IL-1β及其受體在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中的表達(dá)定位

王靖雷，王 萌，潘陽(yáng)陽(yáng)，李 秦，何翃閎，黃玉風(fēng)， 趙 凌，樊江峰，崔 燕，余四九

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

細(xì)胞因子最初被認(rèn)定為免疫細(xì)胞分泌的肽和蛋白產(chǎn)物，在胚胎發(fā)育的子宮內(nèi)膜生理和母體調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[1-2]。在哺乳動(dòng)物中，細(xì)胞因子表達(dá)失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致植入和胎盤(pán)形成異常[3]。白細(xì)胞介素-1(IL-1)是一種主要的促炎性細(xì)胞因子，在脊椎動(dòng)物的母-嬰交流界面局部調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜許多生理功能[4]。 IL-1系統(tǒng)由2種激動(dòng)劑(IL-1α，IL-1β)，拮抗劑(IL-1受體拮抗劑，IL-1RN)和受體家族組成。 IL-1受體家族由I型( IL1R1)和II型(IL1R2)IL-1受體和IL1R輔助蛋白(IL1RAP)[5]組成。 IL-1α(IL1A)和 IL-1β(IL1B)都能與 IL1R1和IL1R2結(jié)合，而IL1RAP不能識(shí)別配體，但能增加白細(xì)胞介素的受體親和力[6]。只有IL1R1轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)應(yīng)答IL-1，而IL1R2通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)IL-1結(jié)合來(lái)抑制IL-1的活性[7]。IL-1系統(tǒng)在人[8]、小鼠[9]、牛子宮內(nèi)膜和子宮液[10-11]均有表達(dá),同時(shí)在人類(lèi)、小鼠、豬、牛胚胎中以及豬的子宮液中均檢測(cè)到IL-1β[12-13]。受體IL1R1在人、鼠[12]、豬[14]和牛子宮內(nèi)膜[15]和植入前人和小鼠胚胎中均存在[13,16]。來(lái)自不同物種的植入前胚胎產(chǎn)生并應(yīng)答IL-1[12,17-21]。在人上，植入前胚胎在培養(yǎng)過(guò)程中釋放IL-1β進(jìn)入培養(yǎng)基[22-23]，表明IL-1β分泌可以預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育的潛能，且可作為懷孕的評(píng)價(jià)指標(biāo)。表明IL-1β和 IL1R1在多種哺乳動(dòng)物的生殖過(guò)程具有重要生物學(xué)作用，但相關(guān)機(jī)制還在進(jìn)一步研究中，且存在一定的物種特異性。

牦牛(Bos grunniens)為生活在高寒低氧地區(qū)的珍稀高原物種[24]，是世界上罕見(jiàn)的物種資源之一。與其他家畜相比，牦牛繁殖性能差，且很少應(yīng)用生物技術(shù)[25]。因此，牦牛作為高寒低氧環(huán)境哺乳動(dòng)物生理特性研究的典型，研究 IL-1β和 IL1R1參與牦牛生殖生理調(diào)控對(duì)高寒低氧環(huán)境哺乳動(dòng)物輔助繁殖技術(shù)的提高具有重要意義。

胚胎體外培養(yǎng)的質(zhì)量取決與培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，多種因子協(xié)同可促進(jìn)胚胎發(fā)育[26]。在牛上，授精后8～10 h添加 IL1β可提高胚胎發(fā)育到囊胚期的比例[27]，但 IL1β對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的調(diào)控作用是否存在物種特異性仍需證實(shí)。因此，本研究檢測(cè) IL-1β和 IL1R1在牦牛發(fā)情周期各生殖系統(tǒng)的表達(dá)和分布，并分析其在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平，旨在將胚胎發(fā)育和生殖器官有效結(jié)合，闡明 IL-1β和 IL1R1在牦牛生殖生理調(diào)控中的潛在作用，為進(jìn)一步研究 IL-1β和 IL1R1對(duì)牦牛胚胎發(fā)育的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TCM-199、D-PBS、離子霉素(Ion)、6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)購(gòu)自Sigma公司。胎牛血清(FBS)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；G1/G2聯(lián)合培養(yǎng)液購(gòu)自Vitrolife公司；SOFaa培養(yǎng)液為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┡渲?；組織和胚胎RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司，SYBR GreenⅡ熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)所用試劑均購(gòu)自南京碧云天公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。免疫組織化學(xué)染色試劑盒(包括A 液：10%非免疫動(dòng)物血清；B 液：山羊抗家兔 IgG；C液：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素液)、Rabbit Anti-IL-1Beta、Rabbit Anti-IL-1R1、Goat Anti-rabbit IgG/HRP均購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 樣品收集

1.2.1 組織樣品采集 2017 年 9 月在青海省西寧市樂(lè)家灣屠宰場(chǎng)采集樣品。挑選卵泡期、黃體期和妊娠期健康母牦牛各3 頭(各繁殖生理階段分別處于同一時(shí)期，年齡接近)，頸動(dòng)脈放血致死解剖后迅速采集卵泡期后期(有優(yōu)勢(shì)卵泡>6 mm，子宮黏液和彈性)、黃體期后期(可見(jiàn)多個(gè)黃體)同側(cè)的卵巢、輸卵管和子宮，及妊娠期早期(胚胎約長(zhǎng) 2.3 cm)妊娠側(cè)的卵巢、輸卵管、子宮和胎盤(pán)，無(wú)菌生理鹽水對(duì)其沖洗干凈并修剪后，用錫箔紙將其包裹放入預(yù)先標(biāo)記好的布袋中，速投入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，存于―80 ℃超低溫冰箱中保存，備用。另一部分組織樣品切成小塊后用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液固定帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 牦牛卵母細(xì)胞的采集及體外培養(yǎng) 牦牛卵母細(xì)胞體外成熟：從青海省西寧市樂(lè)家灣屠宰場(chǎng)采集發(fā)情期牦牛的卵巢，將采集的卵巢置于約35 ℃含雙抗(青霉素和鏈霉素)的生理鹽水中，4 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，將帶回實(shí)驗(yàn)室的牦牛卵巢用加入鏈霉素與青霉素的37 ℃生理鹽水沖洗3次，用10 mL注射器將每個(gè)卵巢表面2～8 mm卵泡中的卵泡液抽取到盛有采卵液[D-PBS+5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))FBS]的10 mL離心管中混勻；然后，將采卵液倒入培養(yǎng)皿中，置于體視顯微鏡下，采卵針將采到的卵母細(xì)胞放入盛有采卵液的培養(yǎng)皿中清洗3次；再放入成熟培養(yǎng)液[TCM-199+10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))FBS+100 μg/mL FSH+50 μg/mL LH+100 μg/mL E2+100 μg/mL青霉素+100 μg/mL 鏈霉素]中，在37 ℃ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2和飽和濕度下培養(yǎng)，24 h后以卵母細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)卵丘細(xì)胞并伴有第一極體的出現(xiàn)作為成熟標(biāo)志。

牦牛卵母細(xì)胞孤雌激活：將成熟后的卵母細(xì)胞用D-PBS清洗3次后，移入1 g/L的透明質(zhì)酸酶液體中反復(fù)輕微吹打幾分鐘，使其脫去周?chē)念w粒細(xì)胞。然后，在含有胎牛血清的D-PBS中清洗3次。挑選成熟的卵母細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到離子霉素(5 μmol)微滴液中激活5 min。然后，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液(TCM199)中清洗3次。再將其移入6-DMAP(2 mmol)微滴液中4 h，完成激活。將激活后的卵母細(xì)胞放入含1% BSA的SoFaa培養(yǎng)液中(每100 μL的微滴含有20個(gè)卵母細(xì)胞)，在37 ℃ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2和飽和濕度下培養(yǎng)，分別在48、72、96、120、144和168 h時(shí)收集不同時(shí)期的胚胎，包括2～4細(xì)胞、8細(xì)胞、桑椹胚和囊胚。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)IL-1β和IL1R1 mRNA在組織和胚胎中的表達(dá)

1.3.1 總RNA提取 分別參照Total RNA KitⅠ(Omega，美國(guó))和MicroElute Total RNA Kit(Omega，美國(guó))RNA提取試劑盒說(shuō)明，提取不同時(shí)期雌牦牛主要生殖器官和胚胎的總RNA，并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA。

1.3.2 qRT-PCR 根據(jù)GenBank公布的牛的 IL1-β和 IL1R1 mRNA序列設(shè)計(jì)引物，其具體信息和反應(yīng)條件見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為1 μL cDNA(500 ng/μL)，上下游引物各1 μL(0.2 μmol/mL)，2×SYBR GreenⅡ PCR mix 10 μL，Passive Reference DyeⅡ 0.4 μL，ddH2O 6.6 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。具體反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性10 s、退火10 s(具體溫度見(jiàn)表1)、72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)，所用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為applied biosystems QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，重復(fù)次數(shù)n=3。根據(jù)熔解曲線(xiàn)判斷反應(yīng)特異性，獲得每個(gè)樣品的Ct(cycle threshold，循環(huán)閾值)值，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR 引物信息Table 1 Information of primers used in qRT-PCR

1.4 Western-blot檢測(cè)IL-1β和IL1R1蛋白在組織中的表達(dá)

1.4.1 蛋白質(zhì)樣品制備 取不同時(shí)期牦牛卵巢、輸卵管和子宮組織樣品各0.1 g，分別加入等量的組織均質(zhì)緩沖液(1 mL RIPA+10 μL PMSF)，冰浴振蕩2 h，然后4 ℃ 12 000 g離心5 min，取上清液，并取90 μL，加30 μL溴酚藍(lán)混勻，100 ℃煮10 min，后冰上冷卻5 min，制成變性蛋白，-20 ℃保存，備用。

1.4.2 Western-blot檢測(cè) 先進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE) 電泳， 5%濃縮膠(體積分?jǐn)?shù))和10%(體積分?jǐn)?shù))分離膠；電泳結(jié)束后根據(jù)目的蛋白大小對(duì)照Marker 條帶切膠，選擇濕法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上；用磷酸緩沖鹽溶液-吐溫(PBS+tween 20, PBST)洗 3 次，每次 10 min；用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉置于搖床上室溫封閉95 min；分別加一抗(1∶100稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，取出后用 PBST 洗 3 次，每次10 min；加二抗(1∶1 000稀釋)于搖床上室溫孵育90 min；用 PBST洗3次，每次 10 min；最后用電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi-luminescence, ECL)避光顯色，X 光片顯影、定影，掃描蛋白印跡條帶。每組蛋白重復(fù)3次，Image J軟件分析掃描的蛋白印跡條帶，根據(jù)測(cè)得的灰度值分析蛋白表達(dá)情況(蛋白表達(dá)量=目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值)。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè) IL-1β和IL1R1蛋白在組織中的分布

組織固定完全后，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚4 μm。切片常規(guī)脫蠟至水，在 pH=6的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中進(jìn)行熱誘導(dǎo)的微波抗原修復(fù)，煮沸 5 min，然后維持 8 min，室溫下自然冷卻；滴加φ=3% H2O2(SP 試劑盒)，37 ℃作用 10 min，用以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；滴加封閉液(SP 試劑盒A 液)，37 ℃濕盒孵育 15 min，勿洗只需吸去多余血清，用以減少非特異性背景；滴加一抗(1∶400 稀釋)，37 ℃濕盒孵育 2 h，陰性對(duì)照用 0.02 mol/L PBS 代替一抗；滴加生物素標(biāo)記的二抗(SP試劑盒B 液)，37 ℃下孵育 15 min；滴加 SP 試劑盒中 C 液，濕盒中 37 ℃下孵育15 min；加DAB 顯色液(Invitrogen Zymed，美國(guó))，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色。蘇木精復(fù)染、梯度酒精脫水、透明、封片，晾干后置于顯微鏡(DP71，Olympus，日本)下拍照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對(duì) IL-1β、 IL1R1基因與蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析，每組至少重復(fù)3次，P<0.05表示差異顯著，所有結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。用Graphpad prism 7繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL-1β和IL1R1 mRNA在組織和胚胎中的表達(dá)

經(jīng)擴(kuò)增效率曲線(xiàn)、熔解曲線(xiàn)分析 IL-1β、 IL1R1及內(nèi)參基因GAPDH分別在81.5、84.6和84.2 ℃出現(xiàn)單一產(chǎn)物峰，均與設(shè)計(jì)的引物預(yù)期產(chǎn)物溫度接近，證明引物擴(kuò)增正常特異性良好。

通過(guò)qRT-PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn) IL-1β和 IL1R1基因在雌牦牛卵泡期、黃體期和妊娠期中的輸卵管、卵巢和子宮中均有表達(dá)(圖1)。其中，卵泡期輸卵管 IL-1β和 IL1R1基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于其他2期(圖1-A、圖1-D)。卵泡期和妊娠期卵巢 IL-1β和 IL1R1基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于黃體期(圖1-B和圖1-E)。卵泡期和妊娠期子宮 IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于黃體期(圖1-C)，卵泡期、妊娠期子宮 IL1R1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于黃體期(圖1-F)。表明 IL-1β和 IL1R1在不同時(shí)期雌性牦牛主要生殖器官中存在表達(dá)差異。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同 Different lowercase letter mean significantly different(P<0.05)，the same below

qRT-PCR結(jié)果顯示(圖2) IL-1β和 IL1R1在胚胎發(fā)育過(guò)程中，2～4細(xì)胞、8細(xì)胞、桑椹胚和囊胚中均有表達(dá)。其中8細(xì)胞和桑椹胚時(shí)期 IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于2～4細(xì)胞和囊胚時(shí)期(圖2-A)。桑椹胚時(shí)期 IL1R1基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于2～4細(xì)胞、8細(xì)胞和囊胚期(圖2-B)。結(jié)果表明 IL-1β和 IL1R1基因在孤雌激活胚胎早期發(fā)育過(guò)程中存在表達(dá)差異。

2.2 IL-1β和IL1R1蛋白在組織中的表達(dá)

Western-blot曝光圖掃描結(jié)果顯示(圖3)，IL-1β、IL1R1和β-actin蛋白在雌牦牛卵泡期、黃體期和妊娠期的輸卵管、卵巢和子宮中均有表達(dá)。且蛋白大小與抗體參考說(shuō)明一致，β-actin為 42 ku，IL1R1為 63 ku，IL-1β為30 ku和17 ku。

Western-blot結(jié)果分析顯示，卵泡期輸卵管和卵巢17 ku IL-1β蛋白表達(dá)顯著高于黃體期和妊娠期(圖4-A和圖4-B)。妊娠期子宮17 ku IL-1β蛋白表達(dá)顯著高于其他2期(圖4-C)。

Western-blot結(jié)果分析顯示，卵泡期輸卵管和卵巢30 ku IL-1β蛋白表達(dá)顯著高于黃體期和妊娠期(圖5-A和圖5-B)。妊娠期子宮30 ku IL-1β蛋白表達(dá)顯著高于其他2期(圖5-C)。

圖2 IL-1β和 IL1R1在不同時(shí)期胚胎中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Relative expression level of IL-1β and IL1R1 at different embryonic stages

1～3.卵泡期輸卵管、卵巢、子宮 Fallopian tubes, ovaries and uterus in follicular phase；4～6.黃體期輸卵管、卵巢、子宮 Fallopian tubes, ovaries and uterus in luteal phase；7～9.妊娠期輸卵管、卵巢、子宮 Fallopian tubes, ovaries and uterus in pregnancy

Western-blot結(jié)果分析顯示，黃體期輸卵管IL1R1蛋白表達(dá)顯著高于卵泡期和妊娠期(圖6-A)。卵泡期卵巢IL1R1蛋白表達(dá)顯著高于黃體期和妊娠期(圖6-B)。妊娠期子宮IL1R1蛋白表達(dá)顯著高于卵泡期和黃體期(圖6-C)。

2.3 IL-1β和IL1R1蛋白在組織中的分布

免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕褐色，表示有該蛋白的分布。免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖7)，IL-1β和IL1R1蛋白在卵泡期、黃體期和妊娠期的輸卵管、卵巢和子宮組織切片中均有陽(yáng)性表達(dá)。輸卵管表達(dá)部位為黏膜上皮，卵巢表達(dá)部位為顆粒層和黃體細(xì)胞，子宮表達(dá)部位為子宮內(nèi)膜和子宮腺，IL-1β和IL1R1分布部位相同。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β和 IL1R1在卵泡期、黃體期、妊娠期的輸卵管、卵巢、子宮和體外培養(yǎng)的孤雌激活胚胎中均有表達(dá)，證明在正常生理?xiàng)l件下 IL-1β和 IL1R1廣泛表達(dá)于母牦牛不同繁殖周期的各個(gè)主要生殖器官中。

3.1 IL-1β和 IL1R1在輸卵管中的表達(dá)

卵泡期輸卵管中 IL-1β和 IL1R1基因表達(dá)均高于黃體期與妊娠期，按照牦牛繁殖周期劃分順序卵泡期、黃體期、妊娠期中 IL-1β和 IL1R1基因表達(dá)依次遞減，推測(cè)可能與輸卵管的生理活動(dòng)有關(guān)，卵泡期卵巢產(chǎn)生的雌激素增加，引起輸卵管內(nèi)膜細(xì)胞和微絨毛增長(zhǎng)，輸卵管活動(dòng)增強(qiáng)。IL-1β蛋白與基因表達(dá)基本一致，而 IL1R1基因與蛋白表達(dá)不一致，IL1R1的差異表達(dá)可能是通過(guò)局部反調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)緩和和緩沖IL1的過(guò)度效應(yīng)[28]。免疫組化結(jié)果顯示IL-1β和 IL1R1表達(dá)于輸卵管粘膜上皮細(xì)胞，粘膜上皮細(xì)胞具有分泌功能，報(bào)道稱(chēng)輸卵管分泌的活性物質(zhì)為胚胎早期發(fā)育提供了一個(gè)維持和增強(qiáng)受精的環(huán)境[29-30]， IL-1β和 IL1R1在輸卵管中的表達(dá)結(jié)果與前人研究一致[31]IL-1系統(tǒng)在輸卵管中的表達(dá)具有持續(xù)性，并且輸卵管中IL-1的表達(dá)可能在早期胚胎植入過(guò)程中胚胎-母體間的相互作用中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此推測(cè) IL-1β和IL1R1在牦牛輸卵管中的表達(dá)也具有此作用。

圖4 IL-1β蛋白(17 ku)在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expression levels of IL-1β(17 ku)protein in different tissues

圖5 IL-1β蛋白(30 ku)在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of IL-1β(30 ku)protein in different tissues

3.2 IL-1β和IL1R1在卵巢中的表達(dá)

卵泡期卵巢和妊娠期卵巢中 IL-1β和 IL1R1表達(dá)高于黃體期，免疫組化結(jié)果顯示IL-1β和IL1R1在卵泡顆粒細(xì)胞胞質(zhì)、妊娠期黃體細(xì)胞有表達(dá)。卵泡期卵巢受FSH的影響卵泡明顯增長(zhǎng)，并且產(chǎn)生的雌激素增加，排卵和分泌各種激素為受精做準(zhǔn)備。妊娠期卵巢上一直存在黃體維持妊娠，并且會(huì)有卵泡發(fā)育，卵巢生理活動(dòng)增強(qiáng)。卵巢具有眾多功能，包括提供能受精的卵母細(xì)胞和分泌生殖激素以及維持雌性動(dòng)物發(fā)情周期。卵巢功能直接影響著雌性動(dòng)物的繁殖能力[32]。每個(gè)發(fā)情周期過(guò)程中，卵巢都會(huì)經(jīng)歷增殖、侵襲、分化和細(xì)胞凋亡；這些正常的生理變化直接影響和決定了雌性動(dòng)物的排卵、受精率和產(chǎn)仔數(shù)[33]。前人研究發(fā)現(xiàn)IL-1能夠誘導(dǎo)排卵。在大鼠中，IL-1通過(guò)提高卵母細(xì)胞的排卵率來(lái)增強(qiáng)LH的誘發(fā)性排卵效果[34-35]。并且這一發(fā)現(xiàn)在母馬上得到證實(shí)[36]。相反，使用IL1R1[37]、卵巢注射[38]或卵泡內(nèi)注射時(shí)能降低排卵率或延遲排卵排卵時(shí)間。這些研究已經(jīng)證實(shí)IL-1參與排卵，并且這種效應(yīng)是由特異性受體介導(dǎo)的。綜上所述， IL-1β和 IL1R1在牦牛卵巢的表達(dá)可能與牦牛卵母細(xì)胞的成熟、排卵和早期胚胎發(fā)育有關(guān)。

圖6 IL1R1蛋白(63 ku)在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.6 Relative expression levels of IL1R1(63 ku)protein in different tissues

3.3 IL-1β和IL1R1在子宮中的表達(dá)

妊娠期子宮中 IL-1β和 IL1R1基因和蛋白的表達(dá)均高于卵泡期和黃體期。免疫組化結(jié)果顯示 IL-1β和 IL1R1在子宮上皮細(xì)胞及子宮腺中表達(dá)。子宮作為動(dòng)物胎兒或幼體發(fā)育生長(zhǎng)的場(chǎng)所，在整個(gè)動(dòng)物繁殖過(guò)程中扮演著重要的角色，整個(gè)妊娠期中子宮為胎兒提供發(fā)育的環(huán)境，并且提供胎兒發(fā)育所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本研究中IL-1β和 IL1R1在子宮上皮細(xì)胞及子宮腺中分布這與前人報(bào)道 IL1R1在妊娠前期豬子宮腺上皮細(xì)胞中[12,39]和牛子宮內(nèi)膜中檢測(cè)到[15]一致。IL-1β強(qiáng)表達(dá)于牛子宮內(nèi)膜，在基質(zhì)中較弱[40]并且推測(cè)IL-1β可能在牛子宮內(nèi)膜中以旁分泌/自分泌的方式起作用，這種結(jié)果在豬上也有發(fā)現(xiàn)[41]。前人報(bào)道IL1系統(tǒng)可能參與胚胎在牛[11]和豬子宮環(huán)境中胚胎營(yíng)養(yǎng)狀況的改善[42]。因此推測(cè) IL-1β和 IL1R1在牦牛子宮中的表達(dá)也可能參與妊娠的建立及胎兒的發(fā)育，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

3.4 IL-1β和IL1R1在孤雌激活胚胎中的表達(dá)

牦牛孤雌激活胚胎中 IL-1β在桑椹胚時(shí)期最高，8細(xì)胞次之，而在2細(xì)胞和囊胚時(shí)期最低， IL1R1表達(dá)結(jié)果與 IL-1β基本一致。在2細(xì)胞時(shí)期表達(dá)最低可能與母源物質(zhì)的影響有關(guān)，隨著胚胎的發(fā)育，母源物質(zhì)逐漸下降，胚胎基因組激活后，轉(zhuǎn)錄表達(dá)開(kāi)始，胚胎的發(fā)育逐漸由自身合成的物質(zhì)來(lái)調(diào)控，其代謝活動(dòng)逐步由母源的mRNA向合子本身的mRNA控制過(guò)度，這一過(guò)程即使發(fā)育由母源向胚胎調(diào)控轉(zhuǎn)變[43]。本研究發(fā)現(xiàn) IL-1β在8細(xì)胞有較高分泌水平，與前人報(bào)道在人和豬上 IL-1β由植入前囊胚分泌[19]的結(jié)果不一致，可能是由于物種差異。相關(guān)報(bào)道稱(chēng)胚胎培養(yǎng)基中的IL1濃度與體外受精和胚胎移植后成功植入呈正相關(guān)[22,25]與早期妊娠有相關(guān)性。

A～I(xiàn).免疫組織化學(xué)染色圖片 A-I are immunohistochemical staining photos；其中A、B、C、D、E為陽(yáng)性表達(dá) A,B,C,D,E are positive expression，F(xiàn)、G、H、I為陰性對(duì)照 G,H,I are negative control；A、F為輸卵管 Fallopian tube，B、E、G為卵巢 Ovary，C、D、H、I為子宮 Uterus；EM：黏膜上皮 Mucosal epithelium；SG.顆粒層 Stratum granulosum；EP.子宮內(nèi)膜 Epithelium mucosae；UG.子宮腺 Uterine glands；CL.黃體細(xì)胞 Corpus luteum verum

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中對(duì) IL-1β和 IL1R1的表達(dá)進(jìn)行定位分析。研究發(fā)現(xiàn) IL-1β和 IL1R1在雌性牦牛不同時(shí)期的生殖器官和孤雌激活胚胎中均有表達(dá)并且存在差異，表明 IL-1β和 IL1R1在牦牛生殖過(guò)程中具有重要的生物學(xué)作用，推測(cè)其可能參與牦牛卵母細(xì)胞成熟、排卵、早期胚胎和妊娠期胎兒的發(fā)育，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。