來(lái)源于Alicyclobacillus sp.A4葡萄糖異構(gòu)酶的克隆表達(dá)及轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究

戴晨霞 曹慧方 羅會(huì)穎 姚斌 柏映國(guó) 徐波

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

高果糖漿（High fructose corn syrup，HFCS）又稱果葡糖漿，是一種主要成分為葡萄糖和果糖的液體甜味劑［1］，由玉米淀粉通過(guò)α-淀粉酶、糖化酶和葡萄糖異構(gòu)酶的作用而生成的。高果糖漿相對(duì)于蔗糖具有甜度高、風(fēng)味佳、溶解度高、價(jià)格低等優(yōu)勢(shì)［2］，因此成為目前主要的甜味劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外高果糖漿的需求量不斷增加，日本年消耗食糖總量為250萬(wàn)t左右，而淀粉糖占其中的50% 以上；美國(guó)人均食糖消費(fèi)69 kg/a，淀粉糖占38 kg/a 以上。我國(guó)由于大量外資食品企業(yè)的進(jìn)入、食品工業(yè)的快速發(fā)展以及醫(yī)藥市場(chǎng)的大量開(kāi)發(fā)，也極大地?cái)U(kuò)大了對(duì)高果糖漿產(chǎn)品的需求。

根據(jù)果糖含量，目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的高果糖漿分為三種類型：HFCS-42（含 42% 的果糖）、HFCS-55（含55% 果糖）和 HFCS-90（含 90% 果糖）［3］。這三種濃度的高果糖漿被應(yīng)用于不同的食品當(dāng)中，HFCS-42主要用于烘培食品、灌裝水果、調(diào)味品、奶制品等行業(yè)，而HFCS-55多適用于一般的甜味飲料、碳酸飲料、雪糕、冰淇淋、冷凍甜點(diǎn)等，HFCS-90最主要還是用于制得HFCS-55［4］。

葡萄糖異構(gòu)酶在體外可以將D-葡萄糖異構(gòu)化D-果糖，是商業(yè)制備高果糖漿的關(guān)鍵酶制劑。由于商業(yè)葡萄糖異構(gòu)酶效率低、不耐高溫等原因，目前工業(yè)生產(chǎn)的高果糖漿主要是HFCS-42［4-5］。HFCS-42果糖含量低，醫(yī)療和保健價(jià)值并不能得到充分發(fā)揮，且在低溫貯運(yùn)時(shí)易結(jié)晶析出，所以HFCS-42也逐漸滿足不了市場(chǎng)的需求。相比較，HFCS-55果糖含量高，甜度和功能更好，且在低溫時(shí)不易結(jié)晶，更具有商業(yè)應(yīng)用前景。但HFCS-55必須經(jīng)過(guò)HFCS-42的色譜分離濃縮成HFCS-90，再將這兩者混合制得，生產(chǎn)技術(shù)成本高［6］。正因此，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有直接生產(chǎn)HFCS-55的廠家。

提高轉(zhuǎn)化率以及轉(zhuǎn)化過(guò)程中的底物濃度（葡萄糖）是降低生產(chǎn)成本的有效途徑。已有研究表明，葡萄糖異構(gòu)酶對(duì)D-葡萄糖的轉(zhuǎn)化率與溫度有相關(guān)性［7］，因此挖掘到一個(gè)耐熱的葡萄糖異構(gòu)酶，是獲得高葡萄糖濃度下高果糖轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)55% 高果糖漿具有重大意義。

為挖掘一個(gè)在工業(yè)上制備高果糖漿具有應(yīng)用價(jià)值的酶。本研究從高溫菌株Alicyclobacillussp.A4中克隆獲得一個(gè)新的葡萄糖異構(gòu)酶基因A4GI，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，對(duì)已純化的蛋白酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征，最后對(duì)其轉(zhuǎn)化率進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其在一個(gè)高的葡萄糖濃度下能達(dá)到較高的果糖轉(zhuǎn)化率，因此具有巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillussp.A4［8］分離自云南保山地區(qū)溫泉水中，菌株及基因組保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，并已進(jìn)行全基因組測(cè)序。E.coliTrans1 克隆宿主、E.coliBL21表達(dá)宿主及克隆載體pEASY-T3都來(lái)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。pET30a表達(dá)載體保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所。

1.1.2 試劑FastPfuDNA聚合酶（北京全式金生物）、LA Taq酶（TaKaRa公司）、質(zhì)粒小提試劑盒（北京天根生物公司）、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、細(xì)菌DNA提取試劑盒（都來(lái)自O(shè)MEGA公司）、His-tag蛋白純化磁珠（蘇州海貍生物公司）、蛋白定量試劑盒（北京全式金生物公司）、核酸Marker、蛋白 Marker（均來(lái)自 Genstar）、D-葡萄糖（sigma公司）、果糖、半胱氨酸鹽酸鹽、咔唑（均來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)有限公司）、其他化學(xué)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：1% 蛋白胨，0.5% 酵母粉，1% NaCl，121℃滅菌20 min。加入1.5% 的瓊脂粉即為固體LB培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 A4GI的基因克隆與序列分析 以Alicyclobacillussp.A4基因組為模板，以A4GI-pET30a-F/R為前后引物（表 1），PCR擴(kuò)增獲得A4GI基因，將其連接到pEASY-T3克隆載體，熱激轉(zhuǎn)化至E.coliTrans1克隆宿主中，菌落PCR對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，并測(cè)序。序列經(jīng)NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）數(shù)據(jù)庫(kù)Blastn、Blastx和Blastp進(jìn)行比對(duì)與分析。再通過(guò)overlap的方法構(gòu)建表達(dá)載體，將目的基因連接到含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的pET30a載體上。主要經(jīng)過(guò)3輪PCR：第一輪PCR，以A4GI-pEASY-T3質(zhì)粒為模板，以A4GI-pET30a-F/R為引物，獲得帶有pET30a載體重疊區(qū)的A4GI目的基因片段；第二輪PCR，以pET30a質(zhì)粒為模板，以pET30a-A4GI-F/R為引物（表 1），擴(kuò)增獲得帶有A4GI重疊區(qū)的pET30a載體片段；第三輪PCR，前兩輪PCR產(chǎn)物摩爾比為1∶1，互為模板互為引物，進(jìn)行兩片段的PCR擴(kuò)增連接。第三輪PCR產(chǎn)物即為重組表達(dá)載體A4GI-pET30a，并轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主E.coliBL21。

表1 基因克隆與載體構(gòu)建所需的引物序列

1.2.2 表達(dá)與純化 將重組陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)至OD600值為0.6左右（約2-3 h）；加入終濃度為0.6mmol/L的異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），30℃，200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)5-6 h；菌液12 000 r/min離心10 min去除上清，根據(jù)菌體濕重將其重懸于適量的咪唑溶液NTA0（20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液，500 mmol/L 氯化鈉，0 mmol/L咪唑，pH 7.4）；利用冰浴超聲波破碎菌體，12 000 r/min離心10 min，上清即為粗酶液。利用鎳離子磁珠純化蛋白：將A4GI粗酶液混入裝有經(jīng)蒸餾水洗凈的磁珠的離心管中，將離心管于旋轉(zhuǎn)儀上旋轉(zhuǎn)2 h，使目的蛋白結(jié)合到磁珠上后；用3 mL 的濃度分別為40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L 和300 mmol/L的的咪唑溶液依次洗脫雜蛋白和目的蛋白（40-100 mmol/L 咪唑一般洗脫雜蛋白，200-300 mmol/L咪唑溶液一般洗脫目的蛋白）；洗脫結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)。分別將含有單一的目的蛋白洗脫液合并，并利用3 kD透析袋透析以除去咪唑。利用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.3 酶活測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：1 mol/L D-葡萄糖 50 μL，適當(dāng)稀釋的酶液 50 μL，10 mmol/L Co2+50 μL，緩沖液（磷酸鹽緩沖液 pH 7.5）850 μL，65℃反應(yīng)1 h，冰水浴終止反應(yīng)，上述反應(yīng)液稀釋20倍，吸取其中500 μL測(cè)定果糖的生成量。使用滅活的酶液作為對(duì)照。

果糖的測(cè)定：向反應(yīng)稀釋液（500 μL）依次加入H2SO4溶液（450 mL H2SO4徐徐加入190 mL水中）3 mL，1.5%半胱氨酸鹽酸鹽溶液100 μL，0.12% 咔唑酒精溶液100 μL，混勻，60℃顯色10 min，冰水浴終止反應(yīng)，于560 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得果糖的含量。

酶活定義：在酶活測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol D-果糖所需要的葡萄糖異構(gòu)酶的酶量被定義為一個(gè)酶活單位，用U表示。

1.2.4 重組A4GI的酶學(xué)性質(zhì)

1.2.4.1 最適溫度、最適pH與穩(wěn)定性 最適溫度測(cè)定：在磷酸緩沖液中（pH 7.5），測(cè)定A4GI在不同溫度下的酶活。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下，A4GI分別在50-80℃下反應(yīng)1 h，冰水浴冷卻，測(cè)定果糖生成量，計(jì)算酶活，確定最適反應(yīng)溫度。

最適pH測(cè)定：在之前測(cè)定的最適溫度下，測(cè)定A4GI在不同的pH緩沖液中的酶活。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下，A4GI在pH 5.0-9.0的緩沖液中反應(yīng)1 h，冰水浴終止反應(yīng)，測(cè)定果糖生成量，計(jì)算酶活，確定最適反應(yīng)pH。

溫度穩(wěn)定性測(cè)定：A4GI（含Co2+）分別在55、60和65℃下都孵育15、30 和60 min后，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系在最適溫度和最適pH 下測(cè)定剩余酶活，以初始酶活力為100%，計(jì)算出相對(duì)酶活，以確定溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

pH穩(wěn)定性測(cè)定：經(jīng)pH 5.0-13.0的緩沖液（含Co2+）稀釋的A4GI，37℃孵育1 h后，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系在最適溫度和最適pH 的下測(cè)定剩余酶活，以初始酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.2.4.2 金屬離子對(duì)酶活的影響 在酶活測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)條件下，在反應(yīng)體系中加入終濃度為0.5 mmol/L Co2+的基礎(chǔ)上，再分別加入10 mmol/L不同的金屬離子及化學(xué)試劑（K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Cr3+、Ca2+、Ni2+、Ag+、Zn2+、Fe2+、SDS、EDTA 和 β- 巰基乙醇），在最適溫度與最適pH下反應(yīng)1 h，測(cè)定酶活。以在只有Co2+時(shí)的酶活作為對(duì)照。

1.2.4.3 動(dòng)力學(xué)常數(shù) 在標(biāo)準(zhǔn)體系條件下，分別加入不同濃度的底物D-葡萄糖（10-60 mmol/L），在最適溫度和最適pH下反應(yīng)1 h，冰水浴終止反應(yīng)，測(cè)定果糖濃度，計(jì)算酶活。利用米氏方程進(jìn)行雙倒數(shù)作圖，計(jì)算出動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.2.5 轉(zhuǎn)化率測(cè)定 3 mL的反應(yīng)體系中，50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.5），0.5 mmol/L Co2+，分別在底物葡萄糖濃度為0.1、0.5、1、2和3 mol/L 下測(cè)定轉(zhuǎn)化率，在每個(gè)底物濃度下加入相對(duì)應(yīng)的足夠量的A4GI酶活單位（在葡萄糖濃度為0.1 mol/L 時(shí)，加入酶量6 U；其他濃度按比例加入相應(yīng)酶量），65℃反應(yīng)，每1 h取一次樣（100 μL），測(cè)定生成的果糖濃度，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率即為生成的果糖的量與反應(yīng)最初的底物葡萄糖的量之比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次每個(gè)組分3個(gè)平行。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆表達(dá)與序列分析

克隆獲得的重組葡萄糖異構(gòu)酶的核酸序列長(zhǎng)度為1 320 bp，編碼439個(gè)氨基酸。蛋白經(jīng)鎳離子磁珠純化后，SDS-PAGE的鑒定結(jié)果（圖 1）顯示單一組分的重組蛋白，分子量大小在45 kD左右，與理論分子量一致，表明A4GI已成功克隆、表達(dá)并純化。已純化的異構(gòu)酶經(jīng)蛋白濃度和酶活測(cè)定，其比活計(jì)算得到為1.29 U/mg。A4GI氨基酸序列經(jīng)NCBI數(shù) 據(jù) 庫(kù) Blastn（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析，其氨基酸序列與來(lái)源于Alicyclobacillus hesperidum（登錄號(hào)為EJY54601）的GI的氨基酸序列相似性為100%。與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)源于Bacilus Stearothermophilus的 GI（PDB ID：1A0D_A）相似性最高為73%，與ThermoanaerobacteriumThermosulfurigenesGI（PDB ID：1A0C_A）相似性次之，為68%。

圖1 A4GI重組蛋白SDS-PAGE 分析

2.2 酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適反應(yīng)條件及穩(wěn)定性 重組A4GI經(jīng)最適溫度、最適pH測(cè)定顯示，其最適溫度與最適pH分別為65℃與pH 7.5，在較高溫度70℃下還具有54%以上的酶活，但在75℃下幾乎失活。在pH 6.5-8.0具有69%以上的酶活，可應(yīng)用于偏酸性條件（圖 2-A，2-B）。

以未處理時(shí)酶活為100%。熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果（圖2-C）顯示，A4GI在55℃處理1 h，剩余酶活78% 以上；60℃處理1 h，剩余酶活50%；65℃處理1 h，幾乎完全失活，剩余酶活6%；說(shuō)明A4GI在55℃及其以下，可以保持穩(wěn)定的狀態(tài)。pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果（圖2-D）顯示，A4GI展現(xiàn)出寬泛的pH穩(wěn)定性，在pH 6.0-11.0的緩沖液中37℃處理1 h，保持99% 以上的酶活，相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定。

2.2.2 金屬離子對(duì)酶活的影響 當(dāng)在酶促反應(yīng)體系中不加入任何離子時(shí)，A4GI葡萄糖異構(gòu)酶的活性很低。但當(dāng)加入微量的Co2+時(shí)，酶活得到了極大的提高。酶促反應(yīng)體系中在含有Co2+離子的情況下，測(cè)定其他金屬離子對(duì)酶活的影響結(jié)果（表 2）顯示，K+也有略微激活作用（10% 以上）。Na+、Mg2+對(duì)酶活性沒(méi)有明顯的影響，酶活在10% 以內(nèi)波動(dòng)。而大多數(shù)金屬離子與化學(xué)試劑，像Fe2+、Ag+、Ni2+、Ca2+、Cr3+、Mn2+、EDTA 和 SDS 對(duì)酶 A4GI有嚴(yán)重的抑制作用，酶活在30% 以下。

2.2.3 動(dòng)力學(xué)常數(shù) 在D-葡萄糖濃度為10-60mmol/L下測(cè)定了A4GI的動(dòng)力學(xué)。動(dòng)力學(xué)參數(shù)通過(guò)米氏方程雙倒數(shù)曲線（方程式：y=26.638x+0.2669，擬合度：R2=0.997 8）計(jì)算得到，A4GI的Km、Vmax和Kcat/Km值分別為 99.8 mmol/L、3.75 μmol·min-1·mg-1和 1.87 min-1·mmol·L-1。Km值越低，表示酶對(duì)底物的親和力越高。Kcat/Km值越大，表示酶對(duì)底物的催化效率越高。

2.3 A4GI的轉(zhuǎn)化率研究

在測(cè)定不同底物濃度下A4GI的轉(zhuǎn)化率的結(jié)果如圖3所示，A4GI具有優(yōu)良的底物耐受性，在一定底物濃度范圍內(nèi)（0.1-3 mol/L D-葡萄糖），A4GI的最大轉(zhuǎn)化率隨著底物濃度的增具有升高的趨勢(shì)；底物濃度越高，反應(yīng)的平衡點(diǎn)右移，生成的果糖越多；在D-葡萄糖濃度為3 mol/L時(shí)，A4GI在第3小時(shí)達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率為52.7%。

圖2 A4GI最適反應(yīng)條件及穩(wěn)定性

表2 不同金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)A4GI酶活的影響

圖3 A4GI在不同葡萄糖濃度下的轉(zhuǎn)化率

3 討論

為了能篩選到一株具有高轉(zhuǎn)化率的葡萄糖異構(gòu)酶，本研究從Alicyclobacillussp.A4高溫菌株中分離出葡萄糖異構(gòu)酶基因，并在大腸桿菌Escherichia coliBL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。Alicyclobacillussp.A4菌株是從云南省的一個(gè)熱溫泉中分離出來(lái)的一株高溫菌。大部分來(lái)源于這株菌的酶，最適溫度基本都在55-70℃左右，像木聚糖酶［8］、β-1-4-葡聚糖酶［9］、α-半乳糖苷酶［10］等。這是首次克隆表達(dá)來(lái)自于這株菌株中的葡萄糖異構(gòu)酶，A4GI的最適溫度為65℃。大部分葡萄糖異構(gòu)酶的最適溫度都在60-80℃之間。例如，來(lái)自于Thermobifida fuscaWSH03-11的葡萄糖異構(gòu)酶被在大腸桿菌中表達(dá)，其最適溫度為80℃［11］。來(lái)自于Thermoanaerobacter thermosulfurigenes的 GI最適溫度為 65℃［12］。來(lái)自于Streptomyees olivaceoviridisE-86的葡萄糖異構(gòu)酶的最適溫度為60℃［13］。但是近幾年由于對(duì)高溫葡萄糖異構(gòu)酶的迫切需求，已有很多超高溫酶被發(fā)現(xiàn)，像通過(guò)基因挖掘的Thermoanaerobacter ethanolicusCCSD1（TEGI）葡萄糖異構(gòu)酶最適溫度為 90℃［14］。Thermotoga neapolitana5068葡萄糖異構(gòu)酶最適溫度在95-100℃之間［15］。同樣通過(guò)基因挖掘，來(lái)自于Thermus oshimai的葡萄糖異構(gòu)酶的最適溫度高達(dá)95℃［16］。雖然很多葡萄糖異構(gòu)酶的最適溫度高達(dá)90℃以上，但過(guò)高的溫度用于生產(chǎn)會(huì)消耗能源，增加生產(chǎn)成本［10］。另外，超高溫也容易使底物與產(chǎn)物熱變質(zhì)，以及在異構(gòu)化過(guò)程中產(chǎn)生更多的副產(chǎn)物［17］。本研究中經(jīng)最適pH測(cè)定后，顯示A4GI是中性酶，最適pH為7.5。這和大多數(shù)研究者的結(jié)果是相似的，來(lái) 自 于Thermoanaerobacterium saccharolyticum［18］、Actinoplanes missouriensisCICIM B0118（A）［19］、Thermoanaerobacterstrain B6A［20］、Streptomyces griseus［21］等的葡萄糖異構(gòu)酶的最適pH都是7.0-7.5之間。但在葡萄糖到果糖的異構(gòu)化反應(yīng)中，不僅溫度對(duì)果糖的產(chǎn)量有影響，反應(yīng)體系的pH也很重要。工業(yè)化應(yīng)用需要在一個(gè)微酸性的pH環(huán)境下，以減少堿性條件下產(chǎn)生的褐變反應(yīng)及副產(chǎn)物［22］。但是大多數(shù)商業(yè)的葡萄糖異構(gòu)酶的最適pH在7.5-9.0之間，并且在酸性條件下，酶活大大的下降。A4GI在pH 7.0時(shí)具有95% 的酶活，在pH 6.5時(shí)具有69% 的酶活，利用這一點(diǎn)也許可以解決上述問(wèn)題。本研究中A4GI在 55℃以下較穩(wěn)定，在其最適溫度65℃時(shí)穩(wěn)定性較低，這是因?yàn)樽钸m溫度測(cè)定是在具有底物的環(huán)境中測(cè)定的，底物的存在有助于穩(wěn)定酶的三維構(gòu)象，因此有很多酶表現(xiàn)為最適溫度高于穩(wěn)定性溫度［23-24］。A4GI熱穩(wěn)定性較低也可能是其轉(zhuǎn)化率沒(méi)有達(dá)到55% 以上的原因［7］，因此在后期實(shí)驗(yàn)中利用蛋白分子改造技術(shù)提高其熱穩(wěn)定性是有必要的。但A4GI有寬泛pH穩(wěn)定性。A4GI在pH 6.0-11.0處理1 h，仍剩余99%以上的酶活。相比較于已報(bào)道過(guò)的葡萄糖異構(gòu)酶，A4GI展現(xiàn)出很好的pH穩(wěn)定性。葡萄糖異構(gòu)酶的最適底物是D-木糖，對(duì)葡萄糖的Km值一般要比對(duì)木糖的大很多。A4GI對(duì)底物葡萄糖的Km值分別是99.8 mmol/L，低于大部分已報(bào)道的GIs， 像Thermobifida fusca［11］、Thermoanaerobacter ethanolicus［14］、Thermoanaerobacterium saccharolyticum［18］、Thermoanaerobacterstrain B6A［20］的Km值分別為 197、421、199和120 mmol/L。這表明A4GI對(duì)底物親和力高，具有工業(yè)應(yīng)用潛力。

葡萄糖異構(gòu)酶一般都需要二價(jià)金屬離子Mg2+、Co2+和Mn2+或這3種離子的組合，來(lái)獲得最大酶活。Mg2+主要起激活劑的作用，Co2+主要是穩(wěn)定酶的構(gòu)象［25］。像來(lái)源于Streptomycessp.的葡萄糖異構(gòu)酶在加入Mg2+情況下，酶活顯著提高［26］。來(lái)源于Thermoanaerobacterstrain B6A菌株中的葡萄糖異構(gòu)酶需要Mg2+和Co2+［19］。本研究中，A4GI 活性需要Co2+來(lái)激活，并且被Ca2+、Ni2+抑制。這與前人研究報(bào)道是相似的，是由于Mg2+、Co2+、Mn2+和Fe2+的金屬離子半價(jià)≤0.8?，而堿土金屬離子Ca2+、Ba2+和 Sr2+和過(guò)渡金屬離子 Hg2+、Pb2+、Ni2+、Cu2+和Cd2+的離子半價(jià)較大［27-28］。

葡萄糖異構(gòu)酶作為重要的工業(yè)酶之一，被廣泛應(yīng)用于高果糖漿的生產(chǎn)。現(xiàn)在商業(yè)的葡萄糖異構(gòu)酶因效率較低，主要用于生產(chǎn)HFCS-42，很難達(dá)到一步法生產(chǎn)HFCS-55［22］。所以到目前為止，55% 的高果糖漿的生產(chǎn)只能通過(guò)HFCS-42進(jìn)一步的純化濃縮獲得［29］，使生產(chǎn)成本居高不下。根據(jù)高溫使底物到產(chǎn)物的平衡點(diǎn)右移的原理，篩選一株嗜熱的葡萄糖異構(gòu)酶是一步法獲得55% 的高果糖漿的一種可行的辦法［7，30］。本研究立足于這一點(diǎn)，從Alicyclobacillussp.A4高溫菌株中挖掘并從它們的基因組中分離出葡萄糖異構(gòu)酶基因。在轉(zhuǎn)化率研究中，A4GI在葡萄糖底物濃度為3 mol/L 時(shí)，轉(zhuǎn)化率先升高后下降，下降的原因是因?yàn)槠咸烟堑焦堑姆磻?yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)造成的，最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到52.7%。相比于前人的報(bào)道，這是首次在高濃度底物下達(dá)到52.7% 的轉(zhuǎn)化率。賈東旭等［16］在2017年報(bào)道了來(lái)源于Thermus oshimai菌株的葡萄糖異構(gòu)酶在底物濃度為400 g/L時(shí)，85℃反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為52.16%，并且該研究作者分析可能是異構(gòu)化溫度太高而產(chǎn)生過(guò)多的副產(chǎn)物，影響了果糖的產(chǎn)量。J?rgensen等［31］也提出高溫反應(yīng)過(guò)程中一小部分葡萄糖會(huì)降解，一些副產(chǎn)物甘露糖、阿洛酮糖、酸性化合物將生成，從而使反應(yīng)體系顏色變化。來(lái)源于Thermobifida fuscaWSH03-11的葡萄糖異構(gòu)酶在45%（質(zhì)量體積比）葡萄糖底物濃度下，最大轉(zhuǎn)化率為53%［11］。來(lái)源于Streptomycessp.的葡萄糖異構(gòu)酶在較低的葡萄糖濃度下（質(zhì)量體積之比為30%），轉(zhuǎn)化率為55%［24］；該酶的最適pH是11.0，在pH 8.0時(shí)只有60% 的酶活。來(lái)源于Thermoanaerobacter ethanolicus的野生型和突變體葡萄糖異構(gòu)酶在10% 葡萄糖濃度下，轉(zhuǎn)化率分別為53.8% 和 55.4%［14］。廖承軍等［32］在 2015 年報(bào)道的Thermotoga petrophilaGI也在10% 的葡萄糖濃度下，轉(zhuǎn)化率為53.8%。這些報(bào)道中有部分葡萄糖異構(gòu)酶達(dá)到55%的轉(zhuǎn)化率，但其都是在較低的葡萄糖濃度下（低于3 mol/L 葡萄糖）測(cè)定的，且沒(méi)有關(guān)于轉(zhuǎn)化率與底物濃度之間的關(guān)系的描述。本研究結(jié)果顯示，A4GI異構(gòu)酶的最大轉(zhuǎn)化率隨著底物濃度的增加呈升高趨勢(shì)，這結(jié)果和前人報(bào)道有些不同，像來(lái)自于Thermus oshimai的GI在50-500 g/L的底物濃度下，果糖轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)［4］，這說(shuō)明A4GI具有較強(qiáng)的底物耐受性。并且A4GI在3mol/L 的葡萄糖濃度下達(dá)到52.7%的 高轉(zhuǎn)化率，不管是在高果糖漿的生產(chǎn)還是在其產(chǎn)品（干物質(zhì)為70%）形成中都能有效地減少成本。

4 結(jié)論

從Alicyclobacillussp.A4菌株中克隆一葡萄糖異構(gòu)酶基因A4GI，并成功進(jìn)行原核異源表達(dá)。對(duì)純化的重組A4GI進(jìn)行基本酶學(xué)性質(zhì)與應(yīng)用轉(zhuǎn)化率測(cè)定。A4GI最適溫度為65℃，最適pH為7.5，需要Co2+輔助異構(gòu)化反應(yīng)，在55℃ 以下及pH 6.0-11.0之間相當(dāng)穩(wěn)定，對(duì)底物葡萄糖的Km、Vmax值分別為99.8 mmol/L 和3.75 U/mg。在一定底物濃度下，A4GI轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，在3 mol/L 葡萄糖濃度下達(dá)到最高為52.7%。