腫節(jié)風(fēng)黑斑病拮抗真菌zjts7的抑菌作用測(cè)定與鑒定△

宋利沙，蔣妮，2*

(1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023；2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

腫節(jié)風(fēng)為金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)的干燥全草，又名九節(jié)茶、接骨木等，主要分布于我國華南、華東、西南各省區(qū)，在朝鮮、日本、東南亞和印度也有分布[1]。其具有清熱涼血、活血消斑、祛風(fēng)通絡(luò)等功效，用于治療血熱紫斑、紫癜，風(fēng)濕痹痛，跌打損傷等癥，是中國藥典的收錄品種[2]，還是廣西重要的傳統(tǒng)瑤藥品種“七十二風(fēng)”中重要的風(fēng)藥品種之一[3]?，F(xiàn)代藥理和毒理研究表明腫節(jié)風(fēng)還具有抗菌消炎、抑制流感病毒、抗腫瘤和促進(jìn)骨折愈合及鎮(zhèn)痛等多種活性，急性毒性試驗(yàn)結(jié)果屬實(shí)際無毒，具有較好的安全性[4]。以腫節(jié)風(fēng)為主要原料的制劑有草珊瑚含片、腫節(jié)風(fēng)片、腫節(jié)風(fēng)注射液、血康口服液等[5]。腫節(jié)風(fēng)在廣西靖西、融安、東蘭等縣大面積種植過程中，發(fā)生了一種嚴(yán)重影響生長(zhǎng)的葉部病害(黑斑病)，此病害是由半知菌類炭疽屬黑線炭疽菌Colletotrichumdematiu引起的[6]。經(jīng)前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病害平均發(fā)生率達(dá)50%以上，特別在融安的林下套種模式，發(fā)病率高達(dá)65%，嚴(yán)重影響了腫節(jié)風(fēng)藥材的生長(zhǎng)及發(fā)展[6]，因此對(duì)腫節(jié)風(fēng)病害的研究和防治具有重要意義。

目前，腫節(jié)風(fēng)黑斑病的防治以施用化學(xué)農(nóng)藥為主，長(zhǎng)期施用農(nóng)藥病原菌易產(chǎn)生抗藥性和耐藥性，難以根治，且易給生態(tài)環(huán)境帶來農(nóng)藥殘留等負(fù)面影響。利用生防菌防治植物病害，具有對(duì)環(huán)境安全的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為防治植物病害的重要方法之一，是目前國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，也是綠色中藥材發(fā)展的必然趨勢(shì)。至今，利用生防菌防治農(nóng)作物病害的已有較多報(bào)道，而用于防治腫節(jié)風(fēng)黑斑病的生防菌篩選和應(yīng)用尚未見報(bào)道，作者在前期工作中從健康腫節(jié)風(fēng)根系土壤里初步分離篩選到一株對(duì)腫節(jié)風(fēng)黑斑病菌具有抑菌作用的真菌zjts7，本研究進(jìn)一步測(cè)試對(duì)腫節(jié)風(fēng)的黑斑病菌的抑制作用，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，以期為腫節(jié)風(fēng)黑斑病菌的生物防治提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病原菌：腫節(jié)風(fēng)黑斑病菌菌株由廣西藥用植物園植病研究室分離和保存。2017年4月在廣西壯族自治區(qū)藥用植物園科研基地采集自健康腫節(jié)風(fēng)根系土壤，備用。

1.2 拮抗真菌的分離

采用平板稀釋法[7]進(jìn)行健康腫節(jié)風(fēng)根系土壤進(jìn)行分離。

1.3 拮抗真菌zjts7抑菌作用測(cè)定

通過平板對(duì)峙[8]培養(yǎng)，在28 ℃下培養(yǎng)拮抗真菌和病原真菌5～7 d后，分別取直徑5 mm的菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)基平板中，2個(gè)接種點(diǎn)在同一條中軸線上，且相距6 cm，以只接種病原真的平板為對(duì)照，重復(fù)3次。接種4 d后測(cè)其抑菌寬度，計(jì)算其抑菌率[9]。挑取拮抗真菌和病原真菌對(duì)峙培養(yǎng)相交處的菌絲，在光學(xué)顯微鏡下，觀察并記錄拮抗真菌zjts7對(duì)病原真菌菌絲形態(tài)的影響。

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1.4 拮抗真菌zjts7的鑒定

1.3.1 形態(tài)鑒定 拮抗真菌zjts7在PDA平板上培養(yǎng)5～7 d，觀察在顯微鏡下的分生孢子、分生孢子梗及菌絲體等的形態(tài)特征，對(duì)其形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.2 ITS rDNA序列分析和比對(duì) 將培養(yǎng)3 d的拮抗菌株接種到40 mL PDA培養(yǎng)液的三角瓶(100 mL)中，于28 ℃、180 r·min-1，恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后制成菌體懸浮液，離心收集菌體，采用改良的SDS裂解法用DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取真菌基因組DNA。ITS擴(kuò)增引物序列為通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。擴(kuò)增反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，Template(基因組DNA 20～50 ng·μL-1)為0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)為2.5 μL，dNTP(各2.5 mM)為1 μL，酶0.2 μL，引物各0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。熱循環(huán)反應(yīng)程序設(shè)置如下：94 ℃下初始變性4 min，接下來為94 ℃下變性45 sec，55 ℃下引物退火45 sec，72 ℃下延伸60 sec，30個(gè)循環(huán)結(jié)束后在72 ℃下修復(fù)延伸10 min。擴(kuò)增中利用雙蒸水代替DNA模板為空白對(duì)照。用凝膠電泳法檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)果，吸取4 μL PCR產(chǎn)物加入1%(W/V)瓊脂糖凝膠，凝膠置于1×TBE緩沖液(0.9 M Tris-Borate，0.01M EDTA，pH=8.3)中，在110 V下電泳40 min。將擴(kuò)增后的 DNA 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。并且把測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行blast比對(duì)。以ITS相似序列，利用MEGA4.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗真菌zjts7的抑制作用

經(jīng)平板對(duì)峙培養(yǎng)，結(jié)果表明，拮抗真菌zjts7菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)黑斑病菌菌絲具有較明顯的抑制作用，抑制率可達(dá)到81.82%～100%(圖1)。試驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，此木霉菌生長(zhǎng)速度快，很快占領(lǐng)整個(gè)生長(zhǎng)空間，對(duì)峙4 d后將病原真菌包圍，抑制病原菌生長(zhǎng)(圖1-A-B)。挑取拮抗真菌和病原真菌交界處的菌絲，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，腫節(jié)風(fēng)黑斑病菌絲斷裂、畸形、膨大(圖2)。

注：A.四天后的黑斑病菌；B.對(duì)照；C.三天后的黑斑病菌；D.對(duì)照。圖1 zjts7菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)黑斑病生長(zhǎng)抑制效果

注：a.對(duì)照；b.黑斑病菌菌絲膨大、畸形、斷裂。圖2 zjts7菌株處理后腫節(jié)風(fēng)病原菌菌絲形態(tài)

注：a.菌落；b.分生孢子。圖3 zjts7菌株形態(tài)

2.2 拮抗真菌zjts7的鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 菌落初生長(zhǎng)為白色，培養(yǎng)2 d后變綠，分生孢子濃密，均無色素和氣味，暗綠色，菌落背面是綠色(圖3-a)。分生孢子卵圓形或球形，大小為(3～5)μm×(2～4)μm(圖3-b)。主分支呈樹狀，分生孢子梗呈對(duì)生，且無延伸絲；頂端具有短的瓶梗，且基部細(xì)，中間膨大。此菌株的形態(tài)特征和已報(bào)道的棘孢木霉T.asperellum菌株相似[10-11]。

2.2.2 拮抗真菌zjts7的ITS rDNA序列分析 以ITS1、ITS4通用引物對(duì)zjts7菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序。結(jié)果獲得579 bp的rDNA-ITS基因序列，以blast程序?qū)⒕甑男蛄信cGenBank中核酸序列進(jìn)行相似性分析，此菌株rDNA-ITS基因序列與多個(gè)棘孢木霉T.asperellum的序列同源性最高，并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株zjts7與棘孢木霉T.asperellum在同一分支，相似性達(dá)到100%。

根據(jù)菌株zjts7ITS rDNA序列分析，結(jié)合形態(tài)特征，將其鑒定為棘孢木霉T.asperellum。

圖4 以ITS序列構(gòu)建zjts7菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

腫節(jié)風(fēng)黑斑病在南寧全年均有發(fā)生，隨著溫度的升高及降水的的增加，病害發(fā)生嚴(yán)重，防治困難，生產(chǎn)上依然以化學(xué)藥劑防治為主。目前關(guān)于腫節(jié)風(fēng)的黑斑病菌的生物防治研究尚未見報(bào)道。本研究以廣西發(fā)生嚴(yán)重的腫節(jié)風(fēng)黑斑病菌C.dematiu為靶標(biāo)從健康腫節(jié)風(fēng)植株的根系土壤種篩選出一株抑菌作用較強(qiáng)的真菌zjts7，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征將該生防真菌鑒定為棘孢木霉T.asperellum，且此真菌可造成腫節(jié)風(fēng)黑斑病菌的菌絲膨大、畸形和斷裂。

棘孢木霉T.asperellum具有抑菌防病促生等功能，對(duì)多種植物病原菌具有拮抗作用。如抑制芋頭根腐病菌Pythiummyriotylum[12]、人參黑斑菌[13]、 可可黑莢病菌[14]、辣椒疫霉菌[15]、人參銹腐菌[16]、玉米大斑病菌Exserohilumturcicum[10]、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani[17-19]、核盤菌Sclerotiniasclerotiorum[10]、菠蘿黑腐病菌Thielaviopsisparadoxa[20]、鐮刀菌Fusariumsp.及腐霉菌Pythiumuhtimumsp.[10]等。楊帥等[20]研究出棘孢木霉發(fā)酵液降低番茄早疫病菌抗氧化防御酶的活力和GSH含量，增加了MDA的含量，同時(shí)其電導(dǎo)率顯著升高，從而抑制番茄早疫病菌的生長(zhǎng)發(fā)育。覃柳燕等人研究出棘孢木霉PZ6菌株可在一定程度上提高香蕉苗對(duì)枯萎病菌的防御能力，提前施用PZ6菌株可有效阻止病原菌FOC4侵入香蕉苗，延緩植株發(fā)病[21]。棘孢木霉還能促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)[11]，誘導(dǎo)番茄抗灰霉病[18]。楊興堂等人研究出棘孢木霉 ACCC30536 能夠改善黃花蒿的光合能力，促進(jìn)干物質(zhì)的積累，從而提高其葉的產(chǎn)量[22]。姜傳英等人研究出這3個(gè)棘孢木霉菌株均能有效提高山新楊的光合能力，促進(jìn)其生長(zhǎng)；并且，Ta536 菌株對(duì)山新楊幼苗的誘導(dǎo)效果最好[23]。賀字典等人研究出用熒光定量PCR方法檢測(cè)土壤中棘孢木霉數(shù)量具有快速、靈敏度高、可靠性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于檢測(cè)生防菌棘孢木霉施用后的定殖量和生防效果[24]。此外，棘孢木霉對(duì)玉米灰斑病菌Magnaportheoryzae具明顯重寄生作用[10]?？梢?，棘孢木霉是一種具有較大潛力的生防真菌。本研究下一步工作，將對(duì)棘孢木霉zjts7菌株的抑菌機(jī)理，及其對(duì)腫節(jié)風(fēng)病害的防治效果開展研究。