牛肉及其中式加工品中豬肉成分的定性、定量檢測方法研究

朱揚，劉永峰，魏燕超，申倩，王一凡

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牛肉及其中式加工品中豬肉成分的定性、定量檢測方法研究

朱揚，劉永峰，魏燕超，申倩，王一凡

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710062）

【目的】建立牛肉及中式加工品中豬肉成分的定性、定量檢測方法，保障牛肉產(chǎn)品的純正性?！痉椒ā刻崛∝i肉及不同加工豬肉制品中的豬基因組DNA，通過DNA質(zhì)量檢測，PCR擴增，靈敏度試驗，分析加工方式對豬DNA質(zhì)量、靈敏度和檢測限的影響；制備生牛肉和經(jīng)干、蒸、煮、燉、煎、炸、烤制處理的牛肉制品中摻入不同比例（10%、5%、1%、0.1%）豬肉的二元混合肉，進行普通PCR和熒光定量PCR定性定量檢測，探索DNA在摻假鑒別中的應(yīng)用?！窘Y(jié)果】不同加工方式下豬DNA質(zhì)量檢測結(jié)果顯示，不同加工方式顯著影響DNA純度（＜0.05），生豬肉及7種豬肉制品中DNA純度（A260nm/A280nm）范圍為1.893—1.977，高于理論值1.8；DNA含量范圍為110—277 μg·g-1，經(jīng)加工處理的豬肉制品的DNA含量顯著高于生豬肉處理組（＜0.05）；瓊脂糖電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，放置6個月后生豬肉和7種肉制品的DNA嚴(yán)重降解，但生豬肉依然能獲得一些不清晰的長片段DNA，而7種肉制品的豬DNA全部降解為小片段DNA，說明長時間放置和熱處理明顯影響了豬DNA的完整性；豬肉制品中DNA的降解雖然嚴(yán)重，經(jīng)普通PCR擴增線粒體基因，所有樣品的PCR產(chǎn)物均呈現(xiàn)為清晰且單一的條帶，可見從加工肉制品中提取的DNA可以開展靈敏度試驗和摻假檢測試驗；靈敏度試驗結(jié)果顯示普通PCR是高度敏感的，經(jīng)10倍梯度稀釋，8個試驗組樣品中提取的豬DNA最低檢測限均為0.005 ng；熒光定量PCR擴增豬DNA所得Ct值形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線也具有良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率處在-3.1—-3.7，決定系數(shù)2值均大于0.99，PCR擴增效率處在89%—100%，且定量PCR最低能夠檢測出0.005 ng的豬DNA。摻假樣品定性定量PCR檢測結(jié)果顯示，除炸制混合肉（為1%）外，混合生肉及其他6種混合肉制品的定性檢測試驗最低檢測限均為0.1%，說明普通PCR可檢測微量的豬肉成分；混合肉的定量試驗中根據(jù)不同摻假比例所建立的8個試驗組標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)2＞0.99，斜率為-3.1—-3.6，各曲線均具有良好的線性關(guān)系，可以實現(xiàn)牛肉中豬肉成分的定量檢測；對比生肉與肉制品的定量結(jié)果，混合生肉與混合肉制品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距之間存在約0.01—0.6個循環(huán)數(shù)的差異?！窘Y(jié)論】不同加工處理能夠顯著影響肉中DNA的含量、純度和完整性，但不影響肉制品中DNA的檢測限和靈敏度，普通PCR和定量PCR均可以檢測到極微含量的摻假肉成分?？梢姡赑CR技術(shù)的檢測方法靈敏度高、速度快、特異性強，定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線有較高的線性相關(guān)性和擴增效率，可為肉類行業(yè)質(zhì)量控制和檢驗計劃以及驗證標(biāo)簽聲明提供可靠的依據(jù)，可應(yīng)用于一些商業(yè)樣品，以保證肉制品的純正性。

牛肉；豬肉；加工工藝；PCR；定性定量；靈敏度

0 引言

【研究意義】近年來，食品行業(yè)的欺詐行為引起了人們對健康問題的關(guān)注。食品欺詐是指對食品配料或食品包裝，標(biāo)簽，生產(chǎn)信息或產(chǎn)品進行故意的替代、添加、篡改或虛假陳述，以獲得可能影響消費者健康的經(jīng)濟利益[1]。而肉類摻假主要是由低價值的肉類替代了高營養(yǎng)、高價值的肉類，添加未申報的物種或用植物蛋白質(zhì)代替肌肉蛋白質(zhì)[2]。除了經(jīng)濟問題外，人們對于肉類摻假所造成的健康問題的關(guān)注度也逐步增長[3-4]。由于制假產(chǎn)品人們在宏觀方面不易辨別，因此，需要一種科學(xué)準(zhǔn)確的方法對市面上的樣品進行鑒定，為執(zhí)法機關(guān)在打擊制假的時候，提供確鑿的證據(jù)[5]。【前人研究進展】目前已經(jīng)提出了幾種分析技術(shù)來鑒定混合樣品中的肉類物種，其中包括基于蛋白質(zhì)的方法，如高效液相色譜法，電泳技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測定[6]。這些方法在應(yīng)用于加工肉類時是不精確的，因為蛋白質(zhì)在加熱，加壓和脫水過程中會發(fā)生變性，且基于蛋白質(zhì)的測定法，在交叉反應(yīng)影響下，區(qū)分密切相關(guān)的物種時不夠敏感[7-9]?；贒NA的PCR擴增序列分析可以使用線粒體或核基因DNA，與蛋白質(zhì)相比，DNA更加穩(wěn)定和特異，而且相對容易獲得，這意味著它是分子檢測方法的一個很好的選擇。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基于其速度，靈敏度，簡便性和可靠性，已經(jīng)發(fā)展成為一種成熟的食品摻假檢測技術(shù)[10-11]。因此，PCR是理想的加工肉類和肉類產(chǎn)品的物種鑒定方法。而SYBR Green I實時PCR檢測法不需要單獨的設(shè)計探針，是最簡單，最便宜和最直接的熒光系統(tǒng)[12]。2015年，Hou等[13]使用多重PCR技術(shù)建立了檢測雞鴨鵝DNA的方法；Iwobi等[14]建立了一種用于定量肉中牛肉和豬肉分量的多重實時PCR方法。林彥星等[15]和劉岑杰等[16]建立了肉制品中鴨源性成分的實時熒光PCR檢測方法；張國華[17]建立了基于實時熒光PCR定量檢測肉制品豬源性成分的研究方法?！颈狙芯壳腥朦c】大多數(shù)研究都是基于不同物種鮮肉樣品的摻假研究，關(guān)于深加工肉品的定量摻假檢驗的靈敏度和檢測限研究較少，針對熱加工肉樣的定量摻假研究更是鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用干、蒸、煮、燉、煎、炸和烤等方法處理牛肉和豬肉，提取生豬肉及不同加工豬肉制品中的豬基因組DNA，通過DNA質(zhì)量檢測、PCR擴增、靈敏度試驗，分析加工方式對豬DNA質(zhì)量、靈敏度和檢測限的影響；制備生牛肉和經(jīng)干、蒸、煮、燉、煎、炸、烤制處理的牛肉制品中摻入不同比例（10%、5%、1%、0.1%）豬肉的二元混合肉，進行普通PCR和熒光定量PCR定性定量檢測，探索DNA在摻假鑒別中的應(yīng)用。從而，開發(fā)一種加工牛肉制品中豬肉成分的定性、定量檢測方法，為肉類行業(yè)質(zhì)量控制和檢驗計劃以及驗證標(biāo)簽聲明提供可靠的依據(jù)，以保證某一畜禽肉制品的純正性。

1 材料與方法

研究于2017年3月至2018年1月在陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院進行。

1.1 試驗材料及處理

本研究樣品為豬肉和牛肉，采自西安華潤萬家超市，在-20℃冷凍儲藏。試驗時取適量豬肉于4℃冰箱中解凍24 h，分割為1 cm×1 cm×3 cm的塊狀。分別對豬肉、牛肉采用張?zhí)m[18]的干制、蒸制、煮制、燉制、煎制、炸制和烤制等傳統(tǒng)中式加工方式處理，得到7種豬肉樣品和牛肉樣品。

對于單獨的豬肉樣品設(shè)置1個生肉對照組和7個加工處理組；制備干、蒸、煮、燉、煎、炸、烤制的牛肉樣品和豬肉樣品的混合肉樣，以混合的生豬肉和生牛肉作為對照組，其中每個試驗組中豬肉分別占10%、5%、1%和0.1%（w/w）的比例，最終各試驗組樣品重量為40 g。考慮到熟肉制品的摻假檢測時間不確定，我們選擇了肉制品貨架期的中間時間（6個月），對所有熟肉樣進行6個月的4℃冷藏放置，為保證時間統(tǒng)一，生豬肉和生牛肉在冰箱冷凍儲藏6個月。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：Tris Cl、NaCl、EDTA、苯酚、異戊醇、氯仿、無水乙醇、SDS，西安晶博生物科技有限公司；蛋白酶K、RNA酶、引物、TaqMan Universal PCR Master Mixture、2×Ultal SYBR Mixture、Marker DL 2000，西安勵合生物科技有限公司。

儀器：Nanodrop ND-1000分光光度計、梯度PCR儀和熒光定量PCR儀，美國熱電公司；凝膠成像儀，美國西盟公司。

1.3 肉中DNA提取

將所有肉樣用研缽研磨成粉末用于DNA的提取，將約300 mg的組織與560 μL DNA緩沖液（pH 8.0，100 mmol·L-1Tris Cl、100 mmol·L-1NaCl和5 mmol·L-1EDTA），150 μL 5% SDS、18 μL的蛋白酶K（20 mg·mL-1）渦旋使溶液充分混勻，置于56℃水浴鍋中加熱消化4 h。然后將等體積的苯酚加入到消化的細(xì)胞濃縮物中，手搖10 min，然后以12 000 r/min離心10 min，得到上清液。將上清液用等體積的苯酚﹕氯仿﹕異戊醇（體積比為25﹕24﹕1）萃取1次，用等體積的氯仿﹕異戊醇（體積比為24﹕1）萃取1次。并在37℃下用10 mg·mL-1RNA酶將RNA降解30 min，用等體積的氯仿﹕異戊醇（體積比為24﹕1）再萃取1次，在1.5 mL離心管中以12 000 r/min離心10 min，得到上清液。最后，用冰的無水乙醇沉淀DNA，用乙醇﹕水（體積比為7﹕3）洗滌1次。加入100 μL TE（pH = 8.0，1 mmol·L-1Tris Cl和0.5 mmol·L-1EDTA）以溶解DNA。

1.4 豬肉及其肉制品中DNA含量、純度、完整性和PCR擴增效果檢測

使用分光光度計，測定樣品中DNA含量，以260 nm和280 nm處的吸光度作為純度指數(shù)。將豬DNA在100 V下用1%瓊脂糖凝膠電泳40 min。電泳后，在紫外光成像分析儀下觀察凝膠檢測DNA完整性。通過PCR擴增，引物序列見表1，以驗證所有分離物中可擴增線粒體DNA的存在，為消除樣品之間DNA提取效率的差異，需要對PCR模板進行標(biāo)準(zhǔn)化處理（即每個PCR反應(yīng)的DNA模板標(biāo)準(zhǔn)化為50 ng·μL-1）。

PCR擴增條件：在94℃預(yù)變性5 min，然后在94℃變性30 s，63℃退火30 s，35個循環(huán)，72℃延伸30 s，最后在72℃總延伸10 min。PCR擴增體系：3.4 μL Mixture，引物各0.3 μL（0.3 μmol·L-1），2 μL DNA模板，加入ddH2O至10 μL，PCR產(chǎn)物在 100 V下用1%瓊脂糖凝膠電泳40 min，并在UV光下拍照。

表1 引物序列及擴增片段長度

1.5 豬肉及其肉制品中DNA的普通PCR靈敏度檢測

將豬肉及其肉制品中豬DNA按10倍系列稀釋，以檢測熱加工對豬DNA模板靈敏度的影響（范圍為1﹕1—1﹕10 000，相當(dāng)于DNA濃度為50 ng·μL-1— 5 pg·μL-1），使用上述PCR條件，在100 V下用1%瓊脂糖凝膠電泳40 min，并在UV光下拍照。

1.6 豬肉及其肉制品中DNA的定量PCR靈敏度檢測

將豬肉及其肉制品中豬DNA按照普通PCR靈敏度試驗的稀釋方法進行處理，用SYBR Green I染料進行實時PCR，測定的擴增效率和檢測限（LOD）。通過繪制實時PCR分析的Ct值與DNA濃度的對數(shù)，進行每個稀釋度的3次重復(fù)以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用以下等式從標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計算擴增效率：

擴增效率（%）= [10(-1/斜率)- 1]×100

實時PCR在兩步法熱循環(huán)條件下進行。95℃10 min，95℃循環(huán)45次、30 s和65℃ 1 min，每個循環(huán)結(jié)束時收集熒光信號。制備包含5 μL 2×Ultal SYBR Mixture，上下游引物各0.3 μL（0.3 μmol·L-1），DNA模板1 μL（50 ng·μL-1），加入ddH2O至10 μL。對于熔解曲線數(shù)據(jù)，溫度從65℃升高到94℃。

1.7 普通PCR定性檢測牛肉中摻假豬肉成分

按照上述豬肉中DNA的提取方法，對牛肉中含有10%、5%、1%和0.1%（w/w）豬肉的二元混合肉進行DNA提取，以線粒體基因為目標(biāo)基因，使用上述PCR條件進行擴增，在100V下用1%瓊脂糖凝膠電泳40 min，并在UV光下拍照。根據(jù)PCR擴增結(jié)果，對不同摻假比例的混合肉最低檢測限進行分析。

1.8 定量PCR檢測牛肉中摻假豬肉成分

分別以和18S rRNA為目標(biāo)基因和內(nèi)參基因，以混合肉的DNA為模板進行定量PCR擴增，引物序列見表1。每個二元混合肉樣品設(shè)置3個重復(fù)，使用上述定量PCR條件。為消除樣品之間DNA提取效率的差異，同樣也對模板進行標(biāo)準(zhǔn)化處理（即每個PCR反應(yīng)的DNA模板為50 ng·μL-1）。比較目的基因和內(nèi)參基因的Ct值來計算ΔCt，定量二元模型混合物中10%、5%、1%、0.1%（w/w）的豬肉。采用下述表達式構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：

ΔCt=Ct（豬肉）-Ct（內(nèi)參基因）

式中，Ct（豬線粒體基因）和Ct（豬內(nèi)參基因）分別對應(yīng)于豬和18S rRNA基因的周期閾值。

2 結(jié)果

2.1 豬肉及其肉制品中DNA含量、純度和完整性的檢測結(jié)果

2.1.1 DNA含量與純度的檢測 加工方式對豬肉樣品DNA含量和純度的影響結(jié)果見表2?；诜止夤舛扔嫷臏y定，DNA含量范圍為110—277 μg·g-1。單因素分析顯示加工方法顯著影響DNA含量（＜0.05），且經(jīng)熱加工處理的肉制品的DNA含量顯著高于生肉試驗組（＜0.05）。加工方法也顯著影響了DNA純度（＜0.05），理論上DNA純度（A260 nm/A280nm）高于1.8。試驗組中DNA純度范圍為1.810—1.977，符合理論值。

表2 豬肉及其肉制品中DNA的含量和純度

數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；不同小寫字母表示處理間差異顯著（＜0.05）

Values are expressed as mean±standard deviation;different small letters indicate significant differences at＜0.05 under different treatments

2.1.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測 凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，放置6個月后生豬肉和7種肉制品的豬DNA雖然嚴(yán)重降解，但生豬肉依然能獲得一些不清晰的長片段DNA，而7種肉制品經(jīng)長時間放置后DNA全部降解為小片段DNA，說明放置時間和熱處理會顯著影響肉制品中DNA的完整性；PCR擴增線粒體基因的結(jié)果如圖2所示，生肉組和7種不同加工處理組均可獲得清晰且單一的擴增產(chǎn)物條帶，表明豬肉及其制品中DNA雖然降解嚴(yán)重，但依然可以進行PCR擴增?？梢姀募庸と庵破分刑崛〉腄NA可以開展后續(xù)的靈敏度試驗和摻假檢測試驗。

2.2 豬肉及其肉制品中DNA的PCR靈敏度分析結(jié)果

2.2.1 豬肉及其肉制品中DNA的普通PCR靈敏度檢測 將豬DNA提取物10倍梯度稀釋，測定DNA濃度后，進行普通PCR擴增，評估普通PCR對豬DNA的檢測靈敏度，結(jié)果如圖3所示，從泳道1到用泳道5，目的條帶亮度逐漸減小，說明PCR能夠檢測到的信號隨DNA模板量的減少而減少。8個試驗組的豬DNA模板的檢測限均可達到0.005 ng，結(jié)果表明基于豬DNA的PCR測定是高度敏感的。

泳道1：生肉、2：干制、3：蒸制、4：煮制、5：燉制、6：煎制、7：炸制、8：烤制； M：DL2000 Marker

泳道1：生肉、2：干制、3：蒸制、4：煮制、5：燉制、6：煎制、7：炸制、8：烤制；M：DL2000 Marker

2.2.2 豬肉及其肉制品中DNA的定量PCR靈敏度檢測 對豬DNA進行10倍梯度稀釋，對5個數(shù)量級的DNA模板進行了定量PCR檢測，獲得的Ct值與初始DNA量的對數(shù)建立的8個標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。8個試驗組的閾值循環(huán)方程分別為=-3.623+24.373、=-3.4897+22.953、=-3.66+24.312、=-3.6088+ 24.948、=-3.5278+24.217、=-3.4757+20.027、=-3.2403+20.037、=-3.5283+22.607、=-3.394+ 23.298，其斜率在-3.1—3.7。標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)2分別為0.9907、0.9952，0.9914、0.9974、0.9942、0.9901、0.9928、0.9902、0.9934，2值均大于0.99，說明方程線性關(guān)系良好。經(jīng)計算PCR擴增效率分別為0.89、0.93、0.88、0.89、0.92、0.94、0.92、0.97，PCR效率范圍在89%—100%，說明具有較高的擴增效率。豬肉及其肉制品中DNA檢測的最低水平均為0.005 ng，說明熒光定量PCR在此檢驗范圍內(nèi)結(jié)果較為可靠，能夠進行下一步分析。

2.3 普通PCR定性檢測牛肉中摻假豬肉成分的結(jié)果

普通PCR定性檢測牛肉中豬肉成分結(jié)果如圖5所示，除炸制混合肉（為1%）外，混合生肉及其他6種混合肉制品的最低檢測限均為0.1%，且隨豬肉成分的減少，可以明顯的觀察到目的條帶的亮度逐漸減小。試驗表明普通PCR能夠明確的檢測到微量的豬肉成分，實現(xiàn)不同加工方式下?lián)郊贅悠返亩ㄐ詸z測。

生肉（A）、干制（B）、蒸制（C）、煮制（D）、燉制（E）、煎制（F）、炸制（G）、烤制（H）；M：DL2000 Marker，N：陰性對照；泳道1-5：50、5、0.5、0.05、0.005 ng

2.4 定量PCR檢測牛肉中摻假豬肉成分的結(jié)果

為了相對量化豬肉，基于定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化擴增效率構(gòu)建校準(zhǔn)曲線是必需的。通過ΔCt與豬肉百分比的對數(shù)建立的8個定量校準(zhǔn)曲線見圖6。8個試驗組的標(biāo)準(zhǔn)曲線均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)2分別為0.994、0.998、0.9995、0.9993、0.9991、0.9999、0.9984、0.9974，斜率在3.1—3.6。SYBR Green I定量PCR方法可以檢測出牛肉中含量為0.1%—10%的豬肉，其覆蓋至少3個數(shù)量級的線性動態(tài)范圍，與Bustin等[21]PCR試驗結(jié)果的范圍基本一致。這8個試驗組的標(biāo)準(zhǔn)曲線都可以達到相同的動態(tài)范圍（0.1%—10%）和相對定量限（LOQ），相對LOQ為0.1%（w/w）。比較生肉組和其他試驗組的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，干、蒸、煮、燉、煎5個試驗組的標(biāo)準(zhǔn)曲線比生肉組的標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距分別高0.6、0.3、0.1、0.1、0.6個循環(huán)，而炸、烤試驗組的標(biāo)準(zhǔn)曲線比生肉組的標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距分別低0.1、0.4個循環(huán)，可見生肉的標(biāo)準(zhǔn)曲線與7種肉制品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距之間存在約0.1—0.6個循環(huán)的差異，表明定量PCR 2個基因的擴增效率受熱處理的影響有一定差異。

3 討論

3.1 加工方式對豬肉及其肉制品中DNA質(zhì)量的影響

商業(yè)肉制品一般都經(jīng)過多道加工程序，肉質(zhì)的理化性質(zhì)發(fā)生很大變化，加工過程中添入的輔料和香辛料在很大程度上增加了物種檢測的難度。在深度加工過程中，高溫高壓會導(dǎo)致原料DNA變性，遭到破壞。且在DNA提取過程中殘留的酚類物質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)，從而造成假陰性，影響后續(xù)試驗的進行[22-23]。因此，從加工的肉制品中提取高質(zhì)量的DNA模板是普通PCR和熒光定量PCR測定成功的關(guān)鍵步驟[24]。

生肉（A）、干制（B）、蒸制（C）、煮制（D）、燉制（E）、煎制（F）、炸制（G）、烤制（H）

生肉（A）、干制（B）、蒸制（C）、煮制（D）、燉制（E）、煎制（F）、炸制（G）、制烤（H）；M：DL2000 Maker，N：陰性對照；泳道1-5：100%，10%，5%，1%，0.1%

本研究顯示高溫加工樣品的DNA含量明顯高于生肉樣品。加工樣品DNA的高含量可能與加工過程中高溫處理有關(guān)，由于高溫造成細(xì)胞膜通透性增加，從而使更多的DNA從個別的肌肉細(xì)胞釋放；且DNA從雙鏈到單鏈的變性會引起增色效應(yīng)，該效應(yīng)使得DNA溶液在UV光（260 nm）下的吸光度值增加，導(dǎo)致熟肉的DNA含量增加[25]。

DNA的完整性也是DNA質(zhì)量的重要參數(shù)，可直接反映DNA片段的長度，而更長的片段可能有助于PCR擴增，因為它包含更多所需的擴增區(qū)域。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示熱處理明顯影響DNA片段的完整性。有研究表明，將肉加熱到100℃及其以上，會導(dǎo)致DNA片段大小減少72%以上[26]，因此高溫會嚴(yán)重影響DNA的完整性。雖然沒有獲得完整的DNA片段，但這些樣品仍然可以用于PCR擴增。通過PCR擴增加工肉制品中所獲DNA，也可以獲得單一且清晰的PCR產(chǎn)物條帶，從而為本研究后續(xù)運用PCR技術(shù)開展摻假檢測研究奠定了基礎(chǔ)。

3.2 加工方式對豬肉及其肉制品中PCR靈敏度的影響

對于熱加工的產(chǎn)品，有研究表明高溫導(dǎo)致DNA變性，被降解為小片段，推薦使用短擴增子[26]。與單拷貝或低拷貝核DNA基因相比，短擴增子可以增加DNA擴增的可能性，提高測定靈敏度[12]。因此，本研究中優(yōu)化了PCR擴增條件，通過擴增肉中DNA，評估了熱處理對敏感度的影響。普通PCR結(jié)果顯示，加工肉產(chǎn)品受熱處理的影響較大，隨模板含量減少目的條帶亮度也明顯降低，且不同加工方式下的檢測限均可達到0.005 ng，表明靈敏度檢測可達到pg級。Kesmen等[27]試驗結(jié)果顯示，高壓蒸后豬肉檢測的靈敏度下降，而在烤熟肉制品中，靈敏度不受影響，與本研究結(jié)果基本一致，所以基于豬DNA模板的普通PCR反應(yīng)是高度敏感的，可用于肉品摻假檢測分析。

普通PCR凝膠電泳檢測的結(jié)果不直觀，而且容易產(chǎn)生假陽性[28]。與普通PCR比，實時熒光定量PCR具有準(zhǔn)確性高、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，在病原檢測、食品衛(wèi)生和物種測定等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，能有效避免交叉污染[29-30]。利用10倍連續(xù)稀釋的豬肉DNA，進行定量PCR，以Ct值為縱坐標(biāo)，以初始DNA 模板含量的lg值為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，8條標(biāo)準(zhǔn)曲線都具有良好的線性和相關(guān)性，PCR效率高。定量PCR檢測結(jié)果與Sónia等[12]的研究結(jié)果一致，靈敏度最低檢測限都達到了0.005 ng，說明該方法可用于肉制品的定量摻假檢測。

生肉（A）、干制（B）、蒸制（C）、煮制（D）、燉制（E）、煎制（F）、炸制（G）、烤制（H）

3.3 牛肉制品中豬肉成分的定性定量檢測

肉類摻假中經(jīng)常出現(xiàn)用便宜的肉類和植物蛋白替代高價值的肉類，為了經(jīng)濟和健康的原因，防止使用較不理想的肉類物質(zhì)摻入肉制品的研究是非常重要的[9]。我們使用基于DNA的普通PCR和定量PCR擴增來自線粒體基因的序列，評估熱處理對摻假樣品檢測限的影響。普通PCR定性結(jié)果顯示，除炸制（1%）外，其他試驗組的最低檢測限均為0.1%，在加工方式中，炸制具有最高的A260nm/A280nm值。然而，由紫外吸光度確定的這個結(jié)果可能由于增色效應(yīng)而被高估。因此，與其他模板相比，炸制樣品中提取的DNA產(chǎn)生的條帶較弱，經(jīng)驗證，溫度最高的炸制處理降低了由于DNA降解引起的敏感性，導(dǎo)致其擴增困難。除炸制外，其他幾種熱處理對普通PCR結(jié)果無明顯影響，方法可以應(yīng)用于肉制品的定性檢測。

與普通PCR相比，定量PCR方法的主要優(yōu)點是可以進行數(shù)據(jù)定量。為了開發(fā)一種較優(yōu)的定量方法，物種特異性和內(nèi)源性對照引物應(yīng)聯(lián)合使用。內(nèi)源性對照的使用對于定量目的至關(guān)重要，特別是當(dāng)考慮具有復(fù)雜組成的加工產(chǎn)品時。在本研究中，采用SYBR Green I染料的定量PCR方法，針對豬線粒體基因的內(nèi)源片段（149 bp）與基于18S rRNA內(nèi)參基因（140 bp）的內(nèi)源對照組合擴增，有近似相同的效率。以ΔCt值為縱坐標(biāo)，以豬肉百分比的對數(shù)為橫坐標(biāo)建立校準(zhǔn)曲線，8條校準(zhǔn)曲線均具有良好的線性關(guān)系，可以檢測和定量分析0.1%—10%線性動態(tài)范圍內(nèi)的豬肉摻假，馮震等[31]和Sónia等[12]的最低檢測限也為0.1%，與本研究結(jié)果一致。生肉與熟肉制品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距之間存在約0.1—0.6個循環(huán)的差異，因此，相比于以生肉為例去鑒定種源成分，對于復(fù)雜工藝的肉制品，更建議使用熱處理制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線去定量。

4 結(jié)論

不同加工處理能夠顯著影響肉中DNA的含量、純度和完整性，但不影響肉制品中DNA的檢測限和靈敏度。定性PCR除炸制混合肉（為1%）外，混合生肉及其他6種混合肉制品的最低檢測限均為0.1%，定量PCR的靈敏度均可達到0.1%，8種工藝的牛肉制品中均可檢測到豬源性成分。本研究建立了牛肉及肉制品中豬源性成分的定性定量檢測方法，兩種方法都表現(xiàn)出高靈敏度和準(zhǔn)確性，可應(yīng)用于保障肉制品的純正性。

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（責(zé)任編輯 楊鑫浩）

Qualitative and Quantitative Detection Methods of Pork in Beef and Its Chinese Processing Products

ZHU Yang, LIU YongFeng, WEI Yanchao, SHEN Qian, WANG YiFan

(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062)

【Objective】The objective of this paper was to establish a qualitative and quantitative detection method for pork components in beef and Chinese processed products, so as to guarantee the purity of beef products. 【Method】The pig genomic DNA from pork and different processed pork products were extracted, and then effects of processing methods on pig DNA quality, sensitivity and detection limit were analyzed through DNA quality testing, PCR amplification and sensitivity test. The raw beef was prepared, and the dried, steamed, boiled fried, stewed and roasted beef products were mixed with the binary mixed meat of different proportions (10%, 5%, 1%, 0.1%) of pork, and then the qualitative and quantitative detections of common PCR and real-time PCR were carried out. The application of DNA in adulteration identification. 【Result】The DNA quality test results of different processing methods showed that different processing methods significantly affected the purity of DNA (<0.05). The DNA purity (A260nm/A280nm) ranged from 1.893 to 1.977 in raw pork and seven kinds of pork products, which were higher than the theoretical value of 1.8. The DNA content ranged from 110 to 277 μg·g-1, and the DNA content of the processed pork products was significantly higher than that of the raw pork treatment group (<0.05); Agarose electrophoresis showed that the DNA of raw pork and seven kinds of meat products was seriously degraded after 6 months of storage, but raw pork still obtained some unclear long-segment DNA, and the pig DNA of seven meat products all degraded into small fragments of DNA, indicating that long-term placement and heat treatment significantly affect the integrity of pig DNA; although the degradation of DNA in pork products was serious, the mitochondrial genes were amplified by ordinary PCR, and the PCR products of all samples were presented as clear and single bands. It could be seen that the DNA extracted from the processed meat product could be tested for sensitivity and adulteration; The sensitivity test results showed that the common PCR was highly sensitive. The 10-fold gradient dilution showed that the minimum detection limit of pig DNA extracted from the eight test group samples was 0.005 ng. The standard curve formed by fluorescence quantitative PCR amplification of pig DNA was also formed, which had a good linear relationship. The slope of the standard curve was between -3.1 and -3.7, the coefficient of determination2was greater than 0.99, the PCR amplification efficiency was between 89% and 100%, and the quantitative PCR could be detected 0.005 ng of pig DNA. Qualitative quantitative PCR test results of adulterated samples showed that the minimum detection limit of qualitative test for mixed raw meat and other six mixed meat products was 0.1% except for fried mixed meat (1%), indicating that ordinary PCR could detect trace amounts of pork composition. In the quantitative test of mixed meat, the coefficient of determination (2) of the standard curve of eight test groups established according to different adulteration ratios was more than 0.99, and the slope was -3.1--3.6. Each curve had a good linear relationship and could realize beef with quantitative detection of medium pork components. comparing the quantitative results of raw meat and meat products, there was a difference of about 0.1 to 0.6 cycles between the intercepts of the standard curve of mixed raw meat and mixed meat products. 【Conclusion】Different processing could significantly affect the content, purity and integrity of DNA in meat, but it did not affect the detection limit and sensitivity of DNA in meat products. Both ordinary PCR and quantitative PCR could detect the micro-content of adulterated meat. It could be seen that the detection method based on PCR technology had high sensitivity, high speed and high specificity, and the quantitative detection standard curve had high linear correlation and amplification efficiency, which could provide reliable quality control and inspection plan for meat industry and verification label declaration. The results could be applied to some commercial samples to ensure the purity of meat products.

beef; pork; processing technology; PCR; qualitative quantization; sensitivity

2018-05-10；

2018-07-25

國家自然科學(xué)基金（31372288）、陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃（2016KTCL02-36）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項（GK201805002）

朱揚，E-mail：393857602@qq.com。

劉永峰，E-mail：yongfeng200@126.com