鹽堿脅迫對星星草-叢枝菌根真菌共生體酶活性及游離氨基酸的影響1)

張良 楊春雪

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

星星草(Puccinelliatenuiflora)，又名小花堿茅，屬禾本科堿茅屬多年生草本植物，在哈薩克斯坦、阿爾泰到雅庫梯以及我國西北、內(nèi)蒙古、東北、華北、青海等地區(qū)分布居多，其在我國東北松嫩平原鹽堿地治理中承擔著非常重要的過度作用[1]。星星草能夠生長于鹽堿化土地，是優(yōu)良的牧草，具有很強的耐鹽性[2]、耐旱性[3]和抗寒性[4]。近年來，土地鹽堿化成為一個世界性的難題，根據(jù)UNESCO和FAO的不完全統(tǒng)計，截止至2000年，全世界土地鹽漬化面積約為9.55億hm2，大約占全球表面積的7%[5]，并且有日益加重的趨勢，每年由于鹽堿地的影響而被廢棄的土地約有1億hm2[6]，所以鹽堿地的治理顯得尤為重要。我國利用20年時間對140多種抗鹽堿性牧草進行了科學篩選，星星草由于具有優(yōu)良的生態(tài)習性而成為首選牧草之一[7]。

利用微生物與植物聯(lián)合手段對鹽堿地治理是目前引起人們高度關注的一種生物方法。該方法一般利用能夠與植物形成互惠共生體的微生物來改良土壤理化性質(zhì)，其中叢枝菌根(AM)真菌應用最為廣泛。AM真菌可以與絕大部分植物形成互惠共生改善土壤結構，促進宿主植物的生長發(fā)育，特別是還可以提高植物的抗鹽性[8-12]。植物在受到外界生物或者非生物脅迫時，其體內(nèi)原本的平衡狀態(tài)會被打破，細胞內(nèi)一系列針對脅迫作出的防御反應會隨著體內(nèi)活性氧含量的上升而展開，其中酶類抗氧化系統(tǒng)能有效地降低脅迫環(huán)境對植物的傷害從而起到保護植物的作用[13]。相關研究也表明，接種AM真菌不僅能夠提高植物的抗鹽性，增強宿主葉片的光合作用，同時還能夠增加游離氨基酸類等氮源的積累，這既能夠進一步加強體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)又可以通過這種方式來加強鹽堿脅迫解除時葉綠體或其他有機物的合成[14-16]。

以往有關星星草的研究，只關注了在不同鹽堿濃度處理下AM真菌對星星草自身體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)這三大抗氧化酶活性的影響[17]。本研究擬通過對抗壞血酸過氧化物酶(ASA-POD)、谷胱甘肽還原酶(GR)、蔗糖合成酶(SS)活性以及游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)的研究，進一步從生理水平上揭示星星草-AM真菌共生體應答鹽堿逆境的機制，為利用菌根技術進一步提高星星草的耐鹽能力，改良與恢復退化松嫩鹽堿草地提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2016年從松嫩鹽堿草地將星星草種子采回并進行保存。從北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所及石河子大學綠洲農(nóng)作物病害防控重點實驗室購回摩西球囊霉(Funneliformismosseae)和根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusintraradices)2種AM真菌接種物，包含菌根片段、真菌菌絲和孢子等，孢子量約為18個·g-1。有機草炭、蛭石、腐殖酸等購自黑龍江省哈爾濱市花卉市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計及盆栽

將購回的基質(zhì)土按V(泥炭)∶V(珍珠巖)∶V(園藝蛭石)=1∶1∶1的比例配置，置于高壓滅菌鍋中，121 ℃、240 kPa滅菌2 h，在各花盆(18 cm×18 cm)中均勻放置經(jīng)高溫高壓滅菌的基質(zhì)土，精確稱取R.intraradices、F.mosseae各25 g并均勻混于2 cm表層基質(zhì)中，未接種的則將滅菌后的2種真菌均勻混于表層2 cm基質(zhì)中。將拌有R.intraradices、F.mosseae以及對照CK分為3組并分別用托盤盛裝及浸盆，待盆內(nèi)表層土濕潤后均勻播種。播種前星星草種子先經(jīng)0.01% KMnO4溶液消毒，再用無菌水沖洗干凈并浸泡24 h。待均勻播種后覆蓋適當基質(zhì)保墑，以促進種子萌發(fā)。種子發(fā)芽前適時適量澆水，以浸盆為主，既可以有效保持基質(zhì)濕潤又可以防止沖散種子。待種子萌發(fā)后根據(jù)基質(zhì)濕潤程度適量適時補充水分，在東北林業(yè)大學園林學院植物光照培養(yǎng)室內(nèi)進行植物培養(yǎng)。播種35 d后，每周定期澆灌30 mL Hoagland營養(yǎng)液1次。80 d后開始進行100 mL的脅迫處理，處理周期為10 d，非脅迫組則用蒸餾水代替,設置100、200、300、400 mmol·L-1NaCl和NaHCO3處理溶液，分別澆灌到R.intraradices、F.mosseae以及對照CK，共27組處理，每組處理3次重復。

1.2.2 菌根侵染率的測定

從基質(zhì)中挖出星星草并清除粘連在根部的泥土，可用清水將其沖洗干凈，注意水流速度的控制以免損壞根部。根部清理干凈后，準確剪取1 cm保存于FAA固定液(90 mL 70%酒精；5 mL冰醋酸；5 mL 38%甲醛)中，如若長期使用可存放于冰箱中(4 ℃)。按照《菌根學》[18]測定菌根侵染率、侵染密度、叢枝豐度、泡囊豐度。

1.2.3 生理指標的測定

抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶以及蔗糖合成酶活性測定均以星星草葉片為材料并運用比色法測定，游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)采用水合茚三酮比色法測定[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

菌根侵染率采用MYCOCALC軟件計算。利用SPSS軟件對侵染率、侵染密度、泡囊豐度、叢枝豐度以及生理指標進行Duncan’s單因素方差多重比較分析，差異顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫下AM真菌對星星草菌根侵染指標的影響

由表1可見，無論鹽脅迫濃度高低，接種F.mosseae或R.intraradices處理都可以達到100%的根系侵染率。接種F.mosseae處理的星星草根系在100 mmol·L-1鹽濃度脅迫時叢枝豐度比無脅迫時增加了3.52%；在其他濃度脅迫下，泡囊豐度以及根系侵染密度都隨著鹽濃度的上升呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢；其中在200 mmol·L-1處理時泡囊豐度與根系侵染密度下降值最大，減少量分別達11.70%和14.80%；300 mmol·L-1脅迫時叢枝豐度減少量最大，為3.62%。而接種R.intraradices處理的星星草根系叢枝豐度、泡囊豐度與根系侵染密度呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，均在100 mmol·L-1處理時達到最大增量；之后在200 mmol·L-1處理時，泡囊豐度出現(xiàn)最大減小值，為9.59%；而根系侵染密度則在300 mmol·L-1處理時減少量最大，為8.30%。

由表2可見，在鹽堿脅迫下，隨著濃度的升高，接種F.mosseae處理的星星草根系叢枝豐度、泡囊豐度、根系侵染密度度呈現(xiàn)下降趨勢，而接種R.intraradices處理的星星草的這3項侵染指標則先上升后下降，在400 mmol·L-1處理時這2種接種處理的根系侵染率均達到了最低值，分別為76.67%和90.00%，F(xiàn).mosseae接種處理比R.intraradices處理低13.33%。接種F.mosseae處理的星星草泡囊豐度在100 mmol·L-1處理下減小值最大，為12.71%；而叢枝豐度以及根系侵染密度都在200 mmol·L-1脅迫時減少量最多，分別為2.98%與12.06%。接種R.intraradices處理的星星草的3項侵染指標都在100 mmol·L-1處理時達到最大值；之后，隨著處理濃度升高分別下降，其中叢枝豐度與泡囊豐度在200 mmol·L-1處理時下降的最多，根系侵染密度在300 mmol·L-1脅迫時出現(xiàn)了最大下降值，達13.57%。

表1 鹽脅迫下AM真菌對星星草菌根侵染率的影響(NaCl)

注：表中數(shù)據(jù)除NaCl濃度外，其余均為平均值±標準誤。同一接種處理下，數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(α=0.05)。

表2 鹽堿脅迫下AM真菌對星星草菌根侵染率的影響(NaHCO3)

注：表中數(shù)據(jù)除NaHCO3濃度外，其余均為平均值±標準誤。同一接種處理下，數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(α=0.05)。

2.2 鹽堿脅迫下AM真菌對星星草酶活性的影響

由表3可見，無論是脅迫還是非脅迫條件下，幾乎在所有處理中接種R.intraradices處理的星星草優(yōu)勢要強于對照與接種F.mosseae處理，并且隨著鹽堿濃度的升高，ASA-POD活性是先升高后降低的。在無脅迫處理時，接種R.intraradices，星星草ASA-POD活性與未接種以及接種F.mosseae處理的差異顯著(P<0.05)。當脅迫濃度升高100 mmol·L-1時，鹽脅迫下星星草ASA-POD活性提高程度明顯高于鹽堿脅迫處理；在200 mmol·L-1濃度脅迫時活性達到最大，但只有在鹽脅迫下表現(xiàn)出差異顯著性(P<0.05)；當鹽堿濃度在200～300 mmol·L-1時，ASA-POD活性開始下降，當處理濃度達到400 mmol·L-1時，鹽堿脅迫下CK與接種真菌類型的星星草ASA-POD活性降低程度要大于鹽脅迫，并且CK與分別接種過真菌的星星草ASA-POD活性呈差異顯著關系(P<0.05)。

由表3可見，隨著鹽堿脅迫濃度的升高，星星草谷胱甘肽還原酶(GR)的活性先升高后降低，而且接種F.mosseae與R.intraradices對星星草GR的活性影響較大，幾乎是CK組的2倍，接種F.mosseae處理的星星草GR活性幾乎全部高于接種R.intraradices處理。在未進行鹽堿脅迫與100 mmol·L-1鹽堿脅迫時，接種F.mosseae與R.intraradices處理以及未接種類型星星草GR活性互為差異顯著(P<0.05)，且在100 mmol·L-1鹽處理時接種R.intraradices處理星星草GR活性增強程度最為明顯，為12.72%。當脅迫濃度為200 mmol·L-1時，星星草GR活性達到峰值，鹽處理組接種F.mosseae、R.intraradices處理以及未接種類型星星草GR活性互為差異顯著(P<0.05)，而鹽堿處理組中未接種類型只分別與接種F.mosseae、R.intraradices處理的星星草GR活性呈差異顯著關系(P<0.05)。當脅迫濃度在300～400 mmol·L-1時，星星草GR活性開始下降，且在這2個處理濃度下鹽處理組與鹽堿處理組中未接種類型星星草GR活性分別與接種F.mosseae、R.intraradices真菌類型星星草GR活性呈差異顯著關系(P<0.05)。

從表3可知，星星草蔗糖合成酶(SS)活性隨著鹽堿脅迫濃度的升高，星星草SS活性除接種R.intraradices處理外都呈先增強后減弱的趨勢，在200 mmol·L-1脅迫時SS活性最強，并且只有在400 mmol·L-1鹽脅迫下接種R.intraradices處理的星星草SS活性與未接種真菌星星草SS活性差異顯著(P<0.05)。鹽處理中除未進行脅迫組外，0～400 mmol·L-1脅迫下接種F.mosseae處理的星星草SS活性要強于接種R.intraradices處理，其中在200 mmol·L-1處理時兩者的活性差值最大，前者約為后者的1.46倍，而就在此濃度脅迫下，接種F.mosseae處理SS活性增強程度也較為明顯，增強量為34.30%。在鹽堿處理組中，當處理濃度達到200 mmol·L-1時，接種F.mosseae處理的星星草SS活性增強明顯，提高了85.46%，接種R.intraradices處理的SS活性增強了49.03%。當處理濃度上升到300 mmol·L-1，接種F.mosseae處理與接種R.intraradices處理的星星草SS活性下降明顯。

表3 鹽堿脅迫下AM真菌對星星草體內(nèi)酶活性與氨基酸質(zhì)量分數(shù)的影響

脅迫類型脅迫濃度/mmol·L-1SS活性/mg·g-1·h-1未接種CK接種F. mosseae接種R. intraradices游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)/mg·g-1未接種CK接種F. mosseae接種R. intraradicesNaCl 0(209404.76±60947.38)a (314761.90±127097.87)a(328214.28±81198.76)a (0.06±1.06)a(0.07±0.22)a(0.07±0.42)a100(251666.66±105601.61)a(340119.04±153696.93)a(324404.76±155822.91)a(0.11±2.27)b(0.11±0.47)b(0.15±0.38)a200(260238.09±47110.82)a(456785.71±256290.50)a(312142.85±58626.93)a(0.21±2.33)b(0.26±0.23)a(0.28±1.59)a300(265833.33±120400.23)a(397976.19±184327.69)a(338571.42±91205.78)a(0.11±1.01)a(0.14±3.70)a(0.12±0.83)a400(265357.14±22082.29)b(369761.90±15412.41)ab(319285.71±43578.74)a(0.09±1.13)a(0.12±1.07)a(0.12±6.00)aNaH-CO30(209404.76±60947.38)a(314761.90±127097.87)a(328214.28±81198.76)a(0.06±1.06)a(0.07±0.22)a(0.07±0.42)a100(224761.90±50209.17)a(337738.09±132335.92)a(307857.14±23015.63)a(0.09±1.22)a(0.10±2.04)a(0.12±1.97)a200(295238.09±125021.59)a(626428.57±371890.68)a(458809.52±134786.45)a(0.20±9.43)a(0.27±1.09)a(0.29±2.35)a300(226904.76±31319.48)a(245833.33±108583.95)a(275000.00±142539.37)a(0.18±0.33)a(0.19±3.34)a(0.22±11.34)a400(187500.00±20237.74)a(203452.38±35928.52)a(233095.23±99780.58)a(0.09±3.06)b(0.15±0.16)ab(0.11±2.10)a

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤。同一脅迫處理下，數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(α=0.05)。

2.3 鹽堿脅迫下AM真菌對星星草游離氨基酸的影響

從表3可知，星星草體內(nèi)游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)隨著鹽堿脅迫濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，并在200 mmol·L-1脅迫時游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)達到峰值。在100 mmol·L-1鹽脅迫時，接種R.intraradices處理星星草游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)分別與接種F.mosseae處理及未接種處理差異顯著(P<0.05)，且接種R.intraradices處理的游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)比未接種的增加了1.27倍。當脅迫濃度上升到200 mmol·L-1時，只有鹽脅迫組中未接種處理游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)分別與接種2種真菌處理的差異顯著(P<0.05)。脅迫濃度提高到400 mmol·L-1時，鹽堿處理組各接種處理星星草游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)下降值要明顯于鹽處理組，且未接種處理與接種R.intraradices處理游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)差異顯著(P<0.05)。從趨勢上看，鹽脅迫下星星草游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)快速上升快速下降，而鹽堿脅迫下則是快速增加緩慢下降的。

3 結論與討論

3.1 鹽堿脅迫對AM真菌侵染率的影響

隨著鹽堿脅迫濃度的升高，不同種類的AM真菌對宿主植物的侵染率不同。接種F.mosseae處理的侵染率呈下降趨勢，而接種R.intraradices處理的侵染率先升高后降低，這說明鹽堿脅迫對不同AM真菌的生長影響是不同的。但在相關學者的研究中卻發(fā)現(xiàn)，隨著鹽堿處理強度的升高，AM真菌的侵染率呈下降趨勢[25]，這與本研究結果有一定差異，所以筆者認為可能是在對植株施加鹽堿脅迫時，某特定濃度的鹽堿溶液處理可能會影響AM真菌菌絲的形成速度，從而影響其侵染率。如唐明[20]在對AM真菌提高植物抗重金屬以及鹽堿能力的研究中發(fā)現(xiàn)，在鹽堿脅迫前用適宜濃度溶液處理接種苗8周，菌根結構在10周后開始形成，由于土壤中的鹽堿脅迫使得菌絲無法正常生長，從而迫使更多AM真菌將侵染方向轉移至植物根系，能夠有效地加快共生體菌根的形成，這也同時說明了AM真菌菌絲的形成與鹽分關系密切。另外，水分也會影響到AM真菌的生長[21]。在相關的一些研究中也發(fā)現(xiàn)，AM真菌種類、宿主植物種類以及根系形態(tài)等因素也與侵染率有一定關系，所以具體影響AM真菌侵染率的原因還有待進一步探索。

3.2 鹽堿脅迫下AM真菌對星星草抗氧化酶的影響

植物在生長發(fā)育過程中由于電子傳遞不可避免的會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，其積累過多會導致膜系統(tǒng)的破壞以及大分子的流失，正常情況下會將體內(nèi)活性氧自由基數(shù)量保持在細胞可以忍受的狀態(tài)，而當植物受到脅迫時，體內(nèi)活性氧數(shù)量的增加則會導致細胞受到損傷。相關研究發(fā)現(xiàn)，接種AM真菌之后的星星草，無論是否在鹽堿脅迫下，其體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)這3種抗氧化酶活性都會有所提高，但是當超過某特定濃度脅迫時，星星草體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)已無法應對這種高濃度脅迫，致使這3種酶的活性開始下降[17，22-23]。本研究對鹽堿脅迫下AM真菌對星星草體內(nèi)另外兩大抗氧化酶——抗壞血酸過氧化物酶(ASA-POD)與谷胱甘肽還原酶(GR)活性影響進行了探討，無論在鹽脅迫還是鹽堿脅迫下，AM真菌都能夠明顯提高星星草體內(nèi)ASA-POD的活性，但就2種脅迫類型相比，在單純鹽脅迫下共生體ASA-POD活性提高程度要明顯高于鹽堿脅迫，而在對GR活性的研究中，這種現(xiàn)象并不明顯。這說明AM真菌對星星草抗氧化酶活性的提高能力可能因氧化酶的種類以及脅迫類型的不同而有所差異，也可能與植物種類有關。王英男等[24]對鹽堿脅迫下AM真菌對羊草生長影響的試驗表明，AM真菌對羊草體內(nèi)SOD、POD、CAT活性影響在鹽脅迫與鹽堿脅迫下差異較大，這一結果與本研究結果基本一致。其中ASA-POD與活性氧的結合能力要比CAT弱，它會協(xié)助SOD與CAT來清除活性氧，通常在ASA-GSH氧化還原這條途徑中清除活性自由基[25]。而GR主要功能則是將氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原為還原性谷胱甘肽(GSH)，通常也與ASA-POD協(xié)同作用促進脫氫抗壞血酸(DHA)的形成，而GSH與DHA也會促進活性氧自由基的分解，降低對植物危害[26]。本研究也認為，單純鹽脅迫與鹽堿脅迫對以上2種氧化酶發(fā)揮作用途徑的影響也有一定差異，針對這一問題還有待進一步探討。

3.3 鹽堿脅迫下AM真菌對星星草蔗糖合成酶以及蔗糖轉化的影響

蔗糖合成酶(SS)既能夠催化蔗糖的合成又可以催化蔗糖的分解，但普遍認為SS的作用是分解蔗糖[27]。SS的活性強弱直接或者間接影響到蔗糖轉化與代謝，細胞壁合成以及細胞分化，最后還會影響到淀粉合成，這些都與植物的抗逆性有密切關聯(lián)，植物組織中通常含有較高的SS，它能夠衡量植物的生長強度以及代謝水平。植物在生長發(fā)育過程中任何階段都需要消耗蔗糖，蔗糖積累水平的高低能夠直接反饋出逆境脅迫對植物的影響。本研究中發(fā)現(xiàn)，接種AM真菌之后星星草體內(nèi)SS活性增強，并且在低濃度鹽堿脅迫下SS活性呈現(xiàn)出上升趨勢，這說明低濃度的鹽堿刺激能夠促進SS的催化作用，但在高濃度處理下SS活性呈現(xiàn)出下降趨勢。這一結果與問雪叢[28]在鹽堿脅迫對虎尾草幼苗的糖代謝以光合作用研究中的結果一致。更值得關注的是，在鹽堿脅迫下，SS的活性提高程度要明顯強于在單純鹽脅迫下，這可能是因為在高pH的環(huán)境下，更有利于蔗糖合成酶合成蔗糖，即蔗糖合成酶在堿性環(huán)境下活性更強，而在單純的鹽脅迫下發(fā)揮作用的是蔗糖合成的逆反應，即蔗糖的分解[29]。并且在鹽堿脅迫下SS活性下降趨勢較鹽脅迫下更為明顯，可見高濃度鹽堿脅迫下，AM真菌對星星草SS活性的促進作用受到的抑制更加明顯，至于上述2種作用強度差異的原因還有待進一步的探索。

3.4 鹽堿脅迫下AM真菌對星星草游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)的影響

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是植物根系吸收與同化氮素的主要形式之一，當植物受到鹽堿脅迫時，氮素代謝也會受到抑制，致使植物無法正常生長發(fā)育，這對禾本科植物的影響非常顯著[30]。植物通過積累游離氨基酸類等有機質(zhì)增加滲透調(diào)節(jié)能力，在鹽堿脅迫下大量積累此類物質(zhì)，待鹽堿脅迫解除時還可用作葉綠素或者其他有機物的合成。相關研究表明，在鹽堿環(huán)境下，AM真菌能夠聚集大量的游離態(tài)氨基酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，并且將鹽離子積累在宿主根部，以保證植物的滲透勢，維持植物在鹽堿環(huán)境中的生存。本研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度鹽與鹽堿脅迫下，游離氨基酸的質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)出增加趨勢，但超過一定濃度后，在鹽脅迫下游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)的下降趨勢要在鹽堿濃度脅迫下的趨勢明顯，這種下降趨勢與王英男等[24]對羊草(Leymuschinensis)的研究結果相一致。有研究者認為，游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)的變化可以作為判斷植物抗鹽堿性的一種特征，游離氨基酸的積累是植物在鹽堿脅迫下的一種表現(xiàn)[31-32]。

在一定范圍的鹽堿脅迫強度內(nèi)，接種F.mosseae與R.intraradices不僅能夠有效地通過提高植物抗氧化酶活性、蔗糖轉化以及游離氨基酸的積累量來增強植物的抗鹽堿性，還能夠通過一定程度的改變土壤質(zhì)地來減少對植物體的侵害；通過侵染率以及SS活性也可看出，堿脅迫比鹽脅迫帶來的損傷程度更強。星星草是一種有利于改良鹽堿地的植物，AM真菌又是一種能夠有效提高植物耐鹽堿能力的共生真菌，對其共生體耐鹽堿能力的研究可為今后鹽堿地的改良提供科學依據(jù)。