血清miRNA-21、Smad1聯(lián)合尿NGAL檢測對早期糖尿病腎病的診斷價值

王錢虎，陳鋰，彭亮

（杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

早期糖尿病腎病癥狀不明顯，進展緩慢，缺乏明確的診斷指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)并采取積極的治療有助于延緩甚至阻止病程進展，對逆轉(zhuǎn)或延緩腎功能損害具有重要意義[1-2]。血清miRNA-21參與血管內(nèi)皮細胞功能變化，miRNA-21表達下調(diào)與糖尿病腎病的發(fā)生及進展密切相關(guān)[3]。人信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子1（Smad1）為腎臟功能紊亂的標(biāo)志物之一，其水平與腎小球系膜基質(zhì)積聚程度呈正相關(guān)，可用于評價糖尿病腎病的嚴(yán)重程度[4]。中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（NGAL）是腎臟保護性蛋白，參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，是反映急性腎損傷的有效指標(biāo)，能夠反映腎小管功能[5]。本研究旨在探討血清miRNA-21、Smad1聯(lián)合尿NGAL檢測對早期糖尿病腎病的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年3月-2016年12月本院收治的130例糖尿病患者（糖尿病組），所有患者均符合2010年糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，餐后血糖＞11.1mmol/L，空腹血糖＞7.0mmol/L，糖化血紅蛋白＞9.0%。選擇同期210例早期糖尿病腎病患者（早期糖尿病腎病組），所有患者均符合糖尿病早期腎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，尿白蛋白排泄率20～200μg/min。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有內(nèi)分泌、心血管、泌尿系統(tǒng)免疫性疾病患者；（2）原發(fā)性腎病、腎動脈狹窄，以及心臟、肝臟及其他全身疾病所致的腎臟疾病患者。兩組一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法 所有患者均于早晨空腹抽取肘靜脈血3mL置于干燥試管中，室溫3000r/min離心10分鐘，取上清液，-80℃凍存?zhèn)溆?。采用聚合酶鏈反?yīng)（PCR）檢測血清 miRNA-21，Trizol提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取血清總RNA，按照mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （上海生工生物工程有限公司）說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，95℃變性，60℃退火，40個循環(huán)。計3個復(fù)孔，以重水為陰性對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣本二階導(dǎo)數(shù)最大分析法計算的Ct值計算miRNA-21水平。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）定量測定血清Smad1水平，嚴(yán)格按照試劑盒（南京建成生物科技有限公司）說明書操作。留取清晨中段尿5mL，室溫3000r/min離心10分鐘，取上清，-80℃凍存?zhèn)溆谩２捎肊LISA法檢測尿NGAL水平，嚴(yán)格按照試劑盒（福建邁新生物技術(shù)有限公司）說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以百分率表示，并采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本或配對資料t檢驗，采用Pearson進行相關(guān)分析，用ROC曲線分析篩選敏感度和特異度。

2 結(jié)果

2.1 血清miRNA-21、Smad1和尿NGAL水平 早期糖尿病腎病組血清miRNA-21含量顯著低于糖尿病組，血清Smad1和尿NGAL水平顯著高于糖尿病組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。詳見表2。

2.2 ROC曲線分析 以靈敏度為縱坐標(biāo)，1-特異度為橫坐標(biāo)，繪制早期糖尿病腎病患者ROC曲線。血清miRNA-21、Smad1、尿NGAL的靈敏度、特異性、陽性似然比、尤登指數(shù)顯著低于三者聯(lián)合檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 血清 miRNA-21、Smad1、尿NGAL的陰性似然比顯著高于三者聯(lián)合，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1和表3。

表2 兩組血清 miRNA-21、Smad1和尿 NGAL比較（±s）

表2 兩組血清 miRNA-21、Smad1和尿 NGAL比較（±s）

與糖尿病組比較**P＜0.01

尿N G A L（μ g/L）糖尿病組 1 3 0 9 7.2 4±8.3 7 0.6 9±0.1 7 1 6.5 2±5.2 6組別 n m i R N A-2 1（%）S m a d 1（n g/m L）早期糖尿病腎病組 2 1 0 7 2.1 5±6.4 2** 1.0 4±0.2 1** 5 9.4 7±9.6 8**

2.3 血清miRNA-21、Smad1和尿NGAL相關(guān)性分析 早期糖尿病腎病患者血清miRNA-21和Smad1、尿 NGAL 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.683，r=-0.714，均P＜0.05）；血清Smad1和尿 NGAL呈正相關(guān)（r=0.806，P＜0.05）。

表3 血清miRNA-21、Smad1、尿NGAL和三項聯(lián)合的診斷效能

3 討論

糖尿病是臨床上常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，機體高血糖的狀態(tài)下內(nèi)皮細胞釋放大量內(nèi)皮血管活性物質(zhì)，造成腎小球及毛細血管硬化，加快非酶促糖基化，導(dǎo)致糖尿病腎病[8]。糖尿病腎病為糖尿病嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致死亡的主要原因。早期糖尿病腎病癥狀隱匿，難以確診。目前早期糖尿病腎病診斷主要依靠微量尿蛋白，但易受多種因素影響，對腎損傷程度缺乏差異性，腎活檢為診斷早期腎病的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有創(chuàng)性[9]。尋找早期糖尿病腎病敏感、特異、無創(chuàng)性指標(biāo)對于確診和指導(dǎo)早期干預(yù)具有重要意義。

miRNA在糖尿病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，miRNA-21為可抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，其表達不受重蛋白編碼啟動子調(diào)控，其血清含量在糖尿病腎病患者中的表達與病情嚴(yán)重程度有關(guān)[10]。Smad1可上調(diào)Ⅳ型膠原表達，活化腎小球硬化分子，其表達與白蛋白尿水平無關(guān)，與早期系膜基質(zhì)的積聚密切相關(guān)，是糖尿病腎病早期診斷的新型生物指標(biāo)[11]。NGAL為脂質(zhì)運載蛋白，參與免疫應(yīng)答、脂質(zhì)代謝、細胞分化凋亡等過程，可通過介導(dǎo)鐵離子轉(zhuǎn)運，促進原始腎小管上皮細胞發(fā)育，當(dāng)腎組織受到損害后促進腎小管的形態(tài)及功能的恢復(fù)，參與多種腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程[12-13]。血清miRNA-21、Smad1和尿NGAL雖均與糖尿病腎病有關(guān)，但其在早期糖尿病腎病的含量和表達尚缺乏研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，早期糖尿病腎病組血清miRNA-21含量顯著低于糖尿病組，而血清Smad1和尿NGAL水平顯著高于糖尿病組，且血清miRNA-21和Smad1、尿NGAL呈負(fù)相關(guān)，血清Smad1和尿NGAL 呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ROC曲線顯示血清miRNA-21、Smad1聯(lián)合尿NGAL檢測優(yōu)于單個指標(biāo)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。早期糖尿病腎病患者腎小管上皮細胞NGAL高表達，且NGAL先于尿微量白蛋白反映腎功能損傷，早期腎小管損害即可引起血清Smad1的高表達，患者全身氧化應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致病情的進展，損傷腎小球和內(nèi)皮細胞功能，加重病情，導(dǎo)致血清miRNA-21含量降低，表達下調(diào)。

血清miRNA-21、Smad1聯(lián)合尿NGAL檢測早期糖尿病腎病具有較高的診斷效能，有望成為早期糖尿病腎病的診斷指標(biāo)。但本研究沒有與微量尿蛋白這一指標(biāo)進行比較，需進一步進行探討。