托吡酯對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用

范成普，杜杭根，周冰之，王承，郝必烈，李宏宇，陳景南，曹杰

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州310005）

繼發(fā)于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂的蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是神經(jīng)外科臨床中較常見的一種嚴(yán)重疾病，預(yù)后差、死亡率高，大約占所有中風(fēng)病例的5%～7%[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，早期腦損傷發(fā)生在SAH后72小時(shí)內(nèi)，是由多種機(jī)制參與其病理生理過程，預(yù)后較差[2-3]，控制SAH后早期腦損傷具有重要意義。托吡酯作為一種新型、廣譜的抗癲藥物，已被報(bào)道對(duì)多種腦損傷有保護(hù)作用[4-6]。本研究旨在從神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥角度探討托吡酯對(duì)SAH后早期腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床治療蛛網(wǎng)膜下腔出血提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 SD雄性大鼠80只，清潔級(jí)，體質(zhì)量180～230g，由上海西普爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016，隨機(jī)分為假手術(shù)組20只、SAH組30只和TPM組30只。將三組SD大鼠在同一實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼料由標(biāo)準(zhǔn)粉、麩皮、魚皮粉等組成，溫度24～26℃，濕度60%～70%。

1.2 SAH模型構(gòu)建 根據(jù)Bederson法[7]行頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺建立SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型（SAH組和TPM組）：取健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量300～350g，采用復(fù)合麻醉劑腹腔注射，仰臥位固定后經(jīng)右側(cè)股動(dòng)脈插管，于術(shù)前及SAH后行血?dú)夥治?。頸前部備皮、消毒，在頸部正中切口，鈍性分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎切斷頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈之間的吻合支，將頸外動(dòng)脈結(jié)扎并切斷拉直，使其與頸內(nèi)動(dòng)脈成一直線。取3.0單股尼龍線50mm并在線端18.5mm處作一標(biāo)記，頭端銳化后將尼龍線經(jīng)頸外動(dòng)脈置入頸內(nèi)動(dòng)脈的顱內(nèi)段，進(jìn)入深度約18.5mm，直到感覺有阻力時(shí)再往前進(jìn)3mm，刺破血管造成SAH，約15秒后迅速拔出尼龍線，然后結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端，縫合頸部切口。假手術(shù)組除了不刺破血管壁外，其余操作均與SAH組相同。整個(gè)手術(shù)過程大鼠予以電熱毯保持恒溫（37±1）℃。

1.3 方法 術(shù)后2小時(shí)，TPM組予40mg/kg托吡酯（Topiramte，TPM）灌胃，其余兩組灌服等量生理鹽水，12小時(shí)1次。灌胃前及術(shù)后24小時(shí)進(jìn)行Garcia JH神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[8]，48小時(shí)后處死取腦組織檢測(cè)含水量及 NF-κb p65、Caspase-3和 Bax/Bcl-2指標(biāo)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 Garcia JH神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1，對(duì)每組大鼠逐一評(píng)估，最高18分，最低 3 分，結(jié)果以（±s）表示。

表1 Garcia JH神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2 腦組織含水量測(cè)定 采用干、濕重法測(cè)定。各組取大鼠6只，斷頭取腦，取傷側(cè)大腦半球腦組織標(biāo)本，電子天平稱稱取濕重（溫度20～25℃，濕度70%～90%），然后將標(biāo)本置于（100±2）℃恒溫干燥箱內(nèi)24小時(shí)烘干至恒重，稱取干重。腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.4.3 其他指標(biāo) 采用TUNEL/NeuN/DAPI染色觀察細(xì)胞凋亡變化，采用Western blot方法檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2、Bax以及 NF-κb p65 表達(dá)。 Western blot檢測(cè)方法：收集細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞1次，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，在冰上操作30分鐘，10000r／min，4℃離心2分鐘，收集細(xì)胞上清液測(cè)定樣品蛋白濃度，10%SDS-PAGE電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，加一抗 （NF-κb p65、Caspase-3、Bax、Bcl-2、actin）4℃孵育過夜，洗膜后結(jié)合堿性磷酸酶標(biāo)記二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）室溫避光孵育1小時(shí)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，重復(fù)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組相比，SAH組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低， 腦組織含水量升高，NF-κb p65、Caspase-3 和Bax/Bcl-2均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與SAH組比較，TPM組行為學(xué)評(píng)分升高、腦組織含水量降低，NF-κb p65、Caspase-3 和 Bax/Bcl-2均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜0.05）。詳見表2。從細(xì)胞凋亡及神經(jīng)炎癥角度看，TPM治療后中可觀察到綠色標(biāo)記的凋亡細(xì)胞比例下降，Caspase-3和促凋亡蛋白Bax表達(dá)減少，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，NF-κb p65表達(dá)減少。詳見圖1-3。

表2 三組觀察指標(biāo)比較（±s）

表2 三組觀察指標(biāo)比較（±s）

與假手術(shù)組比較*P＜0.05；與SAH組比較△P＜0.05

組別S A H組T P M組假手術(shù)組n 3 0 3 0 2 0行為學(xué)評(píng)分 腦組織含水量（%） N F-κ b p 6 5（%） C a s p a s e-3（%） B a x/B c l-2 1 1.0 9±2.2 9* 7 9.9 9±1.5 7* 2 9.5 6±1.2 1* 2 4.8 6±3.0 7* 1.8 7±0.8 2*1 4.6 5±3.2 8△ 7 6.9 1±1.7 7△ 1 8.7 6±1.6 3△ 1 1.6 9±1.8 2△ 1.1 2±0.6 4△2 0.4 5±1.3 9 7 6.3 4±1.8 1 6.7 5±0.8 3 8.3 4±1.2 9 0.7 2±0.1 3

3 討論

SAH是由于腦血管破裂后血液流至蛛網(wǎng)膜下腔所致，是一種災(zāi)難性的疾病，可分為自發(fā)性和創(chuàng)傷性。SAH后早期腦損傷指出血后72小時(shí)內(nèi)的腦組織損害，被認(rèn)為是后期高致死率及高致殘率的主要因素[7]。許多嚴(yán)重的生理紊亂在早期腦損傷期間有不良后果，如血腦屏障破壞、炎癥、細(xì)胞死亡以及SAH后早期的癥狀體征。幾十年來，治療早期腦損傷的神經(jīng)保護(hù)藥物層出不窮，但均未達(dá)到滿意的效果。TPM又名“妥泰”，是臨床上一種新型的抗癲藥，有研究證實(shí)其在一系列神經(jīng)損傷中，如腦水腫、再灌注損傷、慢性壓迫性神經(jīng)損傷、癲、脊髓損傷、創(chuàng)傷性腦損傷等具有保護(hù)效應(yīng)[8-10]。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，TPM有助于改善缺血性顱腦損傷的神經(jīng)功能[11]；另外，也有研究者在大鼠的創(chuàng)傷性顱腦損傷模型上發(fā)現(xiàn)TPM的類似療效。

本研究中，與假手術(shù)組相比，SAH組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低，說明蛛網(wǎng)膜下腔出血會(huì)損傷顱腦神經(jīng)功能，而經(jīng)過TPM治療，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分又升高，說明TPM治療在神經(jīng)功能方面具有保護(hù)效應(yīng)。顱腦損傷后腦組織含水量反映腦水腫程度，腦水腫通常導(dǎo)致一系列不良預(yù)后，本文中SAH組與假手術(shù)組相比，腦組織含水量升高，說明SAH后出現(xiàn)明顯的腦水腫，水腫消退有利于腦神經(jīng)損傷的恢復(fù)，經(jīng)TPM治療，腦組織的含水量顯著降低（均P＜0.05）。

此外，SAH引起的腦水腫涉及多種發(fā)生發(fā)展機(jī)制，包括細(xì)胞凋亡、促炎因子的調(diào)控（如IL-1β，IL-6和TNF-α）[12-13]，其中，炎癥在疾病的病理生理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，涉及到促炎因子釋放、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)研究了與神經(jīng)炎癥相關(guān)的信號(hào)通路NF-κb p6，表明SAH后血管痙攣中NF-κb參與促炎因子的調(diào)控，抑制NF-κb激活是一種調(diào)節(jié)神經(jīng)保護(hù)或者神經(jīng)功能恢復(fù)的重要途徑。本研究Western blot結(jié)果顯示TPM能抑制NF-κb激活，意味著在SAH后早期腦損傷中 NF-κb可能介導(dǎo)促炎因子的TPM調(diào)節(jié)。細(xì)胞凋亡，即程序性細(xì)胞死亡，出現(xiàn)在多種腦損傷的病理生理狀態(tài)中。動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血后的繼發(fā)性改變包括顱內(nèi)壓增高和腦血流減少，易導(dǎo)致缺血性腦損傷，此種狀態(tài)下細(xì)胞凋亡易出現(xiàn)在海馬、血腦屏障和脈管系統(tǒng)，有可能比直接腦損傷更危險(xiǎn)。頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立的大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，細(xì)胞凋亡在大腦大部分區(qū)域可被觀察到，尤其在基底大腦皮層和海馬[14]，與本研究一致。Caspases能導(dǎo)致DNA斷裂和細(xì)胞死亡，是參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)，其中Caspases-3的激活依靠斷裂的進(jìn)程。此外，Bcl-2在各種條件下也參與神經(jīng)凋亡的調(diào)節(jié)。在線粒體途徑中，Bax為一種促進(jìn)凋亡的蛋白質(zhì)，易位到線粒體中并進(jìn)一步產(chǎn)生細(xì)胞色素C，最終激活Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如Caspases-3。Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，與Bax一起形成二聚體，Bax/Bcl-2比值意味著促凋亡或抗凋亡趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)中，SAH后細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多，Caspases-3大量激活和Bax/Bcl-2比值的升高均意味著SAH導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而經(jīng)過TPM治療后通過下調(diào)Bax/Bcl-2比值和抑制Caspases-3的激活達(dá)到了抗凋亡效應(yīng)。類似的結(jié)果在Mao等[10]關(guān)于腦缺血以及再灌注損傷的研究有過報(bào)道。

綜上所述，TPM可能通過抗凋亡、抗炎在SAH后早期腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。作者后續(xù)將進(jìn)一步研究TPM濃度-效應(yīng)關(guān)系，從神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥兩個(gè)不同角度探討TPM對(duì)SAH后早期腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，從而為臨床治療蛛網(wǎng)膜下腔出血提供新的思路。