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    多指標(biāo)綜合評(píng)分法結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選心痛寧膠囊醇提工藝△

    2018-12-01 02:58:10劉怡如扎哈布都拉李露王萍孟瑤李玉婷依孜提帕力哈提張麗娟聶繼紅
    中國(guó)現(xiàn)代中藥 2018年11期
    關(guān)鍵詞:乙腈藥材供試

    劉怡,如扎·哈布都拉,李露,王萍,2,孟瑤,李玉婷,依孜提·帕力哈提,張麗娟,聶繼紅,2*

    (1.新疆醫(yī)科大學(xué),新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000)

    心痛寧膠囊是國(guó)醫(yī)大師新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院沈?qū)毞淌谌嗄陙?lái)治療心血管疾病的臨床經(jīng)驗(yàn)方,處方由川芎、當(dāng)歸、厚樸等多味藥材組成,對(duì)治療痰瘀互結(jié)型冠心病療效顯著。方中含有川芎、當(dāng)歸、厚樸等多味藥材,具有擴(kuò)張血管,抗血小板聚集等多重藥理作用[1-5]。原方以傳統(tǒng)湯劑方式服用,將其開發(fā)成膠囊劑則可以克服湯劑服用劑量大、口感差、儲(chǔ)存攜帶不便等不足,最大程度地方便患者。

    Box-Behnken響應(yīng)面法是采用多元二次方程來(lái)擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最佳工藝參數(shù),解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法[6]。本課題通過(guò)多指標(biāo)綜合評(píng)分,運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選心痛寧膠囊醇提工藝,為該課題的后續(xù)研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    高效液相色譜儀(Waters-2695);紫外可見分光光度計(jì)(Cintra 20);SI-234電子天平[丹佛儀器(北京)有限公司];AGL-135電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海有限公司)];SK250LHC超聲清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

    1.2 試藥

    阿魏酸對(duì)照品(批號(hào):110773-201012)、厚樸酚對(duì)照品(批號(hào):110729-200310)和厚樸酚對(duì)照品(批號(hào):0730-200206)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào):100080-200707)(中國(guó)食品藥品檢定研究院);冰醋酸為分析純;甲醇、乙腈為色譜純;水為超純水。

    川芎、當(dāng)歸、厚樸等藥材飲片均購(gòu)自于亳州市中正藥材飲片有限公司,由新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部提供,經(jīng)李永和主任中藥師鑒定,結(jié)果均符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部各項(xiàng)有關(guān)規(guī)定。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 阿魏酸、厚樸酚以及和厚樸酚的含量測(cè)定

    2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱Symmetry C18(150 mm4.6 mm,5m);十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,流動(dòng)相A和B分別為乙腈和1%冰醋酸溶液,按表1所示進(jìn)行梯度洗脫。阿魏酸及厚樸酚類檢測(cè)波長(zhǎng)分別為318、298 nm,體積流量為1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量為10L,柱溫為30 ℃[7-10]。

    表1 梯度洗脫

    2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取適量阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品,加色譜甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.26、0.38 mg·mL-1的混合儲(chǔ)備液。

    2.1.3 供試品溶液的制備 稱取處方中擬采用醇提的藥材,加60%乙醇10倍量,加熱回流提取2次,每次1 h,合并提取液,經(jīng)紗布濾過(guò),濾液離心60 min后取上清液10 mL,蒸干,干膏加適量色譜甲醇溶解,定容到5 mL容量瓶刻度,經(jīng)0.45m的微孔濾膜濾過(guò),即得。

    2.1.4 陰性樣品溶液的制備 稱取處方中除當(dāng)歸、川芎、厚樸以外的中藥材,按2.1.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

    2.1.5 線性范圍考察 精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合儲(chǔ)備液1、2、3、4 mL用色譜甲醇定容于5 mL量瓶中,得到不同濃度的溶液,同時(shí)取混合儲(chǔ)備液,在2.1.1項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),以濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程,結(jié)果見下表2。

    表2 回歸方程和相關(guān)系數(shù)

    2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液,按2.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定得阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為1.70%、0.77%、0.23%,表明儀器的精密度良好。

    2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按處方比例,稱取6份同一批醇提藥材,按2.1.3項(xiàng)下制備供試品溶液,在2.1.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL,測(cè)定得阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為0.63%、1.06%、1.09%,表明該方法重復(fù)性良好。

    2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液,在2.1.1項(xiàng)色譜條件下分別于制備后的第0、6、8、12、24、48 h進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)樣10 μL后得到阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為0.70%、1.13%、1.58%,結(jié)果表明,供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的待測(cè)溶液6份,分別加入阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品0.20、1.34、1.27 mg,按2.1.3項(xiàng)下制備供試品溶液,按2.1.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣10 μL測(cè)定,結(jié)果平均加樣回收收率分別為95.46%、103.92%、103.13%,RSD分別為2.24%、2.82%、0.57%,結(jié)果表明本品的加樣回收率良好。

    注:A.混合對(duì)照品溶液(318 nm);B.混合對(duì)照品溶液(298 nm);C.供試品溶液(318 nm);D.供試品溶液(298 nm);E.缺阿魏酸陰性樣品(318 nm);F.缺厚樸酚及和厚樸酚陰性樣品(298 nm);1.阿魏酸;2.和厚樸酚;3.厚樸酚。圖1 心痛寧膠囊中阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚的HPLC圖

    2.2 總黃酮的含量測(cè)定

    2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品適量,加無(wú)水乙醇充分溶解,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為2.001 mg·mL-1)。

    2.2.2 供試品溶液的制備 按擬定的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行提取,備用。

    2.2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定 精密移取適量2.2.1項(xiàng)蘆丁對(duì)照品,加入60%乙醇溶液6 mL,5%亞硝酸鈉溶液1 mL,混勻靜置6 min后再加10%硝酸溶液1 mL,混勻靜置6 min,最后加入4.3%氫氧化鈉溶液10 mL,混勻靜置15 min后測(cè)定,以相同的方法制備空白液,在400~700 nm[11-13]范圍內(nèi)掃描。結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液在500.8 nm處均有最大吸收,見圖2。

    圖2 蘆丁對(duì)照品和樣品的紫外-可見光譜

    2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 mL,在500.8 nm處測(cè)定上述方法顯色后的不同濃度儲(chǔ)備液的吸光度(A)值。以吸光度為縱坐標(biāo),以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)得到回歸方程:Y=1.418X-0.009 7(r=0.999 4)。表明蘆丁在0.3~1.1 mg范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

    2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.5 mL蘆丁對(duì)照品溶液,在500.8 nm處連續(xù)測(cè)定6次上述方法顯色后吸光度,得到RSD值為0.50,表明儀器精密度良好。

    2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按擬定的實(shí)驗(yàn)方案平行制備6份供試品溶液,在500.8 nm處測(cè)定按2.2.1項(xiàng)顯色后的吸光度,得到RSD值為0.75%,表明該方法重復(fù)性較好。

    2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取0.5 mL按上述方法制備的供試品溶液,分別于制備后的第0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定按2.2.1項(xiàng)顯色后的吸光度,得到RSD值為1.97%,結(jié)果表明供試品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下已知濃度的供試品溶液,取樣品與對(duì)照品含量為1∶1平行制備待測(cè)溶液6份,在2.2.1項(xiàng)下測(cè)定其吸光度,結(jié)果得到平均加樣回收率為97.76%,RSD=0.37%,結(jié)果表明本品的加樣回收率良好。

    2.3 浸膏得率的測(cè)定

    將50 mL供試液精密吸取于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,蒸干后放入105 ℃烘箱內(nèi)干燥3 h,在干燥器中冷卻后迅速精密稱定重量,計(jì)算其浸膏得率[14]。

    (1)

    2.4 單因素試驗(yàn)

    分別對(duì)提取次數(shù)、提取時(shí)間、加醇濃度、加醇倍量進(jìn)行單因素試驗(yàn),根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)確定Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平范圍[15-17]。

    2.4.1 提取時(shí)間初步考察 按擬定處方量稱取藥材,將加醇倍量固定為10倍,加醇濃度固定為60%,提取次數(shù)固定為1次,考察提取時(shí)間分別為30、60、90、120 min時(shí)的綜合評(píng)分,結(jié)果綜合評(píng)分在30~60 min時(shí)呈遞增趨勢(shì),60~90 min時(shí)呈遞減趨勢(shì),故最佳提取時(shí)間確定60 min。

    2.4.2 加醇濃度初步考察 按擬定處方量稱取藥材,將加醇倍量固定為10倍,提取時(shí)間固定為1 h,提取次數(shù)固定為1次,考察加醇濃度分別為50%、60%、70%、80%時(shí)的綜合評(píng)分,結(jié)果綜合評(píng)分在50%~60%呈遞增趨勢(shì),60%~70%呈降低趨勢(shì),故最佳加醇濃度定為60%。

    2.4.3 加醇倍量初步考察 按擬定處方量稱取藥材,將加醇濃度固定為60%,提取時(shí)間固定為1 h,提取次數(shù)固定為1次,考察加醇倍量分別為6倍、8倍、10倍、12倍時(shí)的綜合評(píng)分,結(jié)果綜合評(píng)分在8倍~10倍呈遞增趨勢(shì),10倍~12倍呈下降趨勢(shì),故最佳加醇倍量定為10倍。

    2.4.4 提取次數(shù)的初步考察 按擬定處方量稱取藥材,將加醇倍量固定為10倍,加醇濃度固定為60%,提取時(shí)間固定為1 h,分別考察提取1、2、3次的綜合評(píng)分,最終綜合評(píng)分分別為59.16%、94.10%、96.45%,由于提取2次和提取3次的綜合評(píng)分結(jié)果差別不大,從工業(yè)化大生產(chǎn)節(jié)約成本的角度考慮,提取次數(shù)確定為2次。

    2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

    2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,按擬定處方量稱取醇提藥材,根據(jù)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)醇提工藝的影響,確定綜合評(píng)分=阿魏酸×0.4+總厚樸酚×0.2+總黃酮×0.2+浸膏得率×0.2(總厚樸酚=厚樸酚×0.5+和厚樸酚×0.5),提取次數(shù)固定為1次,以提取時(shí)間(X1)、加醇濃度(X2)、加醇倍量(X3)作為考察指標(biāo)進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)[18-19],因素及水平見表3。

    表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平

    采用Design-Expert 軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案,對(duì)加醇倍量、加醇濃度、提取時(shí)間進(jìn)行研究[20-21],結(jié)果見表4。

    表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

    2.5.2 模型擬合 利用方差分析對(duì)各因素進(jìn)行多元二次回歸,得到的回歸方程Y=90.46+11.92X1+2.81X2+3.77X3-3.55X1X2-2.99X2X3-1.71X1X3-13.41X12-7.29X22-8.04X32,由表5可知,X1、X2、X12、X22、X32具有顯著影響,其影響程度為X2>X1>X3;失逆項(xiàng)P>0.05,說(shuō)明失擬不顯著,因此本回歸方程能較好地分析與預(yù)測(cè)本研究的醇提工藝。根據(jù)回歸分析結(jié)果繪制三維響應(yīng)面圖,見圖3~4。

    表5 回歸模型的方差分析

    圖3 各因素對(duì)綜合評(píng)分的三維響應(yīng)面圖

    圖4 提取工藝對(duì)各因素之間的等高線圖

    2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析,最佳醇提工藝:加入60.53%的乙醇10.36倍,提取72 min。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)所需,將最佳醇提工藝確定為60%的乙醇10倍量,提取60 min。按照最佳醇提工藝,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),其綜合評(píng)分分別為96.36、98.04、95.80,平均綜合評(píng)分為96.73(RSD為1.21%),與預(yù)測(cè)值(93.41)相似,說(shuō)明次二項(xiàng)式方程的適用性良好。優(yōu)選的提取工藝合理,可行。

    3 討論

    參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》及文獻(xiàn)方法測(cè)定阿魏酸及總厚樸酚含量時(shí),考察了乙腈、甲醇、冰醋酸、磷酸等多種流動(dòng)相體系,發(fā)現(xiàn)乙腈-冰醋酸體系對(duì)于阿魏酸及總厚樸酚體系峰型較好,保留時(shí)間適宜??疾毂姿釙r(shí)發(fā)現(xiàn),1%冰醋酸使各色譜峰的分離度及峰型效果最好,為最優(yōu)濃度,調(diào)整乙腈-1%冰醋酸溶液不同配比,最后選擇流動(dòng)相(0~17 min,12%乙腈;17~18 min,12%~54%乙腈;18~35 min,54%乙腈)。

    采用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮時(shí),在1 h內(nèi)顯色結(jié)果穩(wěn)定,超過(guò)1 h,供試品溶液則出現(xiàn)絡(luò)合物沉淀,所以應(yīng)在1 h內(nèi)完成顯色測(cè)定。

    在研究初始階段,首先采用文獻(xiàn)研究法查閱相關(guān)文獻(xiàn),最終確定了處方中各味藥材有效成分的理化性質(zhì)及藥理作用,確定其中部分藥材使用醇提工藝,故采用多指標(biāo)綜合評(píng)分結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法,以阿魏酸、厚樸酚、和厚樸酚、總黃酮的含量及浸膏得率作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo),通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)研究獲取了更加優(yōu)化的心痛寧膠囊醇提工藝。此結(jié)果為工業(yè)化大生產(chǎn)奠定了研究基礎(chǔ),為以后的科研創(chuàng)新提供了思路。

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