云南稻微核心種質(zhì)秈粳回交后代功能成分含量差異及評價

杜 娟，楊加珍，楊曉夢，楊 濤，李 霞，普曉英，劉建偉，曾亞文*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650223；2.云南省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，云南 昆明 650223；3.昆明田康科技有限公司，云南 昆明 650205；4.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

【研究意義】稻米是全球一半以上人口的主食。每天食用富含生物活性物質(zhì)的功能稻米有助于降低糖尿病、高血壓和其他心腦血管疾病的發(fā)病率，有益于身體健康。開發(fā)富含黃酮類化合物、抗性淀粉、γ-氨基丁酸、生物堿、維生素、鈣鐵鋅硒、膳食纖維、N-去氫神經(jīng)酰胺等成分的功能稻米既能促進現(xiàn)代營養(yǎng)醫(yī)學的進一步發(fā)展，還可提高稻米的附加值[1]。【前人研究進展】優(yōu)異育種材料匱乏、遺傳基礎狹窄是作物育種水平停滯不前的主要原因之一，構建微核心種質(zhì)及拓寬遺傳背景是解決問題的關鍵[2]。微核心種質(zhì)即核中之核，利用分子標記數(shù)據(jù)進行 DNA 水平遺傳冗余壓縮核心種質(zhì)樣本，用約 10 %最具遺傳變異的核心種質(zhì)代表整個核心種質(zhì)，能夠有效降低成本提高育種效率；并可通過比較測序進行關聯(lián)分析，實現(xiàn)基因高通量挖掘。有關大豆[3]、小麥[4]、花生[5]、玉米[6]等作物微核心種質(zhì)構建、抗病性鑒定及其種質(zhì)資源表型評價進展顯著，水稻[7-9]微核心種質(zhì)也有諸多研究，但未有功能稻米育種及評價的研究。王明明等[7]用來源于南方、華中和北方稻作區(qū)的174 份水稻微核心種質(zhì)資源對白葉枯病的抗性進行鑒定，微核心種質(zhì)在3個不同稻作區(qū)之間及秈粳亞種之間對白葉枯病的抗性反應存在明顯基因分化。Zhang等[8]用36 對SSR標記將4 310份中國稻核心種質(zhì)壓縮為189份微核心種質(zhì)，保留了70.65 %的SSR變異和76.97 %的表型變異。金銘路等[9]以來源于26個省、市的204份中國水稻微核心種質(zhì)為試驗材料，進行耐冷性鑒定及其相關性分析，結果表明發(fā)芽期、芽期、幼苗期、孕穗期的耐冷性粳稻均明顯強于秈稻?！颈狙芯壳腥朦c】培育功能稻品種有效提高糙米中功能成分含量[10]，是當前功能水稻選育的首要問題。云南是世界公認的亞洲栽培稻秈粳亞種分化中心[11]，也是中國稻種最大的生態(tài)多樣性中心和優(yōu)異種質(zhì)功能稻米資源的富集中心，經(jīng)過長期的人工選擇和栽培馴化形成云南稻種資源有利基因[12]。本項目已利用548份云南稻種核心種質(zhì)及其改良后代進行糙米功能成分評價和鑒定[13-15]，選育出米飯抗性淀粉含量超過10%的功米3、 4號及抗性淀粉、γ-氨基丁酸雙高的云資粳82號(抗性淀粉14.1 %，發(fā)芽糙米GABA =59.30 mg/100g)。以108份云南稻微核心種質(zhì)及其改良后代研究4種功能成分(總黃酮、γ-氨基丁酸、生物堿和抗性淀粉)差異及鑒定評價至今尚未有研究報道?！緮M解決的關鍵問題】以云南稻微核心種質(zhì)及其回交后代為研究材料，對4種功能成分差異進行評價分析，旨在為利用微核心種質(zhì)有效降低成本、加快功能稻育種及推進產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料種植方法

以108份富含糙米總黃酮、γ-氨基丁酸、生物堿和抗性淀粉功能成分的云南稻微核心種質(zhì)作為供體，其中秈稻48份，粳稻60份。以秈稻滇屯502和粳稻合系35為輪回親本，按秈秈交、粳粳交配制，獲得一一對應的回交后代127份，其中BC5F421份、BC4F412份、BC3F416份、BC6F335份、BC5F319份、BC4F324份。所有材料于2015年3月22日在秈粳交錯區(qū)的玉溪市研和鎮(zhèn)播種，5月18日移栽，水肥按照常規(guī)管理方案，9月25日成熟期收獲株系，隨機混收，用日本佐竹SATAKE礱谷機(THU35C)脫殼成糙米，高速萬能粉碎機(DFT-50A)打成粉60 ℃恒溫干燥后待測。

1.2 功能性成分測定

在云南省農(nóng)業(yè)科學院云南省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，測定4種功能性成分含量。γ-氨基丁酸的測定方法參照INATOMI[16]方法進行，回歸方程：Y=5.152x+0.003, 相關系數(shù)為0.9984；總黃酮參照申湘忠等[17]的方法，回歸方程：Y=2.702x-0.0129，相關系數(shù)為0.9994；生物堿參照曾亞文[18]方法，回歸方程：Y=6.204x-0.186，相關系數(shù)為0.9962；抗性淀粉參照Goni[19]方法。

2 結果與分析

2.1 微核心種質(zhì)及其回交后代糙米功能成分含量變異

由表1可知，總體來看，微核心種質(zhì)和其回交后代糙米4種功能成分含量的變幅和變異系數(shù)均較大，回交后代糙米的4種功能成分含量較輪回親本(滇屯502、合系35)均有明顯的提高。微核心種質(zhì)供體變異系數(shù)最大的是粳稻回交后代抗性淀粉(70.2 %)，粳稻供體黃酮含量次之(65.7 %)；變異系數(shù)最小的是粳稻回交后代γ-氨基丁酸含量(8.8 %)。供體微核心種質(zhì)糙米功能成分變異系數(shù)從大到小依次是：黃酮(69.2 %)>抗性淀粉(59.4 %)>γ-氨基丁酸(45.8 %)>生物堿(16.2 %)；回交后代變異系數(shù)從大到小依次是：抗性淀粉(60.5 %)>生物堿(37.8 %)>黃酮(27.0 %)>γ-氨基丁酸(19.2 %)。粳稻供體黃酮、γ-氨基丁酸、抗性淀粉含量高于秈稻，而生物堿含量則為秈稻高于粳稻。表明微核心種質(zhì)水稻4種功能成分含量存在明顯的基因型差異，粳稻供體更有利于選育出富含黃酮、γ-氨基丁酸、抗性淀粉的育種材料，而秈稻供體更易于選擇出富含生物堿的育種材料。

表1云南稻微核心種質(zhì)供體、受體及回交后代功能成分含量的變幅和變異系數(shù)

Table 1 The ranges and variation coefficients of functional ingredients in different backcross populations of mini-core collections rice in Yunnan province

材料Materials類型Types黃酮Total flavonoidγ-氨基丁酸Gamma-aminobutyric acid生物堿(mg/100g)Alkaloid抗性淀粉Resistant starch變幅 (mg/100g)Ranges變異系數(shù)(%)Variation coefficient變幅(mg/100g)Ranges 變異系數(shù)(%)Variation coefficient變幅(mg/100g)Ranges變異系數(shù)(%)Variation coefficient變幅(%)Ranges變異系數(shù)(%)Variation coefficient供體Donor秈稻34.3～273.260.52.3～10.040.58.9～15.611.00.74～6.4260.3粳稻47.9～430.665.70.75～15.146.38.5～14.511.40.8～5.052.0總和34.3～430.669.20.75～15.145.88.5～15.616.20.74～6.4259.4輪回親本Recurrent parentDT50250.63-6.82-12.62-0.63-HX3551.84-4.86-13.95-1.02-回交后代Backcross population秈稻31.5～130.735.84.3～12.218.39.5～38.040.51.2～3.626.5粳稻49.2～96.012.06.6～10.08.810.0～19.913.11.2～13.470.2總和31.5～130.727.04.3～12.219.29.5～38.037.81.2～13.460.5

2.2 微核心種質(zhì)秈粳各回交后代糙米功能成分的含量差異

由表2可知，微核心種質(zhì)及秈粳各回交后代糙米γ-氨基丁酸、總黃酮含量均為粳稻>秈稻，BC6F3、BC5F3秈粳稻差異達到極顯著及顯著水平；而生物堿含量為秈稻>粳稻，BC5F4、BC6F3之間差異達到顯著和極顯著水平；抗性淀粉秈粳差異不大，未達到顯著水平。表明在水稻高功能成分材料選育過程中，粳稻回交后代具有選育富含黃酮、γ-氨基丁酸等成分材料的優(yōu)勢，而秈稻回交后代具有選育高生物堿含量材料的優(yōu)勢。

2.3 微核心種質(zhì)秈稻各回交后代之間4種功能成分的含量差異

由表3可知，微核心種質(zhì)秈稻各回交后代之間黃酮、γ-氨基丁酸含量差異不顯著；生物堿和抗性淀粉含量在各回交后代之間差異較大，BC5F4含量最高且和其他回交后代間差異達極顯著和顯著水平。表明回交次數(shù)和自交代數(shù)對秈稻回交后代生物堿及抗性淀粉含量有顯著影響，對總黃酮、γ-氨基丁酸含量無較大影響。進一步證明秈稻回交后代群體有利于篩選出富含生物堿的功能稻米材料。

在秈稻各回交后代中，篩選出供體親本及其對應回交后代糙米總黃酮、γ-氨基丁酸、生物堿和抗性淀粉含量分別都較高的5對優(yōu)良品系，其糙米總黃酮變幅為34.5～80.8 mg/100g；γ-氨基丁酸變幅為4.7～7.0 mg/100g；生物堿變幅為12.1～30.5 mg/100g；抗性淀粉變幅為2.5 %～6.2 %。這些株系可以作為功能稻米選育的橋梁材料及糙米功能成分基因定位的近等基因系材料。

表2 微核心種質(zhì)秈粳各回交后代之間糙米功能成分的含量差異

注：*和**分別表示0.05和0.01顯著水平。

Note: * and ** indicate significant levels of 0.05 and 0.01, respectively.

表3 微核心種質(zhì)秈稻各回交后代糙米功能成分的含量差異

表4 微核心種質(zhì)粳稻各回交后代糙米功能成分的差異

2.4 微核心種質(zhì)粳稻各回交后代之間4種功能成分的含量差異

由表4可知，微核心種質(zhì)粳稻各回交后代之間生物堿含量差異不顯著；總黃酮、γ-氨基丁酸及抗性淀粉在各回交后代含量差異較大，BC5F4含量最高和其他回交后代達極顯著和顯著水平?；亟缓蟠嗤亟淮螖?shù)不同自交次數(shù)比較，總黃酮、γ-氨基丁酸、抗性淀粉隨自交次數(shù)增加含量不斷增加。BC5F4粳型回交后代中總黃酮、γ-氨基丁酸、抗性淀粉均值最高，說明粳型回交后代群體有利于篩選出富含黃酮、γ-氨基丁酸、抗性淀粉的功能稻米材料。

在粳稻各回交后代中，也篩選出供體親本及其對應回交后代糙米總黃酮、γ-氨基丁酸、生物堿和抗性淀粉含量相對都較高的5對優(yōu)良品系，其糙米總黃酮變幅為71.8～95.4 mg/100g；γ-氨基丁變幅為8.9～13.8 mg/100g；生物堿變幅為12.3～15.1 mg/100g；抗性淀粉變幅為3.2 %～5.1 %。

3 討 論

水稻功能成分含量是與人類飲食健康密切相關的重要指標。因此在功能稻米選育中，對育種親本材料的挑選應十分注重。孫丹等[14]對功米3 號和滇屯502 及其219 株F3家系糙米總黃酮和γ-氨基丁酸測定，F(xiàn)3群體糙米總黃酮平均值為130.15 mg/100g，變異系數(shù)18.83 %；F3群體糙米γ-氨基丁酸平均值為6.91 mg/100g，變異系數(shù)44.28 %。魏明亮[20]研究云南稻核心種質(zhì)粳稻回交高代糙米的抗性淀粉含量變異系數(shù)高達59.2 %。本試驗輪回親本(合系35、滇屯502)糙米的功能成分含量較低，以108份云南稻微核心種質(zhì)作為供體，整體來看，微核心種質(zhì)和其回交后代糙米黃酮、γ-氨基丁酸、抗性淀粉、生物堿含量的變幅和變異系數(shù)均較大，四種功能成分4量存在較為明顯的基因型差異，且回交后代中，4種功能成分較受體滇屯502和合系35均得到提高。說明以微核心種質(zhì)及滇屯502及合系35作為受體培育具有高功能成分近等基因系的方案是可行的，可直接作為新的優(yōu)良種質(zhì)資源繼續(xù)下一步的工作。粳型回交后代具有選育富含總黃酮、γ-氨基丁酸等成分材料的優(yōu)勢；秈型回交后代群體具有選育出富含生物堿的功能稻米的優(yōu)勢。這在高功能成分水稻育種工作方面也具有一定的參考價值。

另外，回交后代總黃酮含量高于輪回親本，而低于微核心種質(zhì)親本。曾亞文[15]利用分光光度法檢測云南栽培稻糙米發(fā)現(xiàn)紫米和紅米的總黃酮、γ-氨基丁酸含量均極顯著高于白米，日常飲食以白精米為主可能導致人類慢性病增加。杜娟[21]利用高效液相色譜法檢測結果表明云南有色稻總黃酮極顯著高于云南無色稻?？刂瓶傸S酮含量性狀的基因，受細胞質(zhì)遺傳影響較大，與米色基因連鎖[22]。有色稻米的種皮顏色是由類黃酮色素化合物沉積形成，回交后代材料經(jīng)過多次回交配置，在育種過程中回交后代有色稻減少，白色稻增加可能是導致回交后代總黃酮降低的主要原因。因此育種中田間篩選環(huán)節(jié)應注意保留有色稻株系。

回交后代的生物堿含量的變異系數(shù)比微核心種質(zhì)更大，且γ-氨基丁酸含量高于輪回親本，也高于微核心種質(zhì)，呈現(xiàn)超親優(yōu)勢，與陳志遠[23]的研究結果一致。稻米中γ-氨基丁酸含量受外界環(huán)境影響較大，干旱、低溫、蟲害、鹽脅迫、機械刺激等逆境條件下，植物體內(nèi) γ-氨基丁酸大量富集而增加[24-25]，因此在選育高 γ-氨基丁酸含量的功能稻米時，要關注外界環(huán)境對γ-氨基丁酸含量的影響。

4 結 論

本實驗表明云南微核心種質(zhì)供體及秈粳回交后代糙米的總黃酮、γ-氨基丁酸、抗性淀粉含量均存在豐富的變異，說明以云南核心種質(zhì)及滇屯502、合系35培育具有高功能成分稻米的方案是可行的。