類烏齊牦牛乳酸脫氫酶基因克隆及組織表達(dá)

黃 興，柴志欣，王 會(huì)，信金偉，姬秋梅，鐘金城

(1.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，拉薩 850009)

乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)是一種廣泛存在于脊椎動(dòng)物、植物和細(xì)菌中的寡聚酶[1]，能夠催化乳酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)徹底氧化分解。LDH 是由LDHA和LDHB 2 個(gè)亞基組成的四聚體酶，LDHA基因編碼M 亞基，LDHB基因編碼H 亞基，兩者按不同比例組成 5 種同工酶。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸脫氫酶是一種含鋅的糖酵解酶，幾乎存在于所有組織中，心、骨骼肌和腎臟最豐富，其次為肝、脾、胰腺、腦、肺臟等，體內(nèi)分布具有明顯的組織特異性[2]。普通牛LDHB基因位于 5 號(hào)染色體，包括 7 個(gè)外顯子，CDS區(qū)全長(zhǎng)1 005 bp。同時(shí)，LDH 與腫瘤關(guān)系密切，敲除LDHB基因可抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)，下調(diào)LDHB的表達(dá)水平可能有助于宮頸癌的治療[3]。王光慶等[4]利用免疫組化SP法檢測(cè)72 例結(jié)腸癌組織(CC組)及72例結(jié)腸組織(對(duì)照組)中的LDHB蛋白，結(jié)果兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)LDHB蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞癌性組織中的表達(dá)低于非癌性結(jié)腸組織，其表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。目前，在人[5]、鼠兔[6]、鼠[7]等物種開展相關(guān)研究，而牦牛上鮮見報(bào)道。在牦牛上發(fā)現(xiàn)編碼 LDH1H 亞基的LDHB基因存在多態(tài)性，理論上會(huì)形成雜合基因型，并導(dǎo)致 LDH1 等同工酶譜帶型復(fù)雜化[8]，而這種LDH特殊帶型是由Ldhb-F和Ldhb-S雜合型基因編碼[9]。LDHB基因編碼H亞基的單堿基突變形成2種突變型[10]，也證實(shí)這一觀點(diǎn)。此外，對(duì)79頭麥洼牦牛檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在Ldhb-AA 和Ldhb-AG 2 種基因型[11]。

牦牛能適應(yīng)缺氧等極端生態(tài)環(huán)境[12-13]，是高海拔地區(qū)畜牧業(yè)的主要畜種，為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┥a(chǎn)和生活資料。西藏作為中國(guó)牦牛的主產(chǎn)區(qū)，其獨(dú)特的地理位置和環(huán)境因素形成許多地方品種(類群)[14-15]，牦牛遺傳資源十分豐富。類烏齊俗稱西藏“小瑞士”，山清水秀，鳥語花香，泉水潺潺，青草萋萋，形成優(yōu)良的牦牛類群。世界牦?？粗袊?guó)，中國(guó)牦?？次鞑?，西藏牦?？搭悶觚R。類烏齊牦牛遺傳多樣性豐富，生活環(huán)境海拔高，肉質(zhì)鮮美，于 2017 年通過國(guó)家畜禽資源委員會(huì)鑒定，成為優(yōu)良牦牛遺傳資源[16]。本研究通過類烏齊牦牛LDHB基因的克隆及組織表達(dá)，為其與高海拔地區(qū)極端低氧適應(yīng)性調(diào)控及能量代謝功能的遺傳機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣本采集 在西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣選取 4.5 歲健康的類烏齊牦牛 3 頭，分別采集心臟、肝臟、肺臟等組織，DEPC沖洗，錫箔紙包裝后迅速置于液氮保存，備用。

1.1.2 主要試劑與分析軟件 Trizol(life technologies公司)、RNA提取試劑盒(TIANGEN公司)；瓊脂糖(Amresco公司)、DL2000 DNA ladder(Biomiga公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN公司)、DNA純化試劑盒(TIANGEN公司)、RNase-Free ddH2O、pMD19-T載體(TaKaRa公司)、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等。

分析軟件有DNAStar；MEGA.6；ProtPar：https://web.expasy.org/protparam/；

ORF Finder：https://indra.mullins.microbiol.washington.edu/sms2/orf_find.html；

ExPASy-ProtScal：https://web.expasy.org/protscale/；

SOPMA：https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html；

PHYREZ：http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=inde；Raswin；

EMBOSS:cpgplot：http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/cpgplot；

NetPhos3.1Server：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/；

Conserved Do-main Search Service：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi；

PSORT Prediction：https://psort.hgc.jp/form2.html；

PredictProtein：https://www.predictprotein.org/。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 稱取 80～110 mg組織樣品于研缽中，液氮中研磨，將研磨好的組織迅速轉(zhuǎn)移到含Trizol裂解液的離心管，按試劑盒說明提取組織總RNA，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。采用分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品的質(zhì)量濃度及OD260nm/OD280nm值。利用DNaseⅠ去除殘留DNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，4 ℃保存，備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的普通牛LDHB基因序列(No:AC_000172)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，引物由英濰捷基(上海) 生物技術(shù)有限公司合成。

表1 類烏齊牦牛LDHB基因的引物Table 1 Primers of LDHB gene in Leiwuqi yak

1.2.3 牦牛LDHB基因的克隆 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：ddH2O 9.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL、TaqGreen PCR Master Mix(2×,1.25 mL) 12.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用DNA純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，4 ℃保存，備用。

1.2.4 目的片段的TA克隆與鑒定 回收純化后的PCR產(chǎn)物在4 ℃下與pMD18-T載體過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，送上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.5 RT-PCR分析 反應(yīng)體系20 μL：10 μL SYBR premix Dimer Eraser(2×)，上下游引物各0.8 μL，無菌去離子水6.8 μL，cDNA稀釋2～3倍后取1.6 μL。定量程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。同一牦牛個(gè)體的心、肝、肺分為 3 組，每組樣品 3 個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后以熔解曲線來判定RT-qPCR反應(yīng)的特異性，獲得每個(gè)樣品的Ct值， 以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算各個(gè)樣本的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 利用NCBI中ORF Finder程序?qū)︻悶觚R牦牛LDHB基因進(jìn)行開放閱讀框分析，利用DNAStar軟件分析堿基組成。運(yùn)用SOPMA、PHYREZ、Raswin等在線軟件預(yù)測(cè)LDHB基因二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用EMBOSS分析LDHB基因的CPG島、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸位點(diǎn)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域等，PSORT Prediction在線軟件對(duì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析；利用MegAlign和MEGA.6軟件進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)及LDHB基因的克隆

總RNA經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，存在18 S和28 S條帶(圖1)，寬度和亮度基本接近1∶2，表明RNA完整性良好。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測(cè)到大小約1 000 bp的片段(圖2)，條帶清晰，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小(1 079 bp)吻合，有少量雜帶，切膠回收后，對(duì)PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化，確認(rèn)無誤后送公司測(cè)序。

圖1 牦牛提取組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of yaks

2.2 LDHB基因的序列分析

類烏齊牦牛LDHB基因存在 6 個(gè)開放閱讀框，參照Kozak法則，獲得 1 個(gè)1 005 bp的ORF(圖3)，起始密碼為ATG，終止密碼為TGA，對(duì)應(yīng)氨基酸序列分別為M、L，共編碼 334 個(gè)氨基酸，堿基含量分別為：A 25.13%、G 20.20%、T 28.46%、C 26.21%，基因編碼區(qū)G+C含量(46.41%) 低于A+T含量(53.59%)。與NCBI的家牦牛序列(HQ874654.1)比對(duì)， 3 頭類烏齊牦牛均存在362、466 bp 2 處突變，突變導(dǎo)致密碼子AAG→GAG(賴氨酸→谷氨酸)、ATC→AGC(異亮氨→絲氨酸)。應(yīng)用DNAstar軟件將LDHB基因氨基酸序列與家牦牛相應(yīng)氨基酸序列(ABJ97276.1)進(jìn)行比對(duì)，兩者同源性為99.7%。

M．DL2000 DNA marker；1．PCR產(chǎn)物 PCR amplicons of LDHB；2．DNA 純化回收 Purification recycling of DNA；3．菌液PCR產(chǎn)物 Amplicons of bacteria liquid PCR

2.3 LDHB基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

利用ProtParam軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，LDHB基因編碼蛋白帶負(fù)電的殘基(Asp + Glu)為 39個(gè)，帶正電的殘基 (Arg + Lys)為 35 個(gè)，其中纈氨酸(Val)與亮氨酸(Leu)最多，分別為 37和 36個(gè)，占整個(gè)氨基酸組成的11.10%和10.80%(表2)。蛋白分子質(zhì)量為36.72 ku，總原子數(shù)為5 234，理論等電點(diǎn)(PI)為6.02。消光系數(shù)[r=280 nm/(mol·cm) ]為43 680，不穩(wěn)定指數(shù)26.87，表明這類蛋白質(zhì)較穩(wěn)定，脂溶系數(shù)109.04，親水性平均值為0.04，此蛋白為疏水性蛋白。

運(yùn)用ExPASy-ProtScale在線分析軟件，獲得類烏齊牦牛LDHB基因編碼蛋白的親水性/疏水性(圖4)，第 292 位亮氨酸疏水性最強(qiáng)(Max=2.556)，第 226 位谷氨酸親水性最強(qiáng)(Min=-2.956)，LDHB含有較強(qiáng)的疏水區(qū)域，是不可溶蛋白。

運(yùn)用SOPMA 在線軟件預(yù)測(cè)類烏齊牦牛LDHB基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中162個(gè)氨基酸構(gòu)成α-螺旋、67個(gè)為延伸鏈，分別占48.50%、20.06%，有35和70個(gè)氨基酸為β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，分別占10.48%和20.96%(表3)，說明牦牛LDHB基因編碼蛋白為混合型蛋白質(zhì)。應(yīng)用PHYREZ在線軟件和Raswin軟件預(yù)測(cè)LDHB正值表示疏水，負(fù)值表示親水，窗口大小為n=9 Positive value indicates hydrophobicity，negative value indicates hydrophilic，window size withn=9編碼蛋白，發(fā)現(xiàn)其主要由無規(guī)卷曲、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角在空間上盤繞，折疊形成，與二級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)基本一致(圖5)。

圖3 類烏齊牦牛 LDHB 基因ORF序列及其編碼氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and amino acid sequence of LDHB ORF region in Leiwuqi yak

表2 類烏齊牦牛LDHB基因編碼蛋白氨基酸組成Table 2 Amino acid profile of LDHB in Leiwuqi yak

圖4 類烏齊牦牛LDHB編碼蛋白的疏水性/親水性預(yù)測(cè)Fig.4 Hydrophobic / hydrophilic analysis for LDHB in Leiwuqi yak

表3 牦牛LDHB基因二級(jí)結(jié)構(gòu)頻率預(yù)測(cè)Table 3 Secondary structure frequency prediction for yak LDHB

2.4 蛋白結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)

2.4.1LDHB基因跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 在LDHB基因中未發(fā)現(xiàn)CpG島，運(yùn)用 TMpred預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向，存在多個(gè)跨膜區(qū)域，其中最優(yōu)跨膜區(qū)域兩處，分別是序列位置為24、42(19)，螺旋形式以里向外，長(zhǎng)度得分為1 375和序列位置為126 149(24)，螺旋形式由外向內(nèi)，長(zhǎng)度得分550的同時(shí)TM-螺旋長(zhǎng)度預(yù)測(cè)為17～33，如圖6。

圖5 類烏齊牦牛LDHB蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Putative tertiary structure of LDHB in Leiwuqi yak

2.4.2 磷酸位點(diǎn)分析 運(yùn)用NetPhos 3.1 Server在線分析軟件對(duì)LDHB基因編碼序列的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白共含有 23 處磷酸化位點(diǎn)。其中Serine磷酸化位點(diǎn)15 處，Threonine磷酸化位點(diǎn)6 處，Tyrosine磷酸化2 處，不含有Threshold磷酸化位點(diǎn)(圖7)。

i.在里面 Inside;o.在外面 Outside;只有分值達(dá)到500以上才有效 Only scores above 500 are considered significantly

2.4.3 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域 運(yùn)用NCBI 中[Conserved Do-main Search Service ( CD Search) ]在線分析LDHB基因的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn) 1 個(gè)保守功能結(jié)構(gòu)域，為NADB Rossmann superfamily結(jié)構(gòu)域(圖8)，通過Rossmann折疊與NADPH結(jié)合。在糖酵解等許多代謝途徑的脫氫酶中均發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)域，與NADPH結(jié)合時(shí)常涉及許多氫鍵和范德華力。

2.4.4 蛋白質(zhì)功能分析 PSORT Prediction分析發(fā)現(xiàn)，LDHB基因編碼的蛋白分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和高爾基體，其中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分布最多。該蛋白在L-乳酸脫氫酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、L-蘋果酸脫氫酶活性、NAD或NADB結(jié)合，以及與自身相同的蛋白結(jié)合等一系列生物合成過程中發(fā)生作用，但在糖酵解、氧化還原等過程中發(fā)揮主要作用(表4)。

圖7 類烏齊牦牛LDHB基因編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析Fig.7 Phosphorylation site analysis of LDHB Protein in yak

圖8 類烏齊牦牛LDHB基因結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.8 Structural domain prediction of LDHB gene in Leiwuqi yak

表4 LDHB基因功能分析Table 4 Functional analysis of LDHB gene

2.5 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

為進(jìn)一步研究類烏齊牦牛LDHB基因的進(jìn)化過程，利用MegAlign軟件分析其與其他18個(gè)物種該基因氨基酸序列的同源性(表5)，并用MEGA.6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖9)。結(jié)果表明，類烏齊牦牛與九龍牦牛、普通黃牛的氨基酸序列同源性最高，親緣關(guān)系最近，表明發(fā)育樹與其物種進(jìn)化樹基本一致，符合物種的進(jìn)化規(guī)律。其次為山羊、寬吻海豚、豬、馬、羊駝、野生雙峰駱駝等；與雞、烏鴉、非洲爪蟾、鯉魚親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.6 RT-qPCR分

RT-qPCR定量分析表明(表6)，利用Spass 22.0進(jìn)行單因素方差分析。選擇Duncan’s法進(jìn)行各組織間的多重比較，發(fā)現(xiàn)LDHB基因在類烏齊牦牛的心臟和肺臟組織中表達(dá)水平較高，在肝臟中最低，在肺臟中的表達(dá)水平顯著高于其他組織(P<0.05)，心臟組織中的表達(dá)水平也顯著高于肝臟(P<0.05)(圖10)。

3 討 論

青藏高原環(huán)境獨(dú)特，物種豐富，是一個(gè)寶貴的遺傳資源庫(kù)，而牦牛作為青藏高原的特殊物種對(duì)生態(tài)環(huán)境具有極強(qiáng)適應(yīng)力，因此以牦牛為研究對(duì)象，探討牦牛低氧適應(yīng)性的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要的理論和實(shí)際意義。脫氫酶類是生物體內(nèi)參與氧化還原反應(yīng)的重要催化劑之一，在生物解毒、氧化產(chǎn)能、Cori循環(huán)等過程發(fā)揮重要作用[17-18]，其中以乳酸脫氫酶類為代表，這類酶分子質(zhì)量為130 000～145 000 u，是一類存在LDH1～LDH5 5 種分子形態(tài)的同工酶[19-20]。其中LDH5占主要優(yōu)勢(shì)，研究報(bào)道藏系綿羊骨骼肌、心肌的LDH 同工酶譜中LDH5的含量高于其他4種同工酶[21]。目前，關(guān)于牦牛LDHB基因的研究大部分建立在常規(guī)同工酶的基礎(chǔ)上，難以獲得豐富的遺傳參數(shù)，因此本研究通過對(duì)類烏齊牦牛LDHB基因的克隆及生物信息學(xué)分析，并獲得其在不同組織中的差異表達(dá)情況，為進(jìn)一步分析LDHB基因的功能及表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

表5 牦牛與18個(gè)物種LDHB基因的序列同源性比對(duì)Table 5 Homology comparing of Nucleotide sequences of LDHB between yak and other 18 species %

圖9 19個(gè)物種的LDHB基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.9 LDHB gene phylogenetic tree of 19 species

表6 LDHB基因在牦牛不同組織器官中的實(shí)時(shí)熒光定量Table 6 RT-qPCR of LDHB gene in different tissues and organs of yak

圖10 牦牛LDHB基因的mRNA組織表達(dá)分析Fig.10 mRNA expression of LDHB gene in various tissues in yak

類烏齊牦牛LDHB基因開放閱讀框共編碼 334 個(gè)氨基酸，與九龍牦牛序列(HQ874654.1)比對(duì)，存在2處突變(賴氨酸突變成谷氨酸，異亮氨酸突變成絲氨酸)。賴氨酸和異亮氨酸是人體或其他脊椎動(dòng)物的必須氨基酸，谷氨酸是一種酸性氨基酸，在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用，參與動(dòng)物、植物和微生物中許多重要化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)是重要的鮮味劑，對(duì)香味具有增強(qiáng)作用，這與類烏齊牦牛肉質(zhì)鮮美、口味獨(dú)特可能存在聯(lián)系。相關(guān)研究證明谷氨酸能改善肉質(zhì)性狀，如對(duì)雞 CACNA1S基因單核苷酸多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)谷氨酸含量能影響雞肉品質(zhì)[22]；對(duì)延邊黃牛 PRKAG3基因第10外顯子單核苷酸多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)谷氨酸與該基因呈正相關(guān)，影響肉質(zhì)[23]。通過對(duì)青海牦牛肉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析可知牦牛肉相較于黃牛肉組氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸的含量較高，揭示青海牦牛肉品營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)優(yōu)良的內(nèi)在特性[24]，以上相關(guān)研究均證明谷氨酸與肉品質(zhì)及風(fēng)味存在顯著關(guān)聯(lián)。絲氨酸作為非必須氨基酸，在脂肪和脂肪酸新陳代謝及肌肉生長(zhǎng)中發(fā)揮作用，在豬[25]和山羊[26]等研究中得以證實(shí)。此外，絲氨酸有助于免疫血球素和抗體的產(chǎn)生，使免疫系統(tǒng)免受侵害以維持其健康的免疫環(huán)境，類烏齊縣類烏齊牦牛位于西藏自治區(qū)昌都市，較平原地區(qū)氣候及生態(tài)環(huán)境更為惡劣，而本研究發(fā)現(xiàn)LDHB基因中絲氨酸含量較多，推測(cè)這有助于增強(qiáng)當(dāng)?shù)仃笈５拿庖吡?，以適應(yīng)當(dāng)?shù)貝毫迎h(huán)境。

通過對(duì)類烏齊牦牛LDHB基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，纈氨酸和亮氨酸占比最大，纈氨酸與異亮氨酸、亮氨酸共同促進(jìn)機(jī)體正常生長(zhǎng)，修復(fù)組織，調(diào)節(jié)血糖，并提供需要的能量[27]，這與LDHB基因參與生物氧化還原反應(yīng)一致。該編碼蛋白半衰期較長(zhǎng)，是一類穩(wěn)定蛋白，推測(cè)該蛋白能夠穩(wěn)定高效持續(xù)參與機(jī)體代謝過程，不易被降解，在酪蛋白源降血壓肽穩(wěn)定性及抑制作用機(jī)理研究中也有類似發(fā)現(xiàn)[28]。LDHB有較強(qiáng)的疏水區(qū)域，是不可溶蛋白，具備作為一類信號(hào)分子的基本結(jié)構(gòu)，可參與生物代謝調(diào)控，L-乳酸脫氫酶催化反應(yīng)機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)該蛋白首先與輔酶(NAD+)結(jié)合為二元復(fù)合物的信號(hào)分子，待反應(yīng)結(jié)束，釋放蛋白，完成催化[29]。該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲、 螺旋、 轉(zhuǎn)角為基礎(chǔ)進(jìn)一步在空間上延伸，其中α-螺旋高達(dá)48.50%，作為一種混合類蛋白，推測(cè)這種結(jié)構(gòu)影響該蛋白在糖酵解或氧化還原中的信息傳遞。LDHB基因編碼蛋白存在多處跨膜結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)域連接細(xì)胞膜內(nèi)外的部分，同時(shí)能夠影響信號(hào)傳遞。存在 23 處磷酸化位點(diǎn)，蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能最基本、最普遍，也是最重要的機(jī)制[30-31]，說明該蛋白在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的過程中起重要作用。

在亞細(xì)胞定位中發(fā)現(xiàn)LDHB基因編碼蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中占比最大。LDHB基因編碼蛋白是一種分泌蛋白，同時(shí)也是一種跨模蛋白，分泌蛋白和跨膜蛋白均在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成。而線粒體是細(xì)胞中制造能量的重要結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所。LDHB基因編碼蛋白是參與有氧呼吸的關(guān)鍵酶，作為氧化還原的主要場(chǎng)所，LDHB基因編碼蛋白所占比例較大與線粒體主要功能保持一致。功能預(yù)測(cè)表明，該蛋白主要以輔酶或激酶的形式參與調(diào)控[18-20]。通過構(gòu)建物種進(jìn)化樹，類烏齊牦牛與九龍牦牛、黃牛同源性最高，同源性在一定程度上反映出物種間同一基因序列的保守性，說明在漫長(zhǎng)進(jìn)化過程中，LDHB基因編碼區(qū)具有較強(qiáng)的保守性。此外，發(fā)現(xiàn)寬吻海豚LDHB基因的編碼序列與牦牛的同源性高達(dá)95.12%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其與普通黃牛、山羊的親緣性較高，這種關(guān)系是否能證明海豚這一水生哺乳動(dòng)物曾經(jīng)是一種陸生、類似反芻動(dòng)物的推論還有待進(jìn)一步研究。

組織表達(dá)結(jié)果表明LDHB基因在肺中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他組織，肝臟中表達(dá)水平最低。在心臟中的表達(dá)水平也較高，這與LDHB基因編碼的H亞基主要在心臟中被發(fā)現(xiàn)有關(guān)[32]，同時(shí)心臟中主要以H亞基為主[33]。而在肺組織中LDHB基因表達(dá)水平最高，可能與肺作為一個(gè)主要的呼吸器官有關(guān)，類烏齊牦牛生活在平均海拔4 000 m的高海拔區(qū)域，其肺組織為適應(yīng)低氧環(huán)境發(fā)生適應(yīng)性改變，也從另一方面證實(shí)LDHB基因?qū)﹃笈５脱踹m應(yīng)性存在調(diào)控作用；同時(shí)，LDH中M亞基和H亞基含量受組織中氧濃度的調(diào)節(jié)，氧濃度越高H亞基越高，M亞基越少[34]。肝臟、心臟、肺臟組織氧濃度依次增加，LDHB基因編碼的H亞基表達(dá)水平也隨之增加，低氧限制LDHB基因的表達(dá)，在大鼠中得到證實(shí)[32]。

4 結(jié) 論

通過對(duì)類烏齊牦牛LDHB基因克隆及序列分析，結(jié)合不同組織表達(dá)分析，系統(tǒng)闡述LDHB基因的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能，進(jìn)一步完善牦牛能量代謝調(diào)控機(jī)制的試驗(yàn)參數(shù)，為牦牛LDHB基因低氧適應(yīng)性的遺傳特性研究提供理論依據(jù)，同時(shí)也為西藏優(yōu)良牦牛品種相關(guān)生物學(xué)功能研究提供新的數(shù)據(jù)資料。