鮮蛹蟲草與干蛹蟲草抗氧化活性和活性物質(zhì)差異研究*

劉曉紅，宋 潔，欒宏偉，劉興寶，李 娟，朱雙杰，張 昕，賈成發(fā)，王淑君，王 鵬

（1.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118003；2.丹東中科北和科技有限公司，遼寧 丹東 118003；3.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239012）

抗氧化劑在預(yù)防活性氧（reactive oxygen species，ROS） 引起的疾病中發(fā)揮著重要作用[1-2]。研究表明，ROS可引發(fā)機(jī)體退化或病理性事件，如癌癥、哮喘和衰老的發(fā)生[3-5]。ROS過量是由于體內(nèi)自由基產(chǎn)生和抗氧化防御體系之間的不平衡造成的，抗氧化劑在改善免疫功能、減少氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用。雖然生物體內(nèi)存在多種內(nèi)源抗氧化劑，主要有酶和非酶的形式，但仍然需要不斷地從飲食或補(bǔ)充劑中提取一定數(shù)量的外源抗氧化劑，以維持活性氧代謝的平衡，特別是在活性氧過度產(chǎn)生的情況下。研究表明，天然食材中獲得的抗氧化劑可以降低機(jī)體退化或病理性事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.ex Fr.）Link]為子囊菌門 （Ascomycota） 肉座目 （Hypocreales） 麥角菌科 （Clavicipitaceae） 蟲草屬 （Cordyceps） 的模式種[6]。近年來，由于蛹蟲草具有多種藥用價(jià)值，受到研究者越來越多的關(guān)注[7]。在中國(guó)和東南亞市場(chǎng)蛹蟲草已作為藥物原料和保健食品銷售[8-9]。蛹蟲草的藥理功效包括免疫應(yīng)答消炎、抗菌素、抗心律失常等[10-11]?，F(xiàn)代藥物化學(xué)研究表明，蛹蟲草含有腺苷、蟲草素、蟲草酸、蛋白質(zhì)、多糖、超氧化物歧化酶等活性成分[12-15]，這些活性成分具有較強(qiáng)的抗氧化活性[16-19]。然而，以上研究均針對(duì)干蛹蟲草，關(guān)于新鮮蛹蟲草抗氧化性的研究甚少。

研究表明，熱處理可以改變新鮮藥材的化學(xué)組成、含量和活性物的結(jié)構(gòu)[20-21]，導(dǎo)致鮮中藥材和干中藥材從化學(xué)成分到藥效都有很大的不同[22-23]。大量研究表明，鮮藥材具有許多獨(dú)特的臨床療效，在臨床疾病、急危重癥和創(chuàng)傷治療方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[24-25]。迄今，鮮見有關(guān)鮮蛹蟲草的研究，也未見關(guān)于鮮蛹蟲草和干蛹蟲草抗氧化活性差異的報(bào)道。因此，本研究擬對(duì)鮮蛹蟲草和干蛹蟲草的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為蛹蟲草資源的精深加工提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

樣品：鮮蛹蟲草（No.JS-003） 由遼東生物產(chǎn)業(yè)研究所提供；干蛹蟲草：鮮蛹蟲草放置于50℃烘干箱內(nèi)烘干48 h，然后稱重，7.5 g鮮品蛹蟲草可以獲得1.0 g干品蛹蟲草。

樣品處理：鮮蛹蟲草37.5 g磨碎加入37 mL蒸餾水，干蛹蟲草5.0 g加入50 mL蒸餾水混合，分別用高速勻漿器4 000 r·min-1勻漿10 min，勻漿液定容至100 mL，30℃超聲提取30 min，4層紗布過濾，濾液經(jīng)冷凍干燥，獲得鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品，備用。

1.2 方法

1.2.1 DPPH自由基清除活力測(cè)定

利用Ozen.T等方法[26]，測(cè)定DPPH自由基清除活力。鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品分別與DPPH甲醇溶液混合，室溫、放置于暗室30 min，用分光光度計(jì)于517 nm處測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光度值。

1.2.2 銅離子還原能力的測(cè)定

采用Apak.R等方法[27]，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品分別與硫酸銅、新亞銅試劑和蒸餾水混合，室溫放置30 min，用分光光度計(jì)于450 nm處測(cè)定混合物的吸光度值。

1.2.3 羥基自由基清除活力測(cè)定

根據(jù)Sroka.Z和Cisowski.W方法[28]，略加修改，0.02 mol·L-1硫酸亞鐵 100 μL，0.15%雙氧水 45 μL，8 mmol·L-1水楊酸1 mL和蒸餾水4 mL按順序依次混合，將1 mL鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品分別添加到上述混合液中，37℃放置30 min，用分光光度計(jì)于593 nm處測(cè)定有色產(chǎn)物的吸光度值。

1.2.4 總酚提取與含量測(cè)定

總酚提取：利用Brenes.M和Savarese.M等的方法[29-30]，略加修改，鮮蛹蟲草樣品與甲醇/水（80∶20） 的溶液混合，室溫放置30 min，用Whatman過濾器將混合液過濾，除去不溶性顆粒，重復(fù)提取3次，收集合并濾液，40℃下真空蒸發(fā)，除去濾液中的甲醇，加入正已烷洗滌濾液3次，去除油脂類物質(zhì)，再加入乙酸乙酯萃取出酚類物質(zhì)，40℃下真空蒸發(fā)，干燥后的殘余物溶解在2 mL甲醇中，于4℃貯藏備用。

總酚測(cè)定：采用Folin-Ciocalteu法，略加改進(jìn)，測(cè)定樣品的總酚含量。分別取鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品0.1 mL與2.5 mL蒸餾水混合，加入0.25 mL Folin-Ciocalteu試劑，再加入2%Na2CO3溶液2.5 mL，暗環(huán)境下，室溫放置120 min。用分光光度計(jì)于765 nm處測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光度值。

1.2.5 總黃酮提取和含量測(cè)定

總黃酮提?。豪肧un L.J.等的方法[31]，略加修改。鮮蛹蟲草樣品浸泡在70%乙醇溶液中2.5 h，其中液料比 （w·v-）1為1∶10，55℃超聲提取45 min，提取樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。收集濾液，重復(fù)提取2次。石油醚和乙酸乙酯脫脂，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，真空濃縮干燥，獲得樣品粗提取物。

總黃酮含量測(cè)定：采用分光光度法測(cè)定黃酮類物質(zhì)的含量。鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品各1 mL（4 mg·mL-1），分別加入100 μL濃度為1%的2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯溶液混合，室溫放置20 min。用分光光度計(jì)于404 nm處測(cè)定反應(yīng)樣品的吸光度值。

1.2.6 多糖提取和含量測(cè)定

鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品各25 g，250 mL乙醚索氏提取脫脂，加入250 mL80%乙醇混合24 h。過濾，收集濾液，用500 mL蒸餾水超聲重提殘留物2 h。然后合并濾液，蒸發(fā)濃縮至體積為100 mL，濃縮后的濾液與100 mL氯仿/異戊醇（4∶1） 混合進(jìn)行脫蛋白處理。再過濾，濾液與4倍體積無水乙醇混合24 h，沉淀出的物質(zhì)即為多糖化合物。離心收集沉淀，丙酮洗滌。最終鮮蛹蟲草樣品得到多糖1.44 g，干蛹蟲草樣品得到多糖1.06 g。

1.2.7 蟲草素和腺苷含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法[32]，測(cè)定鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品中蟲草素和腺苷含量。C18柱（Pinnaclell 5 μm，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相中磷酸氫二鈉緩沖液（pH6.0）：甲醇為 85∶15，流速 1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，加樣量20 μL，用Waters Empower軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.8 超氧化物歧化酶純化和活性測(cè)定

超氧化物歧化酶純化：參照Wang Z.S.等的方法[33]，分別取50 g鮮蛹蟲草和干蛹蟲草凍干粉，加入 250 mL 20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液 （pH8.8）中，其中含有1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟，均質(zhì)離心（15 000 r·min-1）15 min。均質(zhì)粗提液加硫酸銨飽和溶液中攪拌1.5 h，15 000 r·min-1離心15 min。取上清液，加到90%硫酸銨溶液中攪拌、離心，上清液溶入20 mmol·L-1Tris-HCL緩沖液 （pH8.8） 中，再用 20 mmol·L-1Tris-HCL緩沖液 （pH8.8） 透析 2次，過夜。透析所得蛋白在DEAE-FF陰離子交換層析柱（3 cm×12 cm） 上進(jìn)行純化，平衡液為 20 mmol·L-1Tris-HCL緩沖液（pH8.8），采用冷凍干燥法濃縮具有高超氧化物歧化酶活性的層析液。

超氧化物歧化酶活性測(cè)定：采用對(duì)鄰苯三酚氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶活性[34]。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用Braford法測(cè)定蛋白質(zhì)[35]。

1.2.9 總抗氧化活性測(cè)定

采用Trolox等效抗氧化活性（trolox equivalent and oxidant capacity，TEAC） 方法[36]，測(cè)定樣品總抗氧化活性，2,2’-聯(lián)氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）（100 μmol·L-1），雙氧水（50 μmol·L-1）和過氧化物酶（4.4 U·mL-1）混合產(chǎn)生ABTS·+，1 mL ABTS·+分別加入到鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品和奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox） 標(biāo)準(zhǔn)品中，室溫放置10 min，分光光度計(jì)于734 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，估算TEAC值。

2 結(jié)果分析

2.1 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對(duì)DPPH自由基清除能力

以生育酚作為對(duì)照，研究鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對(duì)DPPH自由基清除能力的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris on DPPH radical

由圖1可知，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品濃度在0～4.0 mg·mL-1時(shí)，隨著濃度的升高，對(duì)DPPH自由基清除能力不斷增強(qiáng)，當(dāng)樣品濃度為4.0 mg·mL-1時(shí)，鮮蛹蟲草樣品DPPH自由基的清除能力增強(qiáng)到86.63%，干蛹蟲草樣品達(dá)到61.36%。顯然鮮蛹蟲草樣品對(duì)DPPH自由基清除能力明顯強(qiáng)于干蛹蟲草樣品。樣品濃度在 4.0 mg·mL-1～8.0 mg·mL-1時(shí)，鮮蛹蟲草樣品清除能力超過85%，高于相同濃度下生育酚對(duì)照樣品的清除能力。

2.2 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對(duì)銅離子還原的抑制作用

以生育酚作為對(duì)照，研究鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對(duì)銅離子還原的抑制作用，結(jié)果見圖2。

圖2 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對(duì)銅離子還原的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of fresh Cordyceps militaris and dryCordyceps militaris on copper ion reduction

由圖2可以看出，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品濃度在0～4.0 mg·mL-1時(shí)，對(duì)銅離子還原的抑制作用具有濃度依賴性。在 1.0 mg·mL-1～8.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，鮮蛹蟲草對(duì)銅離子還原的抑制作用明顯強(qiáng)于干蛹蟲草。濃度在 0.01 mg·mL-1～1.0 mg·mL-1時(shí)，鮮蛹蟲草樣品對(duì)銅離子還原的抑制作用弱于對(duì)照生育酚。鮮蛹蟲草濃度處于 2.0 mg·mL-1～8.0 mg·mL-1高濃度時(shí)，對(duì)銅離子還原的抑制作用強(qiáng)于對(duì)照生育酚。

2.3 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對(duì)羥基自由基的清除能力

以生育酚作為對(duì)照，研究鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對(duì)羥基自由基的清除能力，結(jié)果見圖3。

圖3 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.3 Scavenging activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris on hydroxyl radical.

由圖3可知，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對(duì)羥基自由基均具有較強(qiáng)的清除能力，樣品濃度在0～8.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，兩者對(duì)羥基自由基清除能力具有濃度依賴性，但鮮蛹蟲草樣品對(duì)羥基自由基清除能力顯著高于干蛹蟲草樣品（P＜0.05）。當(dāng)樣品濃度為2 mg·mL-1時(shí)，只有鮮蛹蟲草清除能力高于對(duì)照生育酚，在 4.0 mg·mL-1～8.0 mg·mL-1時(shí)，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品清除能力均明顯強(qiáng)于對(duì)照生育酚。綜上所述，鮮蛹蟲草清除能力強(qiáng)于干蛹蟲草。

2.4 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草主要活性成分含量和抗氧化活性比較

鮮蛹蟲草和干蛹蟲草主要活性成分含量見表1。

由表1可知，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品在多糖、總酚、總黃酮含量方面均存在顯著性差異（P＜0.01），這三種活性成分在鮮蛹蟲草樣品中的含量均高于干蛹蟲草樣品，并且鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品中活性成分含量排序?yàn)椋傸S酮含量＞總酚含量＞多糖含量，腺苷和蟲草素含量無明顯差異。

表1 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草主要活性成分含量及其抗氧化活性比較Tab.1 Compare of the main active components content and antioxidant activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris

由表1還可以看出，干蛹蟲草樣品抗氧化活性顯著低于鮮蛹蟲草樣品（P＜0.01）。超氧化物歧化酶純化過程有3個(gè)階段，獲得的3種提取液分別為粗提液、硫酸銨沉淀物和陰離子交換層析液，檢測(cè)3種提取液中總蛋白含量和超氧化物歧化酶的活性結(jié)果，見表2。

表2 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草中超氧化物歧化酶含量及活性比較Tab.2 Compare of the superoxide dismutase content and activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris

由表2可以看出，鮮蛹蟲草中超氧化物歧化酶的含量與總活力均高于干蛹蟲草，且超氧化物歧化酶純化提取物中，鮮蛹蟲草所得粗提液和硫酸銨沉淀物比活度是干蛹蟲草的1.3倍（P＜0.01），鮮蛹蟲草中陰離子交換層析液比活度是干蛹蟲草的1.8倍。

2.5 鮮蛹蟲草中主要活性成分抗氧化活性

鮮蛹蟲草中超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃酮的抗氧化活性，見圖4。

圖4 鮮蛹蟲草中超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃酮的抗氧化活性Fig.4 Total antioxidant activity of the superoxide dismutase,polysaccharide,polyphenol and total flavonoids of fresh Cordyceps militaris

由圖4可知，樣品濃度在0～8.0 mg·mL-1之間，蛹蟲草的超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃酮的抗氧化活性隨著濃度的升高而增大，這說明鮮蛹蟲草中的超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃銅具有較強(qiáng)的抗氧化活性。鮮蛹蟲草中腺苷和蟲草素總抗氧化性活性見表3。

由表3可以看出，根據(jù)不同濃度組合，分別測(cè)定鮮蛹蟲草中多糖和腺苷組合、多糖和蟲草素組合后的TEAC值，所得結(jié)果與鮮蛹蟲草多糖抗氧化活性TEAC值相比無顯著差異。鮮蛹蟲草樣品中多糖和腺苷組合、多糖和蟲草素組合的清除能力與鮮蛹蟲草樣品多糖幾乎一樣，表明腺苷和蟲草素這兩種生物活性成分不能促進(jìn)蛹蟲草的抗氧化活性。

表3 鮮蛹蟲草中腺苷和蟲草素總抗氧化性活性Tab.3 Total antioxidant activity of adenosine,cordycepin of fresh Cordyceps militaris

3 討論

生物系統(tǒng)中抗氧化系統(tǒng)很復(fù)雜[37]，采用不同方法分析抗氧化活性可得不同的反應(yīng)特性和機(jī)理，在實(shí)際研究中，至少使用2種互補(bǔ)的方法來評(píng)價(jià)體外抗氧化能力[38]。DPPH自由基是穩(wěn)定的自由基，DPPH自由基清除能力檢測(cè)法是1種評(píng)價(jià)抗氧化活性的快速方法[39]。銅離子對(duì)機(jī)體內(nèi)的硫醇類抗氧化劑如谷胱甘肽具有反應(yīng)性[40]，由于體內(nèi)廣泛存在羥基自由基[38，41]，故羥基自由基清除能力的檢測(cè)被廣泛用于抗氧化活性的測(cè)定。此外，在測(cè)定特定物質(zhì)的抗氧化能力時(shí)，Trolox等效抗氧化活性檢測(cè)也被常用于評(píng)價(jià)活性物質(zhì)的抗氧化能力。因此我們選擇了這四種方法來評(píng)價(jià)鮮蛹蟲草和干蛹蟲草的抗氧化能力。結(jié)果表明，4種方法均能較準(zhǔn)確地反映鮮蛹蟲草和干蛹蟲草抗氧化活性。

目前，在中國(guó)、韓國(guó)和東南亞地區(qū)，蛹蟲草被作為醫(yī)藥材料和保健食品出售[9]。研究表明，蛹蟲草具有顯著的治療效果，如免疫刺激[17]。已有研究表明，蛹蟲草提取物能提高小鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶的酶活性，降低H22型小鼠肝臟中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的含量。近年來，大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，蛹蟲草子實(shí)體水提取物對(duì)寄主具有抗氧化活性[42]。蛹蟲草子實(shí)體水提液顯示了對(duì)DPPH、羥基自由基明顯的清除能力和對(duì)亞鐵離子的螯合作用，對(duì)亞油酸脂質(zhì)過氧化和還原能力也有抑制作用[16]。本研究顯示，干蛹蟲草具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力、銅離子還原能力和羥基自由基清除能力，且均呈劑量依賴性，但其抗氧化活性顯著低于鮮蛹蟲草，且鮮蛹蟲草濃度在 4.0 mg·mL-1～8.0 mg·mL-1時(shí)，抗氧化活性明顯高于生育酚。所以鮮蛹蟲草是1種天然的抗氧化劑資源。

抗氧化能力與活性成分的含量有關(guān)。蛹蟲草的主要成分為超氧化物歧化酶、蟲草素、腺苷和蟲草多糖[13]。這些主要成分中，除了蛹蟲草多糖外，其他活性成分的抗氧化活性僅有少量報(bào)道[18]。另外，已有報(bào)道表明總酚和總黃酮具有良好的抗氧化能力。為進(jìn)一步探討活性成分在鮮蛹蟲草和干蛹蟲草抗氧化活性中的作用，本研究測(cè)定了鮮蛹蟲草和干蛹蟲草中主要活性成分，包括超氧化物歧化酶、多糖、腺苷、蟲草素、總酚和總黃酮含量。本研究顯示，除活性成分腺苷和蟲草素外，鮮蛹蟲草中其他活性成分均明顯高于干蛹蟲草，導(dǎo)致這種結(jié)果可能有2個(gè)因素，一是熱處理使部分活性成分裂解，另一個(gè)是由于酶的作用使熱敏成分分解[20]。

此外，為闡明蛹蟲草主要活性成分對(duì)抗氧化活性的影響，本試驗(yàn)從蛹蟲草中分別提取出多糖、超氧化物歧化酶、總酚和總黃酮，并采用了Trolox等效抗氧化活性檢測(cè)法評(píng)價(jià)了其抗氧化活性。Trolox等效抗氧化活性綜合分析方法優(yōu)于多個(gè)測(cè)定分析的方法，能有效評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。由于蟲草多糖已被證明具有顯著的抗氧化活性，本研究以蛹蟲草多糖為對(duì)照。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析顯示，腺苷和蟲草素不能促進(jìn)蛹蟲草抗氧化活性。此結(jié)果與Yu和Yang[17]結(jié)論相一致。關(guān)于鮮蛹蟲草和干蛹蟲草超氧化物歧化酶抗氧化活性鮮有報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，鮮蛹蟲草超氧化物歧化酶抗氧化活性顯著高于干蛹蟲草。此外，鮮蛹蟲草提取物中總酚和總黃酮含量分別為（87.56±0.04） mg·g-1和 （182.24±0.07） mg·g-1，干蛹蟲草為 （58.34±0.03） mg·g-1和（125.86±0.03）mg·g-1，均表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性，這與已報(bào)道結(jié)論不一致，先前有研究顯示蛹蟲草中總酚和總黃酮的含量分別為 0.598 μg·mL-1和 60.2 μg·mL-1，這種相對(duì)含量較低的活性物質(zhì)對(duì)蛹蟲草的抗氧化活性貢獻(xiàn)率是很低的[17]。

綜上所述，本研究表明，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草均具有抗氧化活性，而且鮮蛹蟲草的抗氧化活性優(yōu)于干蛹蟲草。此外，鮮蛹蟲草中多糖、超氧化物歧化酶、總酚和總黃酮等活性成分的含量均高于其在干蛹蟲草中的含量。鮮蛹蟲草所含的多糖、超氧化物歧化酶、總酚和總黃酮等成分具有顯著的抗氧化活性。這些結(jié)果表明，鮮蛹蟲草是良好的抗氧化劑資源，有待進(jìn)一步開發(fā)利用。