向海地區(qū)斑嘴鴨體內(nèi)1新種絳蟲的分離與鑒定1)

侯志軍 王麗新 沈美英 柴洪亮 楊思遠(yuǎn)

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (黑龍江民族職業(yè)學(xué)院)

斑嘴鴨(Anaspoecilorhyncha)在向海地區(qū)很普遍且分布很廣[1]，隸屬鳥綱、雁形目、鴨科、鴨屬，中型游禽[2]。在我國東北部、北部及華北等地區(qū)繁殖，在我國長江中下游、東南沿海和臺灣越冬。由于過度獵取和環(huán)境惡化，斑嘴鴨數(shù)量日趨減少，因此被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟》。

絳蟲隸屬于扁形動物門的絳蟲綱。絳蟲種類眾多，生物學(xué)特性各異，分布廣泛，對人和動物危害嚴(yán)重。鳥類[3],特別是水禽，可以寄生多種絳蟲[4]，引起嚴(yán)重的鳥類疾病。寄生于鳥類腸道內(nèi)的絳蟲會爭奪宿主營養(yǎng)，或鉆入宿主腸黏膜破壞腸壁組織，或由多數(shù)蟲體密集造成腸阻塞，阻礙宿主的消化吸收而影響鳥類的正常生長發(fā)育[5]，如戴文科的節(jié)片戴文絳蟲(Davaineaproglottina)、膜殼科的毛形劍帶絳蟲(Drepanidotacnialanceolata)、片形皺褶絳蟲(Fimbriariafasciolaris)等[6]。

膜殼科(Hymenolepididae)絳蟲在哺乳動物和鳥類中有著廣泛的寄生，如鼠類、蝙蝠和水禽等。目前至少有620種絳蟲和膜殼科的230種絳蟲寄生在鳥和哺乳動物中。面對如此多種類的絳蟲，對它們分類問題的研究從未停止過。近期，Khalil et al.對膜殼科進(jìn)行了比較系統(tǒng)的修訂[7]，但并沒有對每一個屬進(jìn)行修正。膜殼科的絳蟲種類繁多，部分種類形態(tài)學(xué)特征相似，如果僅僅依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行種屬鑒定，由于缺乏明確形態(tài)學(xué)特征往往會導(dǎo)致物種分類鑒定的錯誤[8]。例如，在鴨小腸內(nèi)分離出的1種膜殼科的絳蟲(MonosaccanthesCzaplinski,1967),直到2001年才被發(fā)現(xiàn)是EchinatriumSpassky，1956的同物異種[9]。

核苷酸序列數(shù)據(jù)成功應(yīng)用于寄生蟲分類，這有助于系統(tǒng)解決膜殼科寄生蟲分類面臨的問題[10]?；谝粋€完整的形態(tài)特征評估的和系統(tǒng)發(fā)育的證據(jù)[11]，曾被列入嚙殼屬(Glires)一些物種已被轉(zhuǎn)移到最近成立的Pararodentolepis屬[12]。此外，Greiman et al.在結(jié)合了核酸序列(28S,nad1)和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立了一個新屬[13]。顯然，膜殼科分類進(jìn)一步的完善需要形態(tài)學(xué)和分子數(shù)據(jù)的結(jié)合使用[14]。

在中國雁形目絳蟲的研究非常少，目前為止還未見斑嘴鴨體內(nèi)膜殼科絳蟲的研究。

1 材料與方法

樣品材料：斑嘴鴨取自吉林省向海地區(qū)。絳蟲取自斑嘴鴨小腸內(nèi)，置于70%酒精內(nèi)用于形態(tài)學(xué)和分子研究。

鏡檢方法：將經(jīng)蘇木素染色[15]的絳蟲標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

DNA的提?。喝? g液氮中保存的蟲體組織，置于研缽中，研磨粉碎，使用組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，-20 ℃下保存。

PCR擴(kuò)增3個基因所用引物：擴(kuò)增28S rDNA使用的引物參考Hillis et al.[16]設(shè)計的，目的片段長度為1 100 bp。擴(kuò)增nad1基因使用的引物參考Widmer et al.[17]設(shè)計的,目的片段長度為700 bp。擴(kuò)增18S rDNA基因引物設(shè)計是通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)18S基因序列，自主設(shè)計,目的片段長度為500 bp。所有引物序列均委托庫美生物有限公司合成。引物序列詳細(xì)見表1。

表1 28S rDNA、nad1、18S rDNA基因擴(kuò)增引物序列

PCR擴(kuò)增3個基因所用反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增采用25 μL PCR體系，PCR buffer 2.5 μL，MgCl22.0 μL，dNTP 2.5 μL，Primer1 1.0 μL，Primer2 1.0 μL，DNA 3.0 μL，蒸餾水12.0 μL，Taq酶1.0 μL。28S序列PCR反應(yīng)程序為，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。nad1序列PCR反應(yīng)程序為，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。18S序列PCR反應(yīng)程序為，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。最后，將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳下進(jìn)行觀察。

PCR產(chǎn)物測序及分析：用杭州博日科技有限公司的膠回收試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物，將純化后產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，振蕩培養(yǎng)后涂布在含Amp的LB上，過夜培養(yǎng)后挑選白色的單菌落，對菌落進(jìn)行PCR鑒定，篩選陽性克隆并經(jīng)凝膠純化后送至庫美生物有限公司進(jìn)行雙向測序。用序列分析軟件對測序結(jié)果進(jìn)行排列校對，然后與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行Blast比對，確定蟲種。

系統(tǒng)進(jìn)化分析：用軟件Mega 5(http://www.megasoftware.net/)中Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建基于3個基因位點(28S rRNA、nad1和18S rRNA)序列的系統(tǒng)樹，并用Kimura two-parameter模型計算遺傳距離；設(shè)置1 000次bootstrap檢測支持度。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述

中型絳蟲，蟲體全長93.0 mm，體最大寬度1.4 mm。前端細(xì)小，后端漸大，節(jié)片數(shù)目多，具緣膜，所有節(jié)片均長遠(yuǎn)大于寬。頭節(jié)圓形，兩側(cè)略膨大，寬度為0.391～0.412 mm，平均為0.402 mm(圖1A)。吸盤4個，具棘刺，呈圓形或橢圓形，大小為(0.098～0.103)mm×(0.101～0.144)mm，平均為0.101 mm×0.122 mm。頂端有頂突，平均大小為0.171 mm×0.131 mm，其周圍有一圈小鉤，共10個，呈“y”字形，吻鉤長0.019～0.029 mm(圖1B)。

頸節(jié)與頭節(jié)清楚地分開，節(jié)片寬為頭節(jié)的一半，寬度為0.236～0.337 mm，平均為0.286 mm。

未成熟節(jié)片細(xì)小，其內(nèi)生殖器官尚未發(fā)育成熟。

成熟節(jié)片大小為(0.901～1.208)mm×(0.079～0.127)mm，平均為1.055 mm×0.103 mm。內(nèi)含成熟生殖器官一套(圖1C，D)。生殖器官為單套。生殖孔開口于蟲體右側(cè)，在每個體節(jié)側(cè)緣前端1/3處。

睪丸2枚，成熟的睪丸呈橢圓形，直線排列于節(jié)片中央，緊湊并位于中間，與卵巢常有部分重疊。大小為(0.056～0.081)mm×(0.078～0.126)mm，平均為0.069 mm×0.102 mm(圖1C)。具有外貯精囊，囊狀呈橢圓形，一般位于排泄管附近，與陰莖囊相連接。平均大小0.102 mm×0.045 mm(圖1C,D)。內(nèi)貯精囊呈長梭形，占據(jù)陰莖囊的大部分，與陰莖囊?guī)缀醯乳L(圖1C，D)。在成熟節(jié)片內(nèi)，陰莖囊伸長但未到達(dá)節(jié)片中央，也并未穿過背滲透調(diào)節(jié)管，大小為(0.175～0.190)mm×(0.048～0.054)mm，平均為0.183 mm×0.051 mm(圖1C,D)。

卵巢囊狀位于中間，呈三葉，寬度為0.290～0.396 mm，平均為0.343 mm(圖1D)。卵黃腺圓形或橢圓形，緊湊并位于中間，背對卵巢，大小為(0.071～0.096)mm×(0.056～0.095)mm，平均為0.084 mm×0.076 mm(圖1D)。

孕卵節(jié)片(1.249～1.374)mm×(0.121～0.136)mm，平均為1.312 mm×0.128 mm(圖1E)。背排泄管比腹排泄管細(xì)，腹排泄管直徑0.029～0.045 mm，平均為0.037 mm。背滲透壓管直徑0.027～0.033 mm，平均0.029 mm(圖1C，E)。孕節(jié)子宮呈囊狀，囊袋不裂解為卵袋。子宮壁向節(jié)片四周擴(kuò)張,越出排泄管，充滿整個孕節(jié)(圖1E)。

綜上，分離的絳蟲為1新種，命名為Diorchispoecilorhynchamorbus, Zhijun Hou,2017。

詞源，拉丁語，morbus=病，poecilorhyncha=宿主的拉丁名；指的是該種絳蟲對斑嘴鴨致病。模式樣本存放于東北林業(yè)大學(xué)寄生蟲研究中心，NEFU-HY1901，頭節(jié)及部分節(jié)片染色及固定在加拿大樹脂中(1條)，NEFU-HY190P兩條沒有頭節(jié)的樣本染色及固定在加拿大樹脂中(2條)。

A.頭節(jié)；B.吻鉤；C.雄性器官；D.雌性器官；E.孕節(jié)。

2.2 分子進(jìn)化分析

2.2.1 28S rDNA進(jìn)化樹

Bayesian法構(gòu)建的28S序列的進(jìn)化樹結(jié)果見圖2。在Bayesian樹中，所測絳蟲基因序列與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫上的其他絳蟲的28S序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，假葉目絳蟲(Paraechhinophallusjaponicas)作為外群，位于進(jìn)化樹最底部。其余樣本另開一支，與外群距離遠(yuǎn)，表明其余樣本不屬于假葉目，而是圓葉目。在圓葉目大枝中，又大致可以將所檢測樣本歸為較大的5個小枝，包括裸頭科(Anoplocephalidae)、膜殼科(Hymenolepididae)、雙殼科(Dilepididae)、戴文科(Davaineidae)和中絳科(Mesocestoididae)。本試驗的絳蟲歸于膜殼科分枝中。

圖2 Bayesian法構(gòu)建的絳蟲28S的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2.2 線粒體nad1進(jìn)化樹

Bayesian法構(gòu)建的nad1序列的進(jìn)化樹結(jié)果見圖3。在Bayesian樹中，所測絳蟲基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫上膜殼科中其他屬絳蟲的nad1序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，本試驗的絳蟲并未歸于膜殼科中已有nad1序列的各屬絳蟲之中，而是同膜殼屬、假裸頭屬、微棘屬并列，單獨(dú)分為1枝。從親緣關(guān)系上看，與微棘屬、假裸頭屬、膜殼屬的遺傳距離比較近。

2.2.318S rDNA基因的絳蟲序列比對和遺傳距離

根據(jù)18S rDNA測序返回結(jié)果，通過NCBI上數(shù)據(jù)庫Blast程序進(jìn)行同源對比，從GenBank查找并下載相近的9屬11種膜殼科絳蟲的18S基因序列(包括雙睪屬、縐緣屬、膜殼屬、微棘屬、嚙殼屬、Wardoides屬、Coronacanthus屬、Diploposthe屬、Staphylocystis屬)，連同本試驗獲得的12個序列的18S rDNA基因遺傳距離的關(guān)系見表2。由表2可見，Diorchispoecilorhynchamorbus與雙睪屬的D.brevis遺傳距離最近，為0.01。

3 結(jié)論與討論

結(jié)合絳蟲典型的形態(tài)學(xué)特征，如節(jié)片有緣膜且寬大于長、睪丸數(shù)量少(2個)，生殖孔為單側(cè)開口(右側(cè))，28S rDNA進(jìn)化樹可以確定本研究的絳蟲為膜殼科絳蟲。

在28 rDNA進(jìn)化樹中，D.poecilorhynchamorbus與Hymenolepissp.的親源關(guān)系最近；在nad1進(jìn)化樹中，其同微棘屬、假裸頭屬、膜殼屬的遺傳距離較近，但是微棘屬和膜殼屬絳蟲的吸盤無刺且睪丸為3枚，假裸頭屬與膜殼屬絳蟲頭節(jié)沒有頂突或頂突退化，而本試驗絳蟲有2枚睪丸且頂突明顯。18S rDNA分析表明其同雙睪屬的Diorchisbrevis親緣關(guān)系(相似度大于99%)最近。

圖3 Bayesian法構(gòu)建的nad1的系統(tǒng)進(jìn)化樹

絳 蟲1234567891011121 Diorchis brevis2 Fimbriaria sp.0.073 Hymenolepis nana1.071.064 Wardoides nyrocae1.101.070.035 Coronacanthus omissus1.071.060.010.036 Diploposthe laevis0.080.061.051.051.057 Microsomacanthus pachycephala1.061.040.020.040.021.038 Rodentolepis microstoma1.671.631.331.381.361.581.339 Staphylocystis furcata0.070.031.071.101.080.051.061.5710 Hymenolepididae0.070.041.051.061.050.051.031.610.0311 Hymenolepididae1.081.050.010.030.011.040.021.361.081.0412 D. poecilorhynchamorbus0.010.071.071.091.070.081.051.680.060.071.08

在膜殼科絳蟲的形態(tài)學(xué)鑒定中，頂突及其棘刺、睪丸的數(shù)量等形態(tài)學(xué)特征是重要的依據(jù)[18]。本試驗絳蟲的頭節(jié)上有具10個棘刺的可伸縮頂突以及每個節(jié)片具睪丸2個，符合雙睪屬的典型特征。綜合形態(tài)學(xué)和分子進(jìn)化特征，可確定該絳蟲為膜殼科雙睪屬絳蟲。

通過觀察比較本試驗的蟲體,其基本特征與主要構(gòu)造如陰莖囊的位置、陰莖囊的長度范圍、睪丸位置形狀等，同D.excentricusMayhew,1925相符。但是D.excentricus絳蟲的棘突上的小鉤長度為0.027～0.039 mm，而筆者描述的蟲體上的小鉤明顯較小(0.019～0.029 mm)，所以確定本研究分離的絳蟲為膜殼科雙睪屬1新種，命名為D.poecilorhynchamorbus，Zhijun Hou,2017。

膜殼科是絳蟲中種的數(shù)量最多的科[19]，但該科絳蟲的許多描述是不完整的，此外，膜殼科的分子數(shù)據(jù)也很少。本研究獲得的試驗數(shù)據(jù)，將補(bǔ)充到相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，為將來膜殼科絳蟲更為科學(xué)的系統(tǒng)分類提供支持。