RACE法克隆巴什拜羊SP-A基因及序列分析

王繼雪，孫延鳴

(石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003)

【研究意義】肺表面活性物質(zhì)相關蛋白A(Pulmonary surfactant-associated protein A, SP-A)是C-型凝素家族的成員之一，具親水性的一種糖蛋白，作為肺部主要的防御和免疫分子，在肺中不僅在天然免疫反應發(fā)揮著作用，而且在局部防御中也起著不可取代的作用[1]?！厩叭搜芯窟M展】周佳磊[2]等通過研究具有肺炎的普通患兒與重癥患兒血清中的SP-A表達水平，發(fā)現(xiàn)其血清中SP-A表達水平重癥患兒要明顯高于普通患兒。此外，許明峰[3]等應用基因測序技術對SP-A基因多態(tài)性與兒童支原體肺炎易感的相關性進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SP-A基因第186位堿基以及第655位堿基具有多態(tài)性且兒童易患支原體肺炎可能與該多態(tài)性相關，并且分析，可能正是由于個體的SP-A基因突變，進而影響了該個體對肺炎支原體的先天性免疫和抗病作用。黃文川[4]等研究了SP-A對大鼠肺組織的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當大鼠肺組織灌洗液中SP-A濃度下降時，肺組織損傷加重，進而得出SP-A對肺組織有明顯的保護作用。Virginia L[5]等通過對宿主防御肺部病原體的研究表明SP-A在宿主吸入病原體的初始防御中起著關鍵作用。【本研究切入點】巴什拜羊作為新疆地方的優(yōu)良品種，具有耐粗飼、生長發(fā)育快、抗病力強、早熟性好等優(yōu)點[6]。剡文亮等[7]對新疆地區(qū)綿羊肺炎支原體的染病率做了調(diào)查，結(jié)果表明不同品種的綿羊?qū)Ψ窝字гw的感染與發(fā)病有明顯的差異，巴什拜羊在臨床上很少發(fā)生綿羊支原體肺炎。目前對SP-A基因的研究在小鼠、家豬和人上比較集中，而對于巴什拜羊SP-A基因的研究報道在國內(nèi)外還尚未出現(xiàn)?！緮M解決的關鍵問題】把新疆巴什拜羊作為本研究的研究對象，克隆巴什拜羊SP-A基因的cDNA全長并對其序列進行分析，為巴什拜羊SP-A基因的載體的構建、蛋白的表達以及生物學功能的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

巴什拜羊5只，均在塔城地區(qū)巴什拜羊繁殖基地購買。

1.2 主要試劑

Trizol (Invitrogen)、LATaq酶(TaKaRa)、TAKARA SMARTer? RACE 5’/3’Kit Protocol-At-A-Glance試劑盒及pMD18-T載體(TaKaRa)均購自寶生物工程(大連)有限公司。Trans2K DNA Marker K189購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司， 薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。大腸桿菌DH5α由石河子大學動物科技學院生物化學實驗室保存。

1.3 引物設計

參考GenBank中綿羊的SP-A基因序列，又因不確定開放閱讀框以外序列，便在開放閱讀框內(nèi)用Primer5軟件設計特異性引物，5’RACE引物為GSP1：5’-GTTGTGCTTCTTCACGATGCTGGTAATGGCCTCATTCTCCT-3’；3’RACE引物為GSP2：5’-TGCTGTGCTCTTTGACCCTTAT-3’。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 總RNA提取

通過頸動脈放血屠宰巴什拜羊，無菌手術打開羊胸腔，取出肺組織并剪成小塊放入1 mL無菌無酶液氮凍存管，隨后立即放入液氮罐中保存，用液氮研磨法將肺組織研成粉末，稱重并按每100 mg組織加入1 mL Trizol，按說明書操作提取總RNA，微量紫外檢測儀測定RNA的濃度，后用2%的瓊脂糖凝膠對RNA進行電泳檢測，選用電泳條帶清晰完整且OD260/OD280為1.9～2.0的RNA用SMARTer?RACE 5’/3’ Kit Protocol-At-A-Glance反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別制備5’和3’RACE ReadycDNA。

1.5 巴什拜羊SP-A基因cDNA序列5’端的RACE擴增

把用RACE試劑盒反轉(zhuǎn)的5’RACE Ready cDNA作為模板，GSP1為下游引物，試劑盒提供的UPM(Long primer=5’-TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′；Short primer=5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)為上游引物，進行5’端RACE擴增。擴增體系為：PCR-Grade H2O 15.5μl，2X SeqAmpTMBuffer 25.0 μl，SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μl，5’-RACE-Ready cDNA 2.5μl，10X UPM 5.0 μl, GSP1 1.0 μl，Total Volume 50.0 μl。擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性35 s，72 ℃延伸3 min，5個循環(huán)；94 ℃變性35 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，25個循環(huán)；94 ℃變性35 s，69 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，5個循環(huán)，4 ℃ Store。用1 %瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，后用膠回收試劑盒將目的片段進行膠回收。把膠回收產(chǎn)物與PMD18-T載體相連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，PCR篩選陽性克隆并選取5個陽性克隆送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.6 巴什拜羊SP-A基因cDNA序列3’端的RACE擴增

3’端的 RACE 擴增體系與 5’端相同，3’-RACE Ready cDNA 為模板，GSP2 和UPM(與5’擴增所用UPM引物序列一致)為引物。擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，70 ℃退火35 s，72 ℃延伸3 min，5個循環(huán)；94 ℃變性40 s，65 ℃退火35 s，72 ℃延伸3 min，5個循環(huán)；94 ℃變性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸3 min，5個循環(huán)，94 ℃變性40 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸3 min，4 ℃ Store。用1 %瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，后用膠回收試劑盒將目的片段進行膠回收。把膠回收產(chǎn)物與PMD18-T載體相連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，PCR篩選陽性克隆并挑選5個陽性克隆送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.7 巴什拜羊SP-A基因全長cDNA序列的獲得及序列分析

用DNAMAN軟件將5’RACE和3’RACE擴增片段測序結(jié)果拼接得到SP-A基因cDNA全長，用DNAstar軟件進行理化分析，用MEGA7軟件構建氨基酸進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴什拜羊肺組織總RNA的提取

由圖1顯示，用Trizol法提取肺組織的總RNA，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠成像系統(tǒng)檢測后發(fā)現(xiàn)28S、18S和5S RNA條帶很清晰，且28S是18S的1倍以上，證明RNA完整性較好，可用于后續(xù)試驗。

圖1 巴什拜羊肺組織RNA電泳圖Fig.1 RNA electrophoresis of lung in Bashibay sheep

2.2 巴什拜羊SP-A基因5’端的RACE擴增

由圖2可以看出，以5’RACE Ready cDNA為模板，應用GSP1為下游引物，UPM為上游引物，開展5’端RACE，擴增出了657 bp條帶。

2.3 巴什拜羊SP-A基因3’端的RACE擴增

由圖3可以看出，以3’RACE Ready cDNA為模板，應用GSP2為上游引物，UPM為下游引物，開展3’端RACE，擴增出了1847 bp條帶。

2.4 巴什拜羊SP-A基因分析

如圖4所示，將SP-A基因5’端與3’端用DNAMAN軟件拼接后最終得到巴什拜羊SP-A基因的cDNA全長序列，該序列總長度為1962 bp，通過DNASTAR軟件分析，巴什拜羊SP-A基因開放閱讀框789 bp(70～858 bp)，5’非編碼區(qū)長69 bp，3’非編碼區(qū)長1104 bp且具有典型的真核生物polyA加尾信號AATAAA及polyA結(jié)構。編碼氨基酸序列如圖4灰色部分，共編碼262個氨基酸。其中有22個強堿性氨基酸(K、R)，32個強酸性氨基酸(D、E)，53個極性氨基酸(Y、N、C、S、T、Q)，72個疏水氨基酸(V、A、F、W、I、L)。堿基使用情況為A=22.81 %[180],T=20.28 %[160],C=25.35 %[200],G=31.56 %[249],不確定堿基=0.00 %[0],(A+T)=43.09 %[340]，(C+G)=56.91 %[449]。預測蛋白質(zhì)分子量為27.53kDa，等電點4.949。

圖2 SP-A基因5’端的RACE電泳圖Fig.2 5 ′RACE electrophoresis of SP-A gene

圖3 SP-A基因3’端的RACE電泳圖Fig.3 3 ′RACE electrophoresis of SP-A gene

2.5 系統(tǒng)進化分析

如表1所示，將克隆得到的巴什拜羊SP-A基因序列在NCBI網(wǎng)站進行Blast比對，結(jié)果顯示巴什拜羊SP-A基因與綿羊、山羊、藏羚羊、家牛、空齒鹿、小須鯨、羊駝、犀牛、馬、中華菊頭蝠、東北虎的同源性比較高，尤其與綿羊同核苷酸源性最高。

如表2所示，將巴什拜羊SP-A基因編碼氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站進行Blast比對，結(jié)果顯示巴什拜羊SP-A基因編碼氨基酸序列與綿羊、山羊、藏羚羊、家牛、駱駝、羊駝、野豬、家鼠、東非狒狒的同源性較高，尤其與綿羊氨基酸同源性最高。

如圖5所示，將巴什拜羊、綿羊、山羊、藏羚羊、家牛等動物的SP-A基因編碼氨基酸序列調(diào)入MEGA7軟件，進行進化樹分析，可清楚地看到進化樹形成了2個團簇，在巴什拜羊、綿羊、山羊、藏羚羊、家牛這個團簇中巴什拜羊與綿羊又形成對稱的合枝，表明它們在進化關系上最近，進化樹上還有獨立分離的樹枝野豬、家鼠、東非狒狒，表明巴什拜羊與它們的進化關系最遠。

3 討 論

杜智慧等[8]對巴什拜羊與其雜交羊分別人工感染MO，通過觀察所感染的羊的臨床癥狀及剖解后的肺組織學病理變化，采集并檢測羊血清中的IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-9濃度，綜合分析后最終得出巴氏拜羊可抗MO病原體感染。許明峰[3]等發(fā)現(xiàn)SP-A基因第186位堿基以及第655位堿基具有多態(tài)性，且兒童易患支原體肺炎與該基因位堿基多態(tài)性具有相關性，由此表明SP-A基因是具有多態(tài)性的。但巴什拜羊具有抗MO感染的特性是否也與SP-A基因相關位點基因的多態(tài)性有關,本次實驗通過RACE技術擴增巴什拜羊SP-A基因全長，為我們進一步研究巴什拜羊抗MO感染的特性與SP-A基因多態(tài)性是否具有相關性奠定了基礎。

圖4 巴什拜羊SP-A基因全長及編碼蛋白的氨基酸序列Fig.4 Full-length amino acid sequence and encoding protein of SP-A gene in Bashibay sheep

物種名Name of species 登錄號Accession number核苷酸同源性(%)Nucleotide homology綿羊 Ovis ariesAF076633.199.8山羊 Capra hircusXM_018042467.198.1藏羚羊 Pantholops hodgsoniiXM_005965020.196.8家牛 Bos mutusNM_001077838.294.8空齒鹿 Odocoileus virginianus texanusXM_020916532.194.7小須鯨 Balaenoptera acutorostrata scammoniXM_007177931.187.3羊駝 Vicugna pacosXM_015245555.180.4犀牛 Ceratotherium simum simumXM_004432498.282.3馬 Equus caballusXM_014733440.178.9中華菊頭蝠 Rhinolophus_sinicusXM_007095607.281.5東北虎 Panthera_tigris_altaicaXM_019749509.179.2

表2 巴什拜羊SP-A基因編碼氨基酸與不同動物的同源性

圖5 巴什拜羊SP-A基因編碼氨基酸進化分析Fig.5 Evolutionary analysis of amino acids encoded by SP-A gene in Bashibay sheep

應用RACE技術可利用低豐度轉(zhuǎn)錄本分別擴增出cDNA的3′末端及5′末端，短時間內(nèi)便可獲得目的mRNA的全長序列，又由于該技術簡單、廉價、快速，現(xiàn)已成為一種被廣泛應用的分子生物學技術[9]。近年來,越來越多的全長RNA被擴增出來，這都得益于RACE技術的應用[10]。本研究從綿羊SP-A基因的開放閱讀框內(nèi)設計特異引物，又采用靈敏高效的TAKARA SMARTer? RACE 5’/3’ Kit Protocol-At-A-Glance試劑盒，這樣便可以保證RACE方法可擴增出巴什拜羊SP-A基因，將擴增出的DNA片段測序并與SP-A基因的開放閱讀框比對可確定所擴增出的DNA片段是否為目的片段。按照RACE試劑盒說明書擴增出巴什拜羊SP-A基因的5’端和3’端后，經(jīng)測序以及DNAMAN軟件比對發(fā)現(xiàn)SP-A基因的5’端和3’端序列重合部位發(fā)生在GenBank上查到的綿羊SP-A基因開放閱讀框序列，這與當初設計引物所要達到的效果一致。

在NCBI上將巴什拜羊SP-A基因全長進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)巴什拜羊SP-A基因與綿羊(GenBank登錄號：NM_001009728.2)同源性最高，可達99.8 %。與綿羊相比巴什拜羊SP-A基因開放閱讀框也是789 bp，也編碼262個氨基酸，不同的是5’端比綿羊短11 bp，3’端比綿羊長26 bp，進一步分析差異發(fā)現(xiàn)開放閱讀框內(nèi)有2處核苷酸差異，即第198位堿基由G變成A，密碼子由ATG變成ATA，導致氨基酸由M(蛋氨酸)變成I(異亮氨酸)；第703位堿基由A變成G，密碼子由AAT變成GAT，導致氨基酸由N(天冬酰胺)變成D(天冬氨酸)。

氨基酸的突變往往會使相關蛋白的結(jié)構及其功能的發(fā)生改變[11]，由此可推想巴什拜羊SP-A基因編碼氨基酸的突變有沒有引起其相關蛋白結(jié)構或功能的變化，要證實這一點還需進一步的研究。

進化樹又稱之為系統(tǒng)樹，它是把圖表形象的畫成樹的形狀，把各類物種安放在樹的節(jié)點上，如果某些物種在進化關系上比較密切則對應的進化樹上的兩個分支節(jié)點的距離也會比較貼近。每個物種在進化樹上的分枝都有一定的長度，它是對生物遺傳距離和進化時間的一個度量[12]。以往對于進化的研究其主導思想是比較各物種之間的特征差異，特征越是相近的物種則認為它們在遺傳進化上越是貼近，但這樣得到的信息往往不可靠[13]，因此本次研究選擇使用進化樹，以SP-A基因為研究對象，通過MEGA7軟件將巴什拜羊SP-A基因編碼蛋白序列與其它同源性較高的各類動物SP-A基因編碼蛋白序列進行對比，然后構建出系統(tǒng)進化樹，這樣有了理論依據(jù)，而不是單純的憑外貌特征來判斷各物種間的進化關系，因而可以得出更科學可靠的結(jié)果。從進化樹上可以清楚的看到巴什拜羊與綿羊、山羊、藏羚羊、家牛親緣關系比較近，尤其是與綿羊親緣關系最近，與駱駝、羊駝、野豬、家鼠、東非狒狒親緣關系比較遠，尤其與野豬、家鼠、東非狒狒親緣關系最遠。

4 結(jié) 論

本研究使用RACE法首次獲得了新疆巴什拜羊SP-A基因cDNA全長序列，通過對其進行序列分析及簡單的信息學分析，發(fā)現(xiàn)巴什拜羊及與之同源性最高的綿羊SP-A基因5’端和3’端長度有所差異，進一步分析差異性在開放閱讀框內(nèi)發(fā)現(xiàn)2處堿基差異且兩處堿基差異均使得編碼的氨基酸發(fā)生改變。這使得進一步認識了新疆巴什拜羊的SP-A基因，也為后續(xù)研究中SP-A基因載體的構建、蛋白的表達、蛋白的結(jié)構功能研究以及其他相關功能的研究奠定了基礎。