秀珍菇種質(zhì)遺傳多樣性分析與優(yōu)質(zhì)菌株篩選*

陸 娜，王偉科，宋吉玲，袁衛(wèi)東，閆 靜

（杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024）

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius），原產(chǎn)于印度，又名印度鮑魚菇，隸屬于擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目 （Agaricales） 白蘑科 （Tricholomataceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus），屬于平菇大類中的肺型側(cè)耳，原系熱帶和亞熱帶的1種野生食用菌，經(jīng)馴化育種后開始人工栽培[1]，秀珍菇是近年來從眾多食用菌品種中脫穎而出的最受消費者喜愛的優(yōu)良食用菌品種之一[2]。隨著秀珍菇設(shè)施栽培模式的不斷更新和改進(jìn)，由傳統(tǒng)春秋兩季栽培模式逐漸向栽培效率和收益更高的夏季設(shè)施栽培模式發(fā)展，然而適合高效設(shè)施栽培的環(huán)境專用型品種卻未能得到及時有效地更新同步，可供企業(yè)、菇農(nóng)選擇的栽培品種較少，同時已應(yīng)用的品種經(jīng)常出現(xiàn)異種同名或同種異名現(xiàn)象，因此造成秀珍菇品種混亂[3]，加上秀珍菇設(shè)施栽培生產(chǎn)中常出現(xiàn)菇體色澤不佳、菇蓋薄、易破碎、出菇整齊度不高等問題，目前急切需要色灰、蓋厚、不易碎、出菇整齊度高，適應(yīng)反季節(jié)設(shè)施栽培模式的優(yōu)質(zhì)秀珍菇品種，以滿足市場不斷提高的質(zhì)量要求，為促進(jìn)杭州市秀珍菇產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)步發(fā)展提供品種和技術(shù)支撐。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以輔助提供有效的基因組信息，在側(cè)耳的分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究中具有可行性，能快速確定各栽培菌株之間的遺傳關(guān)系，其可以產(chǎn)生豐富的多態(tài)位點，更好地揭示了種下分類群間的關(guān)系[4]。因此，采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)并結(jié)合秀珍菇栽培特性進(jìn)行種質(zhì)遺傳多樣性分析，旨在為篩選出適合高效設(shè)施栽培的秀珍菇菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和來源

供試的36個秀珍菇菌株均由杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所菌種站從秀珍菇主產(chǎn)區(qū)收集，經(jīng)過擴繁培養(yǎng)，采用同一菌齡的菌株開展試驗后所得，詳見表1。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

菌絲體培養(yǎng)：從PDA平板上培養(yǎng)3 d的菌落邊緣取2 mm×2 mm的菌絲塊，接種于100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，25℃淺層靜置培養(yǎng)10 d，收集菌絲，無菌水漂洗2次后，無菌濾紙吸干水分，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

母種培養(yǎng)：采用PDA培養(yǎng)基，在無菌條件下進(jìn)行接種后放置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d左右，于-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

原種培養(yǎng)：采用棉籽殼78%、麩皮20%、石灰1%、石膏1%，含水量為65%的培養(yǎng)基，高壓滅菌后在無菌條件下接種，放置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

栽培種培養(yǎng)：采用棉籽殼39%、木屑39%、麩皮20%、石灰2%，含水量為63%的培養(yǎng)基，高壓滅菌后在無菌條件下接種，放置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 秀珍菇基因組DNA的提取和濃度測定

供試的36個秀珍菇菌株的DNA提取方法參照新型快速植物基因組DNA提取試劑（百泰克生物技術(shù)有限公司BioTeke，北京） 的說明，提取后測定DNA濃度，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ISSR引物選擇

從美國哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條ISSR通用引物中篩選出18條ISSR引物，具體見表2，然后委托杭州擎科生物公司進(jìn)行合成。

1.5 ISSR多態(tài)性分析

ISSR-PCR的擴增體系為：2×TSINGKE PCR Maste（rblue）預(yù)混體系10 μL，ISSR引物1 μL，DNA模板（20 ng·μL-1）3 L，加 dd H2O 補齊到 20 μL。

ISSR的PCR擴增反應(yīng)在TC-XP型（博日科技有限公司Bioer，杭州）上進(jìn)行。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s，適當(dāng)退火溫度退火30 s（退火溫度視引物而定，詳見表2），72℃延伸90 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min，于16℃保存。

PCR擴增后產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠（EB染色）進(jìn)行電泳檢測，150 V下電泳30 min。擴增圖譜的攝取采用Chemi Doc XRS imaging system（Bio-Rad，Hercules，CA，USA） 進(jìn)行拍照，有ISSR帶譜的統(tǒng)計為1，無ISSR帶譜的統(tǒng)計為0，構(gòu)建初始數(shù)據(jù)矩陣，采用NTSYSpc2.1軟件計算遺傳相關(guān)系數(shù)，非加權(quán)組平均法（UPGMA，unweighted pair-group method with arithmetic means） 進(jìn)行聚類分析，得出聚類圖譜。

表1 供試秀珍菇菌株Tab.1 Tested strains of Pleurotus geesteranus

表2 ISSR引物名稱及退火溫度Tab.2 The name of ISSR primers and the annealing temperature

1.6 出菇試驗

出菇試驗在秀珍菇設(shè)施化栽培大棚中進(jìn)行，每個菌株挑取發(fā)菌完好的菌袋150袋，每50袋1次重復(fù)，設(shè)3次重復(fù)，每袋干料重650 g。以優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)為主要指標(biāo)進(jìn)行篩選，記錄前3潮產(chǎn)量和各菌株農(nóng)藝性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性分析與菌株聚類

ISSR多態(tài)性分析與菌株聚類試驗，結(jié)果見圖1。

圖1 引物UBC827的PCR擴增圖譜Fig.1 PCR amplification map of primer UBC827

由圖1可以看出，利用ISSR引物對36個秀珍菇菌株的基因組進(jìn)行PCR擴增，ISSR-PCR擴增圖譜顯示，其中18條ISSR引物在36個秀珍菇菌株間擴增出146條清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性片段，片段長度在 500 bp～2 000 bp。

2.2 DNA擴增圖譜聚類分析

基于ISSR擴增圖譜進(jìn)行36個秀珍菇菌株DNA擴增圖譜聚類分析，結(jié)果見圖2。

圖2 基于ISSR分析的秀珍菇菌株聚類樹狀圖Fig.2 Cluster dendrogram of Pleurotus geesteranus strains based on ISSR analysis

由圖2可以看出，不同來源秀珍菇菌株遺傳相似系數(shù)在0.66～1.00，當(dāng)相似系數(shù)為0.66時，其可被分為2個類群；當(dāng)相似系數(shù)為0.82時，被分為4個類群；而當(dāng)相似系數(shù)為1.00時，被分為7個類群。其中秀珍菇菌株X18和X27聚為1組；菌株X15、X38、X28、X29聚為1組；菌株X13、X31、X12、X35各為單獨1組；其余26個秀珍菇菌株聚為1組，相似系數(shù)為1.00，很有可能為同一個菌株。36個秀珍菇菌株的遺傳相似系數(shù)變異范圍在0.66～1.00，表明秀珍菇遺傳差異較大，背景豐富。

2.3 菌株農(nóng)藝性狀比較

通過遺傳多樣性分析，從36個秀珍菇菌株中選擇9個代表性菌株，按編號1～9分別是X3、X4、X28、X11、 X35、X23、X12、 X27、X31，主栽菌株TX5766（編號為10）作為對照品種，進(jìn)行出菇試驗并評價。

2.3.1 秀珍菇菌株菌絲長勢和產(chǎn)量比較

秀珍菇菌株菌絲長勢和產(chǎn)量比較，結(jié)果見表3。

從表3可知，各秀珍菇菌株平均滿袋天數(shù)和產(chǎn)量間均存在顯著差異。菌絲生長最快的是4號、10號菌株，滿袋天數(shù)分別為45 d和45.5 d；最慢的是1號菌株，滿袋天數(shù)為50 d。從前3潮菇產(chǎn)量來看，5號菌株平均產(chǎn)量最高，達(dá)0.326 kg·袋-1，其次是10號菌株，為0.283 kg·袋-1，5號菌株平均產(chǎn)量比對照菌株高15.2%；而其余參試菌株的平均產(chǎn)量均低于主栽對照菌株10號。

表3 秀珍菇菌株產(chǎn)量比較Tab.3 Comparison of yields of Pleurotus geesteranus

2.3.2 各參試菌株栽培和商品性狀比較

各參試菌株栽培和商品性狀比較，結(jié)果見表4。

由表4可知，秀珍菇5號、10號、8號3個菌株菌蓋顏色深灰色，比較符合市場中菌蓋色深的要求；而從出菇密度方面分析，秀珍菇5號、10號、1號和2號菌株出菇密度比較高；從成菇率方面分析秀珍菇5號和10號菌株較高；從菌蓋平展度方面分析，秀珍菇3號、10號和8號菌株整體菇型更秀美。綜合分析農(nóng)藝性狀，秀珍菇5號、3號菌株比較符合市場需求。

3 小結(jié)

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是鑒別食用菌菌株遺傳多樣性的常規(guī)方法，其具有非常高的多態(tài)性，使用的引物較長、退火溫度較高，相對于SRAP、RAPD分子標(biāo)記技術(shù)有較強的穩(wěn)定性和重復(fù)性，比較能夠準(zhǔn)確反映出菌株間的親緣關(guān)系，已廣泛應(yīng)用到秀珍菇、香菇、金針菇、銀耳等食用菌遺傳鑒定中。本試驗利用ISSR引物對36個秀珍菇菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)秀珍菇菌株的遺傳相似系數(shù)變異范圍在0.66～1.00，將36個秀珍菇菌株聚為7個群，這表明秀珍菇遺傳差異較大，背景豐富。

表4 秀珍菇菌株栽培和商品性狀Tab.4 Cultivation and commercial characteristics of Pleurotus geesteranus strains

研究秀珍菇菌株的遺傳背景后，從不同類群中挑選出具有代表性的秀珍菇菌株進(jìn)行反季節(jié)設(shè)施栽培出菇試驗，通過產(chǎn)量、農(nóng)藝性狀等綜合數(shù)據(jù)分析后得出，5號菌株表現(xiàn)較為突出，產(chǎn)量比常規(guī)對照菌株高15.2%，并且在子實體色度、出菇密度、成菇率等性狀方面表現(xiàn)最好，符合市場需求?？梢?，秀珍菇5號菌株為值得推廣的設(shè)施栽培菌株。