚集后再給予超聲波輻照，產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性作用的單線態(tài)氧，從而殺傷靶細(xì)胞[16]。IR780作為一種聲敏劑，可以用于腫瘤的聲動(dòng)力治療。在本實(shí)驗(yàn)中，Lip-PFP-IR780納米粒與SOSG甲醇溶液混合后經(jīng)LIFU輻照不同時(shí)間，在525nm處的熒光強(qiáng)度隨著LIFU輻照時(shí)間的增加而增強(qiáng)，表明產(chǎn)生的單線態(tài)氧隨著輻照時(shí)間的增加而增多。體外聲動(dòng)力治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明Lip-PFP-IR780納米粒可以用于腫瘤的聲動(dòng)力治療。

總之，本研究成功制備了具有腫瘤靶向性的相變型多功能脂質(zhì)納米粒Lip-PFP-IR780，并證實(shí)其能夠在多模態(tài)顯像引導(dǎo)下進(jìn)行聲動(dòng)力治療。該納米粒的研制為腫瘤靶向性、動(dòng)態(tài)檢測(cè)(顯像)和選擇性治療的進(jìn)一步發(fā)展提供了新的思路。