介紹顏色反應(yīng)中的幾種試劑

重慶市鳳鳴山中學(400037)

馮漢茹

1 教學背景

組成細胞的有機物主要包括糖類、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等，某些化學試劑能和這些有機物產(chǎn)生相應(yīng)的顏色反應(yīng)，借助人的感官對顏色反應(yīng)的直接觀察或?qū)Ρ扔^察，以此檢測和驗證生物組織中某種物質(zhì)的存在。但開展物質(zhì)鑒定類實驗有2個弱點：①學生不能一一對應(yīng)鑒定試劑和被檢測物質(zhì)的關(guān)系，無法客觀地評價實驗結(jié)果；②學生因不清楚試劑配置過程以致混淆操作步驟，無法準確地描述分析實驗的現(xiàn)象。基于此，本文選取斐林試劑、班氏試劑、雙縮脲試劑、二苯胺試劑、吡羅紅甲基綠混合染色劑和龍膽紫溶液展開介紹，對比學習試劑配置過程和使用方法，有利于物質(zhì)鑒定類實驗的順利開展和推進。

2 斐林試劑與班氏試劑

糖的化學本質(zhì)是多羥基醛或多羥基酮以及它們的衍生物或多聚物。鑒定可溶性還原糖(如葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖和堿性溶液中的果糖等)常用斐林試劑或班氏試劑。

斐林試劑由質(zhì)量濃度0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液(甲液)和質(zhì)量濃度0.05 g/mL的硫酸銅溶液(乙液)配制而成，二者混合后立即生成了新鮮的淡藍色氫氧化銅沉淀。其中，0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液是由10 g氫氧化鈉，加蒸餾水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中配置而成。0.05 g/mL的硫酸銅溶液是由5 g硫酸銅，加蒸餾水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中配置而成。反應(yīng)原理為：Cu2+具有弱氧化性，還原糖的醛基(-CHO)具有還原性可在水浴加熱條件下被氧化為酸，Cu(OH)2被還原為磚紅色Cu2O沉淀，顏色變化為淡藍色——棕色——磚紅色。反應(yīng)式為：R-CHO+2Cu(OH)2→R-COOH+Cu2O↓+2H2O。醛被氧化形成了酸，而酮不能被斐林試劑氧化，所以斐林試劑除了鑒定還原糖之外，還可以區(qū)別醛和酮。

配制斐林試劑需要將甲液、乙液等量混合均勻后形成Cu(OH)2懸濁液。若先加入甲液，組織中的有機酸與NaOH迅速反應(yīng)，反應(yīng)物中Cu(OH)2沒有或不足，繼而還原糖的半縮醛羥基易被氧化而失去還原性，再加入硫酸銅溶液不能產(chǎn)生Cu2O沉淀，只有將二者先混合配置后，才能產(chǎn)生Cu(OH)2，所以斐林試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配。若斐林試劑久置過后，在使用前搖勻也不能用，因為現(xiàn)用現(xiàn)配的“有效成分”是新制的處于懸浮透明膠體狀態(tài)Cu(OH)2，放置過久，Cu(OH)2會完全沉淀，反應(yīng)很慢甚至沒有反應(yīng)。

班氏試劑也稱本尼迪特試劑，Cu2+在OH-存在的條件下氧化還原糖中的醛基，自身則被還原成磚紅色Cu2O沉淀。其有兩種配制方法：①由硫酸銅、無水碳酸鈉和檸檬酸鈉配成的弱堿性藍色溶液，存放備用；②由硫酸銅、碳酸鈉和枸櫞酸鈉配成的弱堿性藍色溶液，主要成分是Cu2+和枸櫞酸根離子形成的物質(zhì)，存放備用。

3 雙縮脲試劑

蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的一類生物大分子，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。鑒定蛋白質(zhì)或多肽常用雙縮脲試劑。雙縮脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)與雙縮脲試劑并不相同。將尿素加熱到熔點以上，2分子尿素之間失去1分子氨生成了雙縮脲，即NH2-CO-NH2+NH2-CO-NH2→NH2-CO-NH-CO-NH2+NH3↑。雙縮脲含有化學里的酰胺鍵，生物中也稱肽鍵(-CO-NH-)，能與堿性溶液中的Cu2+結(jié)合生成紫色絡(luò)合物，從而發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。

蛋白質(zhì)或多肽的肽鍵和雙縮脲的肽鍵相同，凡含有兩個及兩個以上肽鍵的蛋白質(zhì)或多肽能與雙縮脲試劑發(fā)生紫色反應(yīng)，檢測生物組織中是否含有蛋白質(zhì)。即便蛋白質(zhì)在加熱條件下變性，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但肽鍵并沒有破壞，只要含有兩個及兩個以上肽鍵，雙縮脲試劑依然能和變性的蛋白質(zhì)發(fā)生紫色反應(yīng)。但雙縮脲試劑不能與二肽或尿素發(fā)生紫色反應(yīng)，而是出現(xiàn)藍色絡(luò)合物沉淀。

雙縮脲試劑由質(zhì)量濃度0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液(雙縮脲試劑A)和質(zhì)量濃度0.01 g/mL的硫酸銅溶液(雙縮脲試劑B)配制而成。

鑒定蛋白質(zhì)操作過程有兩種：①先向試管內(nèi)加入一定量的待測組織樣液，再加入適量的雙縮脲試劑A液，混合均勻后再滴入幾滴雙縮脲試劑B液以制得堿性條件下中的Cu2+，觀察試管中顏色變化；②先向試管內(nèi)加入適量的雙縮脲試劑A液，再滴入幾滴雙縮脲試劑B液，混合均勻后，再加入一定量待測組織樣液，觀察試管中顏色變化。待測組織樣液和雙縮脲試劑加入的順序可以改變，但雙縮脲試劑A液、雙縮脲試劑B液是先后加入的，不可顛倒以造成堿性環(huán)境。若先加入雙縮脲試劑B液，后加入雙縮脲試劑A液，重金屬鹽CuSO4讓蛋白質(zhì)變性溶解度變小的同時，CuSO4與NaOH發(fā)生復分解反應(yīng)無法制造堿性環(huán)境還生成了藍色氫氧化銅Cu(OH)2沉淀，導致現(xiàn)象模糊，無法達到實驗?zāi)康摹?/p>

4 吡羅紅甲基綠混合染色劑與二苯胺試劑

吡羅紅甲基綠混合染色劑呈堿性，含有“兩”種染料，常用來觀察DNA、RNA在胞內(nèi)的分布，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

混合使用的原因如下。

(1)甲基綠呈藍綠色，吡羅紅(也稱派洛寧或焦寧)呈紅色，在沒有結(jié)合核酸的情況下也是“本色”。

(2)若分別用甲基綠、吡羅紅染料染兩組細胞，甲基綠既結(jié)合DNA又結(jié)合RNA，均為藍綠色，無法區(qū)別DNA、RNA的分布；吡羅紅既結(jié)合DNA又結(jié)合RNA，均為紅色，也無法區(qū)別DNA、RNA的分布。

簡言之，僅用甲基綠，無法鑒定DNA亦無法鑒定RNA。兩種染料混合使用，它們對DNA、RNA親和力不同，甲基綠更親合聚合程度高的DNA呈現(xiàn)綠色，吡羅紅更親合聚合程度低的RNA呈現(xiàn)紅色，從而可以區(qū)別二者的主要分布。

鑒定DNA常用二苯胺[(C6H5)2-NH]試劑，而不使用甲基綠。二苯胺試劑與DNA混勻，在沸水浴條件下呈藍色。它有兩種配制方法。

(1)取0.8 g二苯胺溶于180 mL冰醋酸中，再加入8 mL 60%以上的過氯酸，混勻待用，臨用前加入0.8 mL 1.6%的乙醛溶液，配置成無色溶液。

(2)取1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸，再加入1.5 mL濃硫酸，棕色瓶保存，制得A液；隨后配置體積分數(shù)0.2%的乙醛溶液為B液，再取0.1 mL B液加入A液，制成二苯胺試劑。

DNA在沸水浴條件下與二苯胺試劑反應(yīng)顯示藍色。反應(yīng)原理為：DNA中嘌呤核苷酸的脫氧核糖與酸生成ω-羥基-γ酮基戊醛，ω-羥基-γ酮基戊醛與(C6H5)2-NH反應(yīng)顯示藍色，即DNA+CH3COOH+C6H5-NH-C6H5→藍色物質(zhì)。所以，鑒定DNA用二苯胺試劑，而區(qū)分DNA、RNA的分布用吡羅紅甲基綠混合染色劑。

5 龍膽紫溶液、醋酸洋紅染液、改良苯酚品紅溶液

染色體由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成，易被堿性染料染成深色的物質(zhì)，具體來說，用龍膽紫溶液、醋酸洋紅染液、改良苯酚品紅溶液來鑒定染色體，它們分別將染色體染成紫色、紫紅色、紫紅色。龍膽紫，堿性染料，主要是結(jié)晶紫和甲基紫的混合物。配制方法：取30 mL冰醋酸加熱至40 ℃，放入0.75 g龍膽紫，溶解后加入70 mL蒸餾水，過濾后備用。醋酸洋紅染液配制方法：取100 mL45%的醋酸溶液，加入0.5～1 g洋紅，煮沸5 min或加回流煮沸12 h，冷卻后進行過濾，再加入1%～2%鐵明礬水溶液數(shù)滴，直到該液體變?yōu)榘导t色不發(fā)生沉淀為止，最后將液體放入棕色瓶中貯存避免陽光直射。改良苯酚品紅(也稱改良堿性品紅)溶液由堿性品紅混合液與苯酚混合而成，配制方法：母液A，取3 g堿性品紅溶解在100 mL70%的酒精；母液B，取10 mL母液A，加入90 mL5%的苯酚水溶液；苯酚品紅溶液，取45 mL母液B，加入6 mL冰醋酸和6 mL 37%的甲醛；改良苯酚品紅溶液，取2～10 mL苯酚品紅溶液再加入98～90 mL45%的冰醋酸和1.8 g山梨醇。

6 總結(jié)

綜上所述，用顏色反應(yīng)鑒別生物組織中的物質(zhì)時應(yīng)仔細了解試劑配置過程和使用方法，靈活分辨被檢測物質(zhì)和鑒定試劑的化學反應(yīng)原理，在本學科知識正確指導的前提下，再培養(yǎng)學生進行實驗的操作能力、觀察能力、分析能力。