槲皮素和原花青素對豚鼠白癜風(fēng)模型黑素合成的影響

周夢圓 徐麗娟 譚 城 閔仲生

槲皮素學(xué)名為櫟精、槲皮黃素，是一種屬于黃酮類的天然有機(jī)化合物，由于其具有較強(qiáng)的抗氧化功效而在醫(yī)學(xué)上得到應(yīng)用，主要存在于菟絲子以及桑寄生、紅花等中藥中，是主要活性成分之一。原花青素亦具有天然抗氧化物的成分，一般在銀杏以及葡萄中具有較高的含量。臨床中，上述藥物常用于白癜風(fēng)的治療，而目前對于抗氧化作用治療白癜風(fēng)的研究及應(yīng)用較少。因此，結(jié)合槲皮素、原花青素的功效，我們設(shè)計(jì)了白癜風(fēng)豚鼠模型的實(shí)驗(yàn)，旨在分析通過其對治療前后皮損復(fù)色及對黑素顆粒、黑素小體的影響，探求其治療白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制，為白癜風(fēng)的治療開辟途徑。

1 材料及動物

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與動物 在90%的醫(yī)用乙醇中放入槲皮素或者原花青素母液(由南京澤朗生物科技有限公司提供)，配制成10 mg/mL的溶液，在-20℃的環(huán)境中進(jìn)行保存。參照文獻(xiàn)[1，2]，臨用時(shí)調(diào)至為終極濃度為0.5%槲皮素，0.1%、0.3%原花青素。其中實(shí)驗(yàn)中采用的8-甲氧補(bǔ)骨脂素酊劑由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院所提供。

為使實(shí)驗(yàn)具有可觀察性[3]，選用健康褐色、雜色豚鼠共計(jì)38只(江蘇省中醫(yī)藥動物實(shí)驗(yàn)中心提供，普通級)。其中，雌鼠18只，雄鼠20只，體重為300～500 g。首選把每只豚鼠背部進(jìn)行脫毛處理，為方便觀察，脫毛面積約為4 cm×4 cm，每次均勻涂抹1 mL的5%過氧化氫溶液[4]，時(shí)間為每日2次，每次2～3分鐘，直至豚鼠毛色、皮膚變白。

1.2 分組 對豚鼠按體重劃分A～F組共6組，A組為標(biāo)準(zhǔn)對照組，外用90%乙醇對豚鼠背部進(jìn)行處理；B組為空白對照組，采用蒸餾水；C組為陽性對照組，外用0.1%的8-MOP(每次涂藥后需進(jìn)行日光照射，時(shí)間為10 min)；D組外用0.5%槲皮素酊劑；E組為外用0.1%原花青素酊劑；F組外用0.3%原花青素酊劑。每次涂藥1 mL，每天2次，連用40天后取皮損病理切片，觀察黑素合成情況。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 皮膚顏色變化觀察 在試驗(yàn)的過程中，設(shè)置固定的皮膚顏色觀察時(shí)間來查看每個(gè)試驗(yàn)組的黑素沉著現(xiàn)象，2周一次進(jìn)行拍照統(tǒng)計(jì)。色素復(fù)色的評分標(biāo)準(zhǔn)[5]：0分為蒼白或白斑或無變化；1分為淡褐色或色素面積恢復(fù)<50%；2分為中褐色或淺灰色或色素面積恢復(fù)>50%；3分為深褐色或黑素或色素基本恢復(fù)正常。若色素復(fù)色介于不同分?jǐn)?shù)之間，則取平均值。

2.2 皮膚組織學(xué)變化 以HE染色觀察。

2.3 黑素合成情況 ①基于Fontana-Masson法[6]觀察黑色顆粒的變化情況：選取常規(guī)石蠟切片，放入配好的氫氧化氨銀溶液內(nèi)，置于37℃暗處孵育，時(shí)間為2 h，然后采用標(biāo)注的V、G液對比并進(jìn)一步染色處理，染色2 min，最后以濃度為95%的乙醇、無水乙酸脫水，以二甲苯透明，以中性樹膠封片，觀察到的黑素顆粒為黑色；②采用電鏡觀察黑素小體分布及數(shù)目的變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本次實(shí)驗(yàn)采用SPSS 17.0對實(shí)驗(yàn)測試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集與分析，在處理的過程中，針對離散的數(shù)據(jù)建立秩和檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?，針對正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用方差法進(jìn)行分析，其次，每組數(shù)據(jù)之間采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間采用Friedman秩和檢驗(yàn)的算法進(jìn)行比較分析。

3 結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)期間，豚鼠背部無紅斑、鱗屑、破潰、水皰等不良的反應(yīng)，38只豚鼠在實(shí)驗(yàn)治療期間無死亡個(gè)例。

3.1 肉眼觀察色素積分 色素積分統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示如下：分別于治療2周、4周、40天的前后，比較C、D、F三組，色素積分存在顯著差異(秩和檢驗(yàn)P<0.01)；C、D、F組之間的比較表明，三組色素積分為處理40天>4周>2周，隨著治療時(shí)間的延長，三種不同的處理方法對皮損復(fù)色的影響逐漸增大。治療2周、4周、40天前后，A、B、E組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

3.2 皮膚組織學(xué)變化 HE染色光鏡下觀察結(jié)果顯示，經(jīng)過治療后的豚鼠表皮厚度與正常豚鼠表皮厚度沒有產(chǎn)生明顯差別，其中，采用A組與B組處理后的豚鼠表皮厚度較薄，C、D、E、F組處理后的豚鼠表皮厚度與正常豚鼠表皮厚度無明顯差異，其中D組處理后的豚鼠表皮厚度最接近正常豚鼠的表皮厚度。

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)觀察，豚鼠實(shí)驗(yàn)對照組的前后豚鼠細(xì)胞比較完整，在色素顏色方面，A、B組在治療后的基底層色素比C、D、F組有所增加，而且C、D、F組的實(shí)驗(yàn)前后的色素也有所差異，實(shí)驗(yàn)后色素都存在一定的增加。

表1 2周、4周、40天后的各組色素積分比較

注:*P<0.01，不同的處理天數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表2 Fontana-Masson法觀察黑色顆粒的變化情況

注：Fontana-Masson法結(jié)果顯示，與A、B組相比，其余4組黑素顆粒明顯增多，其中A、B組之間無明顯差異(均P<0.05)，D、F組明顯多于E組(均P<0.05)

3.3 黑素合成情況 在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在黑素小體的數(shù)量方面，0.1%原花青素組的黑素小體數(shù)量較少，且在觀察區(qū)域內(nèi)黑素小體分布較分散；在實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，槲皮素組的黑素小體的數(shù)量最多，然后是0.3%原花青素組，最后是0.1%原花青素組，可以看出原花青素的濃度大小對黑素小體的數(shù)量具有一定的影響(表2)。

4 討論

目前，白癜風(fēng)的病因與黑素細(xì)胞凋亡的原因尚無定論，但在理論研究方面認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要來源于自身免疫、黑素細(xì)胞自毀、神經(jīng)化學(xué)、微量元素、遺傳因素、微循環(huán)等方面。其中白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。氧化應(yīng)激是細(xì)胞過度產(chǎn)生或不充分清除活性氧分子的結(jié)果，導(dǎo)致機(jī)體氧化-抗氧化平衡受損，并可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等不同生物大分子的非特異性損傷[7]。表皮內(nèi)氧化應(yīng)激作用于機(jī)體，具體表現(xiàn)在打破鈣穩(wěn)態(tài)平衡、影響黑素的合成、過氧化氫的聚集以及遺傳等方面，從而導(dǎo)致白癜風(fēng)的發(fā)生[8]。黑素細(xì)胞在通過外界紫外線的照射后，易產(chǎn)生大量的自由基而致細(xì)胞毒作用，在一定程度上加速黑素細(xì)胞的死亡。白癜風(fēng)患者的外周血自由基代謝相關(guān)酶存在異常，故如何加速皮損內(nèi)自由基清除是白癜風(fēng)治療中主要難點(diǎn)之一。偽過氧化氫酶能夠恢復(fù)皮損處過氧化氫酶的活性，改善白癜風(fēng)皮損的局部高氧化應(yīng)激狀態(tài)，臨床中取得了一定的療效，但近年來也研究表明該藥物仍不甚理想。

植物藥及其中活性產(chǎn)物是天然、高效抗氧化劑。芹黃素[9，10]、黃芩素[11]等黃酮類化合物是天然的植物抗氧化劑，可減輕氧化應(yīng)激所致黑素細(xì)胞損傷。槲皮素亦是一種黃酮類化合物，但目前關(guān)于其的相關(guān)研究甚少。原花青素藥效廣泛，對其研究和開發(fā)已有幾十年的歷史，但當(dāng)前對其生理功能活性相關(guān)的分子結(jié)構(gòu)、信號通路以及酶的認(rèn)識仍尚不確切[12]。國內(nèi)外對天然抗氧化劑的迫切要求，使得進(jìn)一步研究槲皮素、原花青素勢在必行。

皮膚化學(xué)脫色法主要包括兩種，一為氫醒，二為過氧化氫，前者為酪氨酸酶抑制劑，抑制酪氨酸酶，影響黑素生成；后者為強(qiáng)效的氧化劑，漂白的主要成分為HO2-。龍子江等[13]使用5%過氧化氫對豚鼠脫色后發(fā)現(xiàn)：表皮基底層及棘層黑素、毛囊黑素明顯減少, 效果與用藥時(shí)間呈正比，說明過氧化氫具有模擬白癜風(fēng)的作用。張?zhí)m蘭等[14]運(yùn)用二者對豚鼠脫色后，豚鼠細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸酶及黑素細(xì)胞、顆粒等都發(fā)生了變化，基底細(xì)胞數(shù)量減小的同時(shí)相應(yīng)酶的活性也低于常態(tài)，因此該理論的研究具有模擬白癜風(fēng)發(fā)病的作用。而諸多研究亦[15-17]表明，細(xì)胞損傷與細(xì)胞內(nèi)的自由基的數(shù)量存在一定的聯(lián)系，白癜風(fēng)患者表皮中過氧化氫的沉積致使氧化應(yīng)激的狀態(tài)，直間接地?fù)p傷黑素細(xì)胞，而出現(xiàn)白斑。

經(jīng)治療后的豚鼠表皮厚度與空白對照組沒有明顯變化，外用的中藥制劑對白癜風(fēng)模型鼠皮膚進(jìn)行復(fù)色，復(fù)色的區(qū)域未發(fā)生明顯的炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，而許多外用西藥一般都含有糖皮質(zhì)激素，有很大幾率會造成局部皮膚出現(xiàn)萎縮、變薄等不可逆的副作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在治療白癜風(fēng)時(shí)采用本實(shí)驗(yàn)中的中藥治療方案，具有一定的效果，且通過電鏡觀察處理組的細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過處理的皮膚區(qū)域內(nèi)的毛囊周圍均觀察到黑素細(xì)胞的聚集，這也證實(shí)經(jīng)過處理后皮膚出現(xiàn)復(fù)色效果，說明白癜風(fēng)的復(fù)色過程主要是通過激活皮損內(nèi)毛囊外毛根鞘存在的無功能性黑素細(xì)胞，激活后的黑素細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖并沿毛囊外毛根鞘上移進(jìn)入表皮而完成。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明原花青素以及槲皮素均可以使棕色豚鼠皮膚黑素小體分布密度及數(shù)量增加，其中槲皮素組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為顯著，其次為0.3%原花青素。然而由于在電鏡下觀察到的樣本量很小，而且本次實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)體數(shù)量有限，而且樣本具有一定的隨機(jī)性，實(shí)驗(yàn)對比結(jié)果并不能代表全部情況，僅作為參考指標(biāo)。