貴州主栽櫻桃品種的花粉量及其低溫保存效果

仇志浪，郭凱斌，文 壯，鄧 彬，李正春，文曉鵬

(貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

【研究意義】櫻桃(Cerasuspseudocerasus)屬薔薇科(Rosaceae)，李亞科(Prunoideae)，櫻屬(Cerasus)果樹，因其外觀鮮艷、味道鮮美，富含多種維生素，營養(yǎng)豐富，且成熟時間較早，有“早春第一果”的美譽[1]，深受人們喜愛，種植的經(jīng)濟效益顯著。根據(jù)聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織(FAO)數(shù)據(jù)顯示，2012年全球有記錄的櫻桃種植面積達401 656 hm2，比2010年增加4.2 %，世界各國櫻桃種植面積所占比例發(fā)生變化[2]。全球櫻桃種植面積廣，需求量大，尤其是中國大陸，需大量進口，供不應(yīng)求。據(jù)統(tǒng)計，中國的櫻桃2016年產(chǎn)量激增約30 % (7.0萬t)，達32.0萬t。進口方面，2016 年中國大陸進口櫻桃總量稍有增加，達9.5萬t，香港進口8.0萬t，臺灣進口1.0萬t，總進口量達18.5 萬t，占世界櫻桃貿(mào)易的44.9 %[3]。因此，對櫻桃研究的進一步加深，使其產(chǎn)量提高，對減少進口、增加經(jīng)濟收入具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】花粉萌發(fā)率的高低會影響花粉授精，進而影響坐果，故櫻桃的產(chǎn)量與花粉萌發(fā)率密切相關(guān)。低溫和干燥的環(huán)境下，代謝過程減弱且呼吸作用降低，能較長時間保持花粉活力。隨貯藏時間的延長，花粉貯藏物質(zhì)消耗過多，酶活性下降，水分過度缺乏，從而使活力下降[4]。低溫保存可適當延長花粉壽命，但活力仍會下降，超低溫可長時間保持花粉活力[5]。目前已在扁桃[6]、獼猴桃[7]、澳洲堅果[8]、楊梅[9]、梨[10]、桃[11]等多種果樹中已經(jīng)成功實現(xiàn)超低溫保存花粉。但在櫻桃上研究較少，且只設(shè)置了3種溫度[液氮(-196 ℃)、-80 ℃及-20 ℃]進行保存，不具有代表性[12]?！颈狙芯壳腥朦c】櫻桃大多自交不親和[13]，花期易遭受不良氣候影響，導(dǎo)致落花落果現(xiàn)象嚴重，配制授粉樹、花期放蜂等方法可增加授粉機會；但因某些品種間花期不相遇，需對花粉進行保存來完成人工授粉。按照保存時間的長短，花粉保存方法可分為：短期保存(當年)和長期保存(次年)，但不同果樹花粉的保存方式存在一定差異，如扁桃與獼猴桃所需最好保存溫度就存在差異[6-7]。而櫻桃花粉保存方法比較的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，為找出較適保存方法，筆者等以貴州主栽櫻桃品種為試驗材料，比較各品種的花粉量，并以中國櫻桃“黑珍珠”為材料，從干燥時間、保存方法、預(yù)凍及解凍方式等方面篩選適合櫻桃花粉保存的最優(yōu)方法，旨在為櫻桃的人工授粉及雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以貴州主栽的中國櫻桃“黑珍珠”、“瑪瑙紅”和甜櫻桃“黑珍珠”、“斯帕克里”、“桑提娜”“布魯克斯”為材料，測定各櫻桃的花粉量和花藥量。

以中國櫻桃品種“黑珍珠”大花蕾期的花朵為材料，測定不同預(yù)凍和解凍方式、不同干燥時間、不同保存方法條件下的花粉萌發(fā)率。

以中國櫻桃品種“黑珍珠”小花蕾期(A)、大花蕾期(B)、全開放期(C)的花朵為材料，測定不同發(fā)育時期的萌發(fā)率。

小花蕾期材料：直徑4～6 mm，花朵緊實；大花蕾期材料：直徑7～9 mm，花朵膨脹充分，即將展開的；全開放期材料：直徑18～25 mm，花朵充分開放。

1.2 試驗方法

1.2.1 花藥量和花粉量的測定 花藥量的統(tǒng)計：隨機從同一植株挑選5個大花蕾期的花朵，以每個花蕾的花藥為單位，統(tǒng)計單花花藥量，3次重復(fù)，共3個植株，15個花蕾。

花粉量的統(tǒng)計采用纖維素酶法：分別取10粒完整的花藥放入1.5 mL離心管中，于25 ℃溫箱烘干，使其散粉，然后加入2 %的纖維素酶1 mL水解24 h，使粘連在花藥壁上的花粉粒游離下來。用渦旋振蕩器充分震蕩混勻后，取5 μl溶液于載玻片上，將載玻片置于顯微鏡下統(tǒng)計其花粉數(shù)量，3次重復(fù)。計算公式如下[14]：單花藥花粉量 (粒/花藥) = (每個載玻片上總花粉粒數(shù) × 200) /10。

1.2.2 花粉萌發(fā)率的測定 花粉萌發(fā)率的測定采用離體培養(yǎng)法，培養(yǎng)基配方為：MS培養(yǎng)基+10 %蔗糖+0.5 % 瓊脂糖+0.1g/L的硼酸[15]。方法：將培養(yǎng)基滴于凹槽載玻片上，待其凝固之后，用解剖針將花粉撒在培養(yǎng)基上[16]，放于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)并蓋上，置于25 ℃溫箱中培養(yǎng)6 h后在顯微鏡下統(tǒng)計花粉萌發(fā)率?；ǚ酃荛L度大于花粉粒直徑則記為萌發(fā)，否則記為未萌發(fā)。每處理 3 次重復(fù)，每個重復(fù)隨機選擇3個視野觀察，每個視野統(tǒng)計花粉數(shù)不少于100個。花粉萌發(fā)率的計算公式[17]：花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉管花粉數(shù)/觀測花粉總數(shù)×100 %。

1.2.3 預(yù)凍和解凍方式 將花粉分別在25 ℃下干燥0 h (A1)、2 h (A2)和4 h (A3)后，再分別做預(yù)凍處理，預(yù)凍處理方法[18]：B1，在4 ℃預(yù)凍2 h后，投入-80 ℃冰箱保存；B2，液氮速凍5 min后，投入-80 ℃冰箱保存；B3，直接投入-80 ℃冰箱保存。保存1周后將其取出，分別做解凍處理后再測定花粉萌發(fā)率，解凍方法：C1，在室溫解凍30 min；C2，自來水解凍15 min ；C3，37 ℃溫水解凍5 min 。

1.2.4 干燥和保存方法 將花粉取下，分別在25 ℃下干燥0、30、60和180 min后，將每一干燥溫度下的花粉平均分成5份，分別將其保存在室溫、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱和-196 ℃液氮條件下，在保存1、2、3、4、8及16周后測定花粉萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel對所有的花粉萌發(fā)率進行反正弦轉(zhuǎn)換。用SPSS 22.0軟件對花藥量和花粉量試驗數(shù)據(jù)進行均值和標準差計算，采用5(貯藏溫度)×4(干燥時間)×6(保存時間)及3(含水量)×3(預(yù)凍方式)×3(解凍方式)多變量數(shù)據(jù)模型進行方差分析，旨在探索出最佳預(yù)凍方式和解凍方式。對所得數(shù)據(jù)用Origin9.0作折線圖，用PhotoshopCS6軟件對花粉照片進行標記和圖像處理。

表1 貴州主栽櫻桃品種的單花花粉量

注：表中字母為最小顯著差異法0.05水平顯著性分析。

Note： Letters in the table indicate significant difference at 0.05 level.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同櫻桃品種的花粉量

從表1看出，不同品種單花花藥量存在較大差異，其中，中國櫻桃“黑珍珠”的花藥量最多，為47個/朵，顯著高于所有甜櫻桃(P<0.05)；其次為中國櫻桃品種“瑪瑙紅”(41個/朵)、甜櫻桃“斯帕克里”(39個/朵)、“黑珍珠”和“布魯克斯”(38個/朵)；“桑提娜”最少(33個/朵)。

不同櫻桃品種間花粉量存在較大差異(表1)，其中，甜櫻桃“桑提娜”花粉量最多，為3680粒/花藥；其次是甜櫻桃“黑珍珠”(3233粒/花藥)；中國櫻桃“黑珍珠”最少，為820粒/花藥。中國櫻桃的花粉量均極顯著低于甜櫻桃。甜櫻桃中“斯帕克里”的花粉量最少，與其他幾個品種間差異達極顯著水平(P<0.01)。

從每朵花來看，甜櫻桃“黑珍珠”的花粉量最多，為123 905粒/朵，其次是甜櫻桃“桑提娜”(121 629粒/朵)，中國櫻桃 “瑪瑙紅”最少(35 473粒/朵)；甜櫻桃各品種均高于中國櫻桃各品種。中國櫻桃兩品種間差異不顯著(P>0.05)；中國櫻桃的花粉量顯著低于甜櫻桃的花粉量(P<0.05)；在甜櫻桃品種中，“黑珍珠”花粉量最高，與另外幾個品種間差異達顯著水平(P<0.05)。

2.2 花粉萌發(fā)率

2.2.1 花蕾發(fā)育時期對花粉萌發(fā)率的影響 通過測定不同發(fā)育時期花蕾花粉量的結(jié)果表明，室溫保存1周后，大花蕾期花粉萌發(fā)率最高，為39.44 %，顯著高于小花蕾期花粉(26.20 %)，而全開放期花朵的花粉萌發(fā)率最低，僅25.93 %，但與小花蕾期的差異不顯著。為保證后續(xù)試驗的順利進行，所以選取大花蕾期的花粉進行后續(xù)花粉保存方法及花粉預(yù)凍、解凍方法篩選。

2.2.2 干燥時間對花粉萌發(fā)率的影響 中國櫻桃“黑珍珠”干燥處理前花粉萌發(fā)率為54.17 %，經(jīng)25 ℃干燥后花粉萌發(fā)率顯著降低，且隨干燥時間的增加花粉萌發(fā)率逐減(表2)。圖1所示，1周內(nèi)不同干燥時間下，隨保存溫度的變化，花粉萌發(fā)率影響較大，1周以后影響變小。25 ℃干燥30 min后保存效果最佳，直到第16周，干燥30 min后保存的花粉萌發(fā)率仍最高(11.40 %,表2)。但隨貯存時間的延長，干燥時間對花粉萌發(fā)率的影響逐漸降低。

2.2.3 保存方法對花粉萌發(fā)率的影響 如圖1所示，保存方法對花粉萌發(fā)率起著重要作用。無論干燥時間長短，花粉保存到第8周時，保存于室溫和4 ℃冰箱的花粉萌發(fā)率均降為0，但保存于-20、-80、-196 ℃條件下的花粉仍有萌發(fā)率。經(jīng)25 ℃干燥30 min的花粉在前2周都呈下降趨勢，在第3周時保存在-196和4 ℃的花粉萌發(fā)率有所上升，其中以4 ℃的花粉上升幅度較大。在第4周，-196和4 ℃保存條件下的花粉萌發(fā)率又開始下降，但在第4周時這2種保存條件下的花粉萌發(fā)率均高于其他3種保存條件下的花粉，而保存在室溫條件下的花粉經(jīng)過4周后，花粉萌發(fā)率降到最低。保存在-196 ℃的花粉直到第16周相對其他4種保存條件萌發(fā)率仍最高。

2.2.4 花粉含水量、預(yù)凍、解凍方式對花粉萌發(fā)率的影響 結(jié)果表明，解凍方式對花粉萌發(fā)率的影響較大，主體間效應(yīng)在0.05水平差異顯著。未經(jīng)干燥的花粉(A1)直接投入-80 ℃冰箱(B3)并在室溫下解凍30 min(C1)后測定花粉萌發(fā)率效果最佳，萌發(fā)率為17.01 %。但在37 ℃溫水解凍的花粉萌發(fā)率均為0；在不受37 ℃溫水解凍的情況下，與干燥過的花粉相比，未經(jīng)干燥的花粉萌發(fā)率相對較高，但差異不顯著(P> 0.05)。

表2 干燥時間對不同保存溫度下花粉萌發(fā)率的影響

3 討 論

對自交不親和的果樹(如蘋果[19]、杏[20]、梨[21]、櫻桃[1]等)配制授粉樹、人工授粉、花期放蜂是提高坐果率的常用手段，因此，選擇優(yōu)良品種作為授粉樹尤為重要。在花粉活力相當?shù)那闆r下，花粉量越高，授粉成功率也越高。本研究所選貴州主栽的兩中國櫻桃品種中，“黑珍珠”的單花花粉量較“瑪瑙紅”多，但差異不顯著；4個甜櫻桃品種中，以甜櫻桃“黑珍珠”的單花花粉量最多，其次為“桑提娜”，“斯帕克里”最少；中國櫻桃品種的單花花粉量顯著低于甜櫻桃品種，推測該品種間差異可能是由于其自身遺傳特性和進化程度不一所導(dǎo)致[13]。

同一植物的花粉不同發(fā)育時期其花粉活力不一，這在唐菖蒲[22]、苜蓿[23]、非洲鳳仙花[24]植物中均已得到證實。此外，在大多有關(guān)花朵不同開放狀態(tài)或發(fā)育時期對花粉活力影響的報道中，大花蕾期或開放初期花粉均表現(xiàn)出較高的萌發(fā)率[25-27]。在貴州主栽櫻桃品種中，研究結(jié)果與前人一致。小花蕾期可能是由于其花粉未完全成熟而導(dǎo)致花粉萌發(fā)率低下，而全開放期則可能是由于暴露在外界環(huán)境中時間較長，受外界環(huán)境影響較大致使其萌發(fā)率降低。因此，如需進行人工授粉，大花蕾期花粉為最佳選擇。

花粉保存溫度、含水量是花粉保存時間長短的重要因素。含水量過高，可能導(dǎo)致花粉內(nèi)部水結(jié)冰致使細胞破壞，但含水量過低則可能是細胞失水，進而會引起細胞失活。在本研究中，從干燥時間對花粉萌發(fā)率的影響看，在1周內(nèi)未經(jīng)干燥的花粉萌發(fā)率普遍最高，保存于-196 ℃萌發(fā)率最低，這可能是由于溫度過低導(dǎo)致細胞內(nèi)部水分結(jié)晶而破壞細胞結(jié)構(gòu)所致；如保存時間在1周以內(nèi)，可選擇不經(jīng)干燥，待其散粉后保存于4 ℃下即可；如保存時間較長，可經(jīng)25 ℃干燥30 min后保存于-196 ℃環(huán)境，可延長保存時間。這與獼猴桃[7]、荔枝[28]、棗[29]等種質(zhì)花粉在4 ℃、-20 ℃、液氮保存研究結(jié)果相似。即花粉超低溫保存顯著延長了花粉保存壽命，但如因條件不能達到-196 ℃，則可選擇經(jīng)25 ℃干燥30 min后保存于-20 ℃中也可延長保存時間。綜合來看，如需長期保存，在25 ℃干燥30 min較為合適。而番茄[30]、魔芋[31]等材料的花粉則無需干燥，直接投入液氮保存即可達最佳效果，這可能與物種間遺傳特性有關(guān)。在辣椒花粉的保存上，適當降低花粉含水量可以保持較高的活力[32]。而本研究中，干燥時間較長的花粉其萌發(fā)率也有所降低，這可能是由于物種間花粉內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不一所致，如細胞內(nèi)的結(jié)合水含量少，則會導(dǎo)致細胞過度失水而降低活力，因此應(yīng)適當減少干燥時間。在花粉整個保存過程中，偶爾會出現(xiàn)后期花粉萌發(fā)率高于前一時期的花粉萌發(fā)率，這在其他的物種中也時常發(fā)生，但其原因目前尚不清楚[33]。

a，b，c，d分別代表在25 ℃條件下干燥0、30、60和180 min后保存不同時間的結(jié)果a，b，c and d represent the results of storing at different times after being dried at 25 ℃ for 0，30，60 and 180 minutes respectively圖1 25 ℃下干燥不同時間后保存方法和保存時間交互作用下的花粉萌發(fā)率Fig.1 Interactive effect of storage methods and storage time on pollen germination rates after drying at 25 ℃

除保存方法外，預(yù)凍和解凍的效果因植物種類和花粉含水量的不同而有較大差異[34]。在甘藍型油菜中，經(jīng)變溫預(yù)凍處理后液氮保存的花粉，逐步解凍法使花粉萌發(fā)率保持最高[35]。而在不同保存方式對扁桃花粉保存效果的影響研究中[6]，解凍方式以35 ℃解凍70s效果最好。本研究中，花粉在室溫下解凍30 min后的萌發(fā)率相對較高，而在37 ℃水浴解凍5min的花粉全部喪失活力，這可能是由于解凍溫度較高導(dǎo)致花粉出現(xiàn)破裂，進而導(dǎo)致花粉萌發(fā)率的喪失。比較分析顯示，直接放入-80 ℃進行保存的花粉萌發(fā)率較高，這與唐菖蒲[22]的研究結(jié)果類似。

4 結(jié) 論

綜上所述，如在1周內(nèi)需對櫻桃進行人工授粉，可選擇處于大花蕾期取粉，然后保存于4 ℃；如需大于1周的長期保存，則應(yīng)將花粉經(jīng)25 ℃干燥30 min后，保存于-196 ℃，且在使用前應(yīng)室溫解凍30 min后，方可達到最佳效果。