鋅指蛋白6（ZBED6）研究進展

解文雅 張傳海 潘登科 賀曉云

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所國家畜禽改良研究中心，北京 100193）

鋅指蛋白6（ZBED6）作為一個新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，序列高度保守，可抑制IGF2基因的表達，促進肌肉的生長發(fā)育，降低脂肪沉積。ZBED6具有廣泛的組織特異性分布，可調(diào)控細(xì)胞的生長發(fā)育和生物大分子的合成代謝，具有多種生物學(xué)功能，本文總結(jié)了ZBED6基因的生物學(xué)特性及其生理功能的研究進展。

1 ZBED6的生物學(xué)特性

1999年，Jeon等［1］建立了歐洲野豬和大白豬的雜交系，利用該雜交系建立了瘦肉型家豬的數(shù)量性狀位點（Quatitative trait locus，QTL），研究發(fā)現(xiàn)，豬2號染色體和人11號染色體上的QTL位于胰島素樣生長因子 2（Insulin-like growth factor，IGF2）調(diào)控區(qū)，IGF2內(nèi)含子3區(qū)域發(fā)生單堿基突變（G→A）后可破壞某轉(zhuǎn)錄因子與該調(diào)控區(qū)的結(jié)合，導(dǎo)致IGF2表達水平上調(diào)3倍，進而促進骨骼肌生長，降低皮下脂肪沉積［2］。2009年，Markljung等［3］將這一未知的轉(zhuǎn)錄因子命名為ZBED6，并驗證得到該轉(zhuǎn)錄因子是哺乳動物中與肌肉生長發(fā)育密切相關(guān)的基因，成果發(fā)表于PLoS Biology，引起了人們廣泛的關(guān)注。

ZBED6位于ZC3H11A（Zinc fi nger CCCH type containing 11A）基因的第一個內(nèi)含子中［3］，起源于DNA轉(zhuǎn)座子［4-5］，ZC3H11A外顯子1上游RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合位點構(gòu)成兩者共同的啟動子，但ZBED6編碼一個與ZC3H11A完全不同的蛋白。ZBED6由2個BED結(jié)構(gòu)（即DNA結(jié)合區(qū)域）和1個hATC二聚體結(jié)構(gòu)組成，通過利用分子生物學(xué)技術(shù)對ZBED6基因進行序列測定，并推測編碼蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZBED6基因編碼區(qū)序列長度為2 943 bp，共編碼980個氨基酸，相對分子質(zhì)量為109 518.38，并預(yù)測得到ZBED6基因編碼蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)（圖1）［6］。ZBED6基因為胎盤哺乳類動物特有，序列高度保守，該序列富含賴氨酸和精氨酸，屬于核定位基因［4］，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該基因在26個物種之間具有100%相似性［7］。ZBED6具有廣泛的組織特異性分布，可調(diào)控IGF2在內(nèi)的多種基因的表達，影響基因的轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞的增殖分化，ZBED6敲低后家豬的肌肉生長速度加快、心臟增大，皮下脂肪沉積減少。

2 ZBED6生理功能研究

2.1 調(diào)控肌肉相關(guān)基因的表達

小鼠成肌細(xì)胞來源于C2C12細(xì)胞，對C2C12細(xì)胞進行染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation sequence，ChIp-seq）測序后發(fā)現(xiàn)有2 500個ZBED6結(jié)合位點［3］，為研究ZBED6調(diào)控靶基因表達的作用機制，Jiang等［7］利用小干擾RNA（Small interfering RNA，si-RNA）技術(shù)沉默小鼠肌原細(xì)胞中ZBED6的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF2表達水平上調(diào)，利用組學(xué)分析ZBED6下游靶基因，發(fā)現(xiàn)差異表達基因可分為3類：與肌肉蛋白、收縮纖維、心臟發(fā)育以及細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白相關(guān)的基因；ZBED6可抑制細(xì)胞分化過程中肌管的形成，其機制是通過抑制IGF2的表達，抑制myod1和Mef2c的基因活性，myod1為成肌細(xì)胞決定基因，Mef2c可影響肌內(nèi)脂肪含量以及肌纖維的類型，Mef2c還能促進肌肉相關(guān)基因的表達，因此ZBED6可抑制細(xì)胞分化過程中肌管的形成。

圖1 ZBED6基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)［6］

IGF2是重要的生長調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控機體的生長發(fā)育，ZBED6可與IGF2內(nèi)含子3區(qū)域結(jié)合，結(jié)合后可抑制IGF2的表達，為研究ZBED6-IGF2對機體生長發(fā)育的調(diào)控機制，Younis等［2］構(gòu)建了ZBED6-/-小鼠模型，相對于野生型小鼠，ZBED6-/-小鼠體重增加15%，血清中IGF2濃度增加10倍左右，肌肉中IGF2表達水平上調(diào)，即ZBED6通過與IGF2結(jié)合，抑制IGF2的表達，進而導(dǎo)致肌肉生長速度和小鼠體重發(fā)生明顯變化。

牛的生長性狀由環(huán)境和數(shù)量性狀決定位點（Quantitative trait loci，QTLs）共同決定，IGF2可影響肌肉的生長發(fā)育，ZBED6可抑制IGF2表達，為研究ZBED6在牛肌原細(xì)胞中的作用機制，Huang等研究了4種不同品系的9種組織器官中ZBED6和IGF2的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZBED6抑制IGF2活性，可促進肌原細(xì)胞的分化［8］，牛中ZBED6序列發(fā)生3個自然突變后，突變型與野生型相比體重相差10%左右［9］，也就是說ZBED6可影響機體中肌肉細(xì)胞的生長，進而導(dǎo)致體重發(fā)生明顯變化。

王丹丹等［10］利用 RNA Sequencing（RNA-seq）技術(shù)比較了ZBED6基因敲除巴馬小型豬和同日齡正常巴馬小型豬的心臟組織的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)ZBED6敲除豬的心臟重以及IGF2表達量均顯著高于對照組；RNA-seq測序結(jié)合GO和IPA分析的結(jié)果表明差異基因主要富集在免疫反應(yīng)、肌肉發(fā)育、肌動蛋白細(xì)胞骨架和RhoA通路等與肌肉發(fā)育密切相關(guān)的生物學(xué)通路，也就是說，ZBED6可調(diào)控心肌的生長發(fā)育。

2.2 調(diào)控胰島細(xì)胞的增殖分化

已有研究發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)性糖尿病大鼠Goto-Kakizaki模型中，胰腺內(nèi)缺乏IGF2/IGF1R蛋白，進而導(dǎo)致β細(xì)胞功能異常［12］，ZBED6作為IGF2抑制因子，可能與胰島細(xì)胞的增殖相關(guān)，為研究ZBED6對胰島細(xì)胞發(fā)育及其功能的影響，Wang等［4］利用siRNA技術(shù)沉默β細(xì)胞中ZBED6的表達，ZBED6表達水平下調(diào)后，IGF2表達水平上調(diào)，細(xì)胞增殖率下降，胰島素釋放量增加，進而影響脂肪和蛋白質(zhì)等生物大分子的合成/分解代謝；同時，ZBED6敲除后，與胰島細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MafA的表達水平上調(diào)，因此，ZBED6通過與IGF2、MafA發(fā)生相互作用以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄翻譯以及大分子的生物合成，進而調(diào)控胰島細(xì)胞的增殖、分化與凋亡。

2.3 調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖分化

結(jié)腸癌發(fā)展過程中，PI3K途徑的成員PIK3CA/PTEN發(fā)生體細(xì)胞突變后可促進腫瘤的生長和侵襲［8-9，11］，IGF2 過 表 達 可 抑 制 該 突 變［12］， 而ZBED6作為IGF2的抑制因子，可抑制IGF2過表達，Akhtar等［13］為研究ZBED6在人類結(jié)腸癌發(fā)展過程中的作用，敲除了人類結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO和HCT116細(xì)胞中ZBED6基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中IGF2表達量上調(diào)，RKO細(xì)胞生長速度加快，而HCT116細(xì)胞生長速度下降，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果表明差異表達基因主要與細(xì)胞增殖相關(guān)，但兩種細(xì)胞系的變化方向不同，可能是由于ZBED6在兩種細(xì)胞系中作用的靶位點不同而導(dǎo)致，通過實驗驗證得到10種基因為ZBED6直接靶基因，其中8個基因與Wnt、Hippo、TGF-β等通路相關(guān)，而 Wnt、Hippo、TGF-β三種通路均可調(diào)控細(xì)胞的增殖分化，與結(jié)腸癌的發(fā)展密切相關(guān)，即ZBED6直接參與結(jié)腸癌的發(fā)展，但ZBED6在人類結(jié)腸癌發(fā)展過程中的調(diào)控作用機制有待進一步研究。

2.4 對脂肪細(xì)胞增殖分化的影響

IGF2表達水平上調(diào)3倍左右，肌肉量增加3%-4%，背部脂肪沉積降低［2］，因此ZBED6作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控家豬體內(nèi)的肌肉含量與脂肪沉積。為研究ZBED6對脂肪細(xì)胞增殖分化的影響，Zhang等［14］敲低了小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中ZBED6基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低ZBED6組與對照組相比，脂滴大小、脂肪細(xì)胞大小以及細(xì)胞數(shù)目沒有明顯變化，與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達水平（CEBP/α、CEBP/β、CEBP/δ、FASN、PPARγ、SREBP-1）也沒有顯著性差異，以上研究結(jié)果均不能表明ZBED6/IGF2在脂肪細(xì)胞增殖分化過程中發(fā)揮作用。

對ZBED6基因的生理功能研究表明ZBED6可抑制IGF2的表達，ZBED6與靶位點結(jié)合后調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達，進而調(diào)節(jié)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子的合成/分解代謝，最終影響成肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞等細(xì)胞的增殖分化（圖2）。

圖2 ZBED6參與調(diào)控不同生命活動的機制

3 影響ZBED6調(diào)控的因素

ZBED6的結(jié)合序列為5'-GCTCG-3'，結(jié)合位點位于轉(zhuǎn)錄起始位點TSS附近5 kb以內(nèi)，結(jié)合序列發(fā)生堿基突變或基因啟動子區(qū)域的CPG島發(fā)生甲基化修飾都可以影響ZBED6與靶基因的結(jié)合（圖3）。

圖3 影響ZBED6調(diào)控作用的機制模型［3］

3.1 堿基突變

小鼠體內(nèi)實驗表明，小鼠成肌細(xì)胞中IGF2內(nèi)含子3區(qū)域以及Twist2上游區(qū)域發(fā)生單堿基突變（3-G3072A）后，ZBED6的結(jié)合序列被破壞，ZBED6作為IGF2抑制因子以及Twist2激活因子，結(jié)合序列破壞后ZBED6不能與靶基因結(jié)合，導(dǎo)致IGF2表達量上調(diào)，Twist2基因表達量下調(diào)，電泳遷移率分析（EMSA）結(jié)果表明，ZBED6不能與突變基因結(jié)合［7］。在牛體內(nèi)，ZBED6基因位于牛的16號染色體上，僅含有1個外顯子，共編碼980個氨基酸，Huang 等［15］研究了牛的8種不同組織中ZBED6的表達水平，并鑒定了ZBED6基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與基因表達和生長性狀之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉、心臟中ZBED6的表達水平較高；肌肉、脂肪組織中ZBED6的表達水平隨年齡的增長而降低；不同組織中ZBED6發(fā)生3種不同的單堿基突變（啟動子區(qū)突變-826G＞A以及編碼區(qū)的錯義突變680C＞G、1043A＞G）后，ZBED6表達水平下降，而ZBED6作為IGF2抑制因子，因此IGF2表達水平升高，牛的生長速度加快。

3.2 DNA甲基化

DNA甲基化是一種表觀遺傳學(xué)修飾，對細(xì)胞生長發(fā)育起著重要的作用，位于基因啟動子區(qū)域的CPG島發(fā)生甲基化后可影響基因的表達，一般情況下與基因沉默相關(guān)［16］。Huang等［17］研究了牛在不同發(fā)育階段，不同組織中DNA甲基化水平與ZBED6 mRNA表達水平之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝、肺、脾組織中DNA甲基化水平具有明顯差異，而且在DNA甲基化水平高的組織中，ZBED6 mRNA表達水平較低；同時隨著年齡的增長DNA甲基化水平降低，ZBED6表達水平隨之升高，DNA甲基化可調(diào)控ZBED6基因的轉(zhuǎn)錄和表達，肉牛中IGF2表達水平與DNA甲基化呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）［4］。

3.3 組蛋白修飾

組蛋白修飾也是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)活性及基因的轉(zhuǎn)錄活性，進而影響細(xì)胞的生長發(fā)育。Jiang等［7］通過ChIp-seq、RNA-seq以及GO Analysis等方法分析了小鼠肌原細(xì)胞中組蛋白修飾情況與基因表達水平之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低ZBED6基因的細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比，組蛋白修飾發(fā)生了明顯變化，ChIp-seq結(jié)果表明H3K4me3/H3K4me2/H3K27ac（H-組蛋白，K-賴氨酸，me-甲基化，ac-乙酰化）等組蛋白修飾在ZBED6結(jié)合位點處有顯著性富集，影響ZBED6與靶基因的結(jié)合，即高水平H3K4me3/H3K4me2/H3k27ac等修飾有助于ZBED6的結(jié)合。

3.4 回文序列

回文結(jié)構(gòu)是指雙鏈DNA中含有一段結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列，當(dāng)雙鏈解開時可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)有利于DNA與特異性結(jié)合蛋白結(jié)合，Jiang等［7］研究了ZBED6結(jié)合序列中的回文結(jié)構(gòu)對ZBED6與靶基因結(jié)合的影響，在ZBED6與Twist2的結(jié)合序列中構(gòu)建一段回文序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Twist2基因表達水平下調(diào)，而小鼠成肌細(xì)胞中ZBED6作為Twist2激活因子，當(dāng)結(jié)合序列中含有回文結(jié)構(gòu)時可抑制靶基因的表達，因此結(jié)合序列中是否具有回文結(jié)構(gòu)可決定ZBED6作為抑制因子或激活因子。

4 ZBED6基因在動物育種中的應(yīng)用

豬肉是膳食中蛋白質(zhì)的主要來源，在我國國民經(jīng)濟中占有重要地位，現(xiàn)今利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備瘦肉型豬是遺傳育種領(lǐng)域的研究熱點。1999年，Pursel等［18］建立了在骨骼肌中過表達IGF-1的轉(zhuǎn)基因豬模型，相對于野生型豬，轉(zhuǎn)基因豬的瘦肉率升高，體脂率下降。2014年，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)利用基因同源重組技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備了肌肉抑素（Myostatin，MSTN）敲除豬以及卵泡抑素（Follistatin，F(xiàn)ST）肌肉特異性表達的轉(zhuǎn)基因豬，與野生型相比，MSTN+/-轉(zhuǎn)基因豬的瘦肉率顯著增加1.04%，體脂率降低4.46%；FST過表達轉(zhuǎn)基因豬的瘦肉率增加3.77%，兩種轉(zhuǎn)基因豬都促進了骨骼肌的發(fā)育、降低了脂肪沉積，為通過基因修飾的方法培育優(yōu)良的畜禽品種提供了參考和借鑒［19］。ZBED6作為一個新發(fā)現(xiàn)的與肌肉生長發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，北京畜牧獸醫(yī)研究所利用CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)構(gòu)建了敲除ZBED6瘦肉型豬的動物模型，與對照組相比瘦肉率顯著提高，機體各部位的脂肪含量顯著降低，為我國培育優(yōu)良瘦肉型豬的品種作出了貢獻［20］。

2017年，黨云龍［6］以遼寧絨山羊為研究對象，發(fā)現(xiàn)ZBED6基因可調(diào)控肌肉的生長發(fā)育，并且在不同組織中存在差異性表達和DNA甲基化修飾，而這些差異表達基因與肌肉細(xì)胞的生長分化以及代謝有著重要的關(guān)系，這也為遼寧絨山羊的育種工作提供了理論依據(jù)。

利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建ZBED6敲除/過表達的動物模型，通過組學(xué)研究得到ZBED6下游靶基因以及下游調(diào)控通路，進而明確ZBED6在機體內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用的作用機制，為瘦肉型動物培育作出貢獻。

5 總結(jié)與展望

ZBED6作為一個嶄新的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，僅存在于哺乳動物體內(nèi)，對機體的生長發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。ZBED6通過與IGF2結(jié)合影響IGF2的表達水平，進而調(diào)控脂肪、蛋白質(zhì)等大分子的合成/分解代謝以及肌肉的生長發(fā)育。已有研究發(fā)現(xiàn)ZBED6可通過抑制myod1和Mef2c等基因的表達，進而抑制細(xì)胞分化過程中肌管的形成，進而導(dǎo)致肌肉的生長速度和機體體重發(fā)生明顯變化［2-3］；王丹丹等［10］利用RNA-seq技術(shù)結(jié)合GO和IPA分析發(fā)現(xiàn)ZBED6的下游靶基因主要富集在與肌肉發(fā)育、肌動蛋白細(xì)胞骨架和RhoA通路等與肌肉發(fā)育密切相關(guān)的生物學(xué)通路，即ZBED6可調(diào)控心肌的生長發(fā)育；Wang等［4］發(fā)現(xiàn)ZBED6可通過與IGF2、MafA發(fā)生相互作用以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄翻譯以及大分子的生物合成，進而改變胰島細(xì)胞的增殖、分化與凋亡。本文總結(jié)了ZBED6基因的生物學(xué)特性及其生理功能，以及在動物遺傳育種方面的應(yīng)用，為ZBED6的進一步研究提供了參考。同時，發(fā)現(xiàn)ZBED6與糖尿病和癌癥的發(fā)展過程有著密切的聯(lián)系，但是其具體的作用機制有待進一步研究。現(xiàn)今隨著世界肥胖人口的不斷增加，糖尿病的發(fā)病率不斷升高，成為威脅人類健康的重要因素。而治療糖尿病的藥物也不斷研究，噻唑烷二酮類藥物（TZDs）如羅格列酮、吡格列酮等，屬于有胰島素敏化劑，用于治療二型糖尿?。?1］，該類藥物的作用機制是通過激活過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPARγ）發(fā)揮藥效［22］，但其具有一定的副作用如促進脂質(zhì)累積［23-24］，因此新型藥物的研發(fā)迫在眉睫，而ZBED6基因與糖尿病之間存在一定的聯(lián)系，可通過研究ZBED6基因在糖尿病發(fā)病過程中發(fā)揮作用的機制，進而利用藥物或生物學(xué)手段靶向ZBED6基因，進而達到治療糖尿病的目的，從而改善人類健康。