陜西關(guān)中地區(qū)蘋(píng)果褐斑病菌遺傳多樣性分析

宋艷艷，謝士昌，高小寧，馮 浩，黃麗麗，韓青梅

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

蘋(píng)果褐斑病是由子囊菌門(mén)蘋(píng)果殼二孢Diplocarponmali，(無(wú)性態(tài)為Marssoninacoronariae)引起的蘋(píng)果早期落葉病害之一，在世界上各蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)都有分布[1]，常引起生長(zhǎng)季節(jié)果樹(shù)葉片黃化和大量脫落，導(dǎo)致樹(shù)體衰弱，影響蘋(píng)果的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。蘋(píng)果褐斑病在中國(guó)最早發(fā)生于湖北省[2]，該病害在中國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)屬于連年流行病害，并有逐漸加重的趨勢(shì)[3]。目前生產(chǎn)上對(duì)該病害的防治以噴施化學(xué)藥劑為主，但是使用化學(xué)藥劑存在生產(chǎn)成本高、農(nóng)藥殘留和病菌抗藥性等問(wèn)題[4]，因此選育抗病品種，挖掘抗病種質(zhì)資源對(duì)于蘋(píng)果褐斑病的可持續(xù)控制具有重要意義。

近年來(lái)分子技術(shù)成為遺傳多樣性檢測(cè)的有效手段，簡(jiǎn)單序列間重復(fù)(ISSR)是由Zietkiewicz等[5]提出的一種多態(tài)性分子標(biāo)記，該技術(shù)使用16～25 bp的微衛(wèi)星引物，利用多種基因組位點(diǎn)的單引物PCR反應(yīng)擴(kuò)增不同大小的ISSR序列[6]。ISSR是一種顯性遺傳標(biāo)記，可以生成大量信息和可復(fù)制的等位基因，具有成本低、使用方便、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等特點(diǎn)[7]，該技術(shù)不需要特殊的DNA序列，并且能夠克服RAPD和AFLP等技術(shù)的限制[8-9]，同時(shí)微衛(wèi)星中的進(jìn)化速率比大多數(shù)其他類型的DNA高，所以這些序列的多態(tài)性可能更大[6]。目前，ISSR分子標(biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)從植物擴(kuò)展到真菌方面[10-12]，在對(duì)植物病原真菌的研究中，該技術(shù)常被用來(lái)研究病原真菌的群體遺傳和生理小種鑒定、病原菌致病性、遺傳多樣性等。

本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)ISSR-PCR擴(kuò)增，對(duì)分離自陜西省關(guān)中地區(qū)7個(gè)縣(區(qū))蘋(píng)果褐斑病菌的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期了解不同地區(qū)蘋(píng)果褐斑病菌的群體遺傳多樣性及其與地理來(lái)源之間的關(guān)系，為病害的防治和抗病育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

蘋(píng)果褐斑病菌(D.mali)由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院果樹(shù)病害病原生物學(xué)及綜合防治研究室提供，分離自陜西關(guān)中7個(gè)(縣)區(qū)，共64株，樣品采集地點(diǎn)：關(guān)中東部，白水縣10株；關(guān)中中部，乾縣4株、楊凌區(qū)15株；關(guān)中西部，陳倉(cāng)區(qū)6株、扶風(fēng)縣15株、鳳翔縣7株、眉縣7株。

1.2 菌株活化

將保存于-80 ℃的蘋(píng)果褐斑病菌轉(zhuǎn)移至馬鈴薯胡蘿卜葡萄糖瓊脂(PCDA)培養(yǎng)基上[13]，在25 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)3周，將活化的菌體再轉(zhuǎn)接擴(kuò)繁，相同條件下培養(yǎng)7 d，用接種針刮取培養(yǎng)基上的菌體，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱，備用。

1.3 模板DNA制備

將在-80 ℃下保存的蘋(píng)果褐斑病菌體在液氮中充分研磨，使用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)提取DNA，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)品質(zhì)和濃度。當(dāng)DNA無(wú)降解，OD260/280和OD260/230的值均為1.8～2.0時(shí)，說(shuō)明DNA符合使用要求，4 ℃保存，備用。

1.4 ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

1.4.1 ISSR-PCR反應(yīng)體系 供試ISSR引物由西安擎科澤西生物科技有限公司合成。ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序如下：

反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix 5 μL，ISSR引物(10 μmol/L)0.5 μL，模板DNA(200 ng/μL)0.6 μL，ddH2O補(bǔ)至10 μL。

擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；隨后94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 再延伸10 min；最后于16 ℃保存。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，吸取7 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，使用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在120 V電壓下電泳30 min，電泳完成后使用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。

1.4.2 ISSR引物及引物退火溫度篩選 根據(jù)每一條引物的Tm值，設(shè)置退火溫度梯度，溫度范圍為43～50 ℃和50～58 ℃，使用上述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。篩選條帶清晰、無(wú)彌散、多態(tài)性穩(wěn)定的引物，隨后將篩選出的引物再進(jìn)行擴(kuò)增確定最佳退火溫度，最后將篩選出的引物以64個(gè)菌株的基因組DNA為模板，進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，每條引物重復(fù)擴(kuò)增3次。

1.5 ISSR-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

由于ISSR標(biāo)記是顯性遺傳標(biāo)記，每個(gè)條帶都可以作為一個(gè)等位基因位點(diǎn)[14]，依次對(duì)每一條引物擴(kuò)增的帶型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，選擇清晰、穩(wěn)定的條帶，模糊不清的條帶忽略不計(jì)。首先確定條帶的大小，根據(jù)同一大小處條帶的有無(wú)，分別記為“1”和“0”，構(gòu)建0-1矩陣表。

利用Popgene 1.32 軟件計(jì)算以下參數(shù)：(1)反映基因多少和狀況的遺傳參數(shù)：多態(tài)性條帶數(shù)(Number of polymorphic loci，NP)、多態(tài)條帶百分率(Percentage of polymorphic loci，P)、等位基因觀測(cè)數(shù)(Observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles，Ne)；(2)反映基因多樣性信息的遺傳參數(shù)：Nei’s基因多樣性指數(shù)(Gene diversity，H)、Shannon信息指數(shù)(Shannon’s information index，I)；(3)反應(yīng)遺傳分化程度的參數(shù)：種群遺傳分化系數(shù)(Coefficient of genetic differentiation among population within species，Gst)，Gst=Dst/Ht，其中Dst=Ht-Hs，Ht為總遺傳多樣性，Hs為群體內(nèi)的遺傳多樣性，Dst為群體間遺傳多樣性。根據(jù)Wright的Fst算法[15]，得到反映基因流強(qiáng)度的居群每代遷移數(shù)(Number of migrants per generation，Nm)其關(guān)系為：Fst=1/(1 + 4Nm)，Nm(W)=(1 -Fst)/4Fst，在此，F(xiàn)st可認(rèn)為等同于Gst。當(dāng)Nm>1(N為有效居群大小，m為基因流比率)時(shí)，證明種群間存在一定的基因流動(dòng)，能發(fā)揮勻質(zhì)化作用；當(dāng)Nm<1時(shí)，則表示基因流傳受到部分阻礙，亞群體間隨即蘊(yùn)藏遺傳分化的潛能；如果Nm>4，它們就是一個(gè)隨機(jī)單位。利用Popgene 1.32軟件計(jì)算不同類群的遺傳距離和遺傳一致度，并用NTsys-2.0軟件使用非加權(quán)算術(shù)平均聚類(UPGMA)方法進(jìn)行群體聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR擴(kuò)增篩選引物及引物退火溫度

經(jīng)過(guò)多次的ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果表明，引物的退火溫度是影響ISSR-PCR特異性的重要因素之一，通過(guò)設(shè)置退火溫度梯度，選擇多態(tài)性條帶穩(wěn)定且清晰的引物進(jìn)行重復(fù)擴(kuò)增，確定最適退火溫度。圖1為引物BIS07和BIS15在不同溫度下的擴(kuò)增結(jié)果，二者的最佳退火溫度確定為50.0 ℃，其他引物的退火溫度如表1所示。最終從40條ISSR引物中篩選出11條擴(kuò)增效果好的引物，引物序列見(jiàn)表1，部分引物擴(kuò)增電泳圖如圖2(引物P 5)和圖3(引物BIS15)所示，條帶清晰無(wú)雜帶，并且具有多態(tài)性。

2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增檢測(cè)蘋(píng)果褐斑病菌遺傳多樣性

對(duì)篩選出的11條引物進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，二核苷酸重復(fù)的引物多態(tài)性較高，平均值為92.3%，同時(shí)二核苷酸重復(fù)引物有9條，占到總引物的81.8%，三核苷酸重復(fù)的引物僅有2條，且引物的多態(tài)性百分率低，分別為33.3%(824)和50.0%(P5)，說(shuō)明在蘋(píng)果褐斑病菌的基因組中富含較多的二核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列；從引物序列中可知，當(dāng)引物的重復(fù)序列為(AG)、(GA)、(CT)、(TC)、(AC)時(shí)，引物表現(xiàn)出更高的多態(tài)性。從11條ISSR引物共擴(kuò)增得到82個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)71個(gè)，引物擴(kuò)增得到的總位點(diǎn)數(shù)為4～12個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為2～11個(gè)，平均每條引物擴(kuò)增7.5個(gè)位點(diǎn)，6.5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)的百分率為33.3%～100.0%，平均多態(tài)性位點(diǎn)率為86.6%，說(shuō)明蘋(píng)果褐斑病菌具有遺傳多樣性。

泳道1～8的溫度依次為：50.0 ℃、50.8 ℃、51.8 ℃、53.2 ℃、55.0 ℃、56.5 ℃、57.4 ℃、58.0 ℃ Annealing temperature of lane 1 to 8 is 50.0 ℃,50.8 ℃,51.8 ℃,53.2 ℃,55.0 ℃, 56.5 ℃,57.4 ℃,58.0 ℃,respectively；左圖為引物BIS07的溫度梯度，右圖為引物BIS15的溫度梯度 The left plate shows the temperature gradient for the primer BIS07,and the right for BIS15；DNA模板為Hbj-0435 The DNA template is Hbj-0435；M.DS2000

表1 供試ISSR引物擴(kuò)增特征Table 1 The amplification characteristics of selected ISSR primers

2.3 不同縣(區(qū))蘋(píng)果褐斑病菌群體遺傳多樣性分析

陜西省關(guān)中平原不同縣(區(qū))蘋(píng)果褐斑病菌群體遺傳多樣性參數(shù)如表2所示，結(jié)果表明，蘋(píng)果褐斑病菌具有較豐富的遺傳多樣性。在物種水平上，病菌的等位基因觀測(cè)數(shù)(Na)為1.87，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.48，Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.29，Shannon 信息指數(shù)(I)為0.44，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)(NP)為71個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)率(P)為86.59%。在群體水平上，病菌的等位基因觀測(cè)數(shù)為1.50～1.77，平均為1.67；有效等位基因數(shù)為1.30～1.45，平均為1.41；Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.20～0.26，平均為0.24；Shannon 信息指數(shù)為0.20～0.40，平均為0.35；多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為 41～62個(gè)，平均為55個(gè)；多態(tài)性位點(diǎn)率為50.00%～76.83%，平均為66.72%。其中渭南市白水縣(Na=1.76，Ne=1.45，H=0.26，I=0.40)種群的遺傳多樣性水平最高，咸陽(yáng)市乾縣(Na= 1.50，Ne=1.36，H=0.20，I=0.29)種群的遺傳多樣性水平相對(duì)較低。

1～17.Hbj-0364,Hbj-0369,Hbj-0371,Hbj-0375,Hbj-0347,Hbj-0336,Hbj-0341,Hbj-0343,Hbj-0311,Hbj-0439,Hbj-0416,Hbj-0400,Hbj-0414,Hph-0027,Hph-0070,Hph-0101,Hph-0105; M. DS2000;下同 The same below

圖3 引物BIS15對(duì)17株蘋(píng)果褐斑病菌株的ISSR-PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 The ISSR-PCR amplification of 17 isolates of D.mali with primer BIS15

表2 不同縣(區(qū))蘋(píng)果褐斑病菌遺傳多樣性分析Table 2 Genetic diversity analysis of D.mali of different counties

2.4 關(guān)中地區(qū)蘋(píng)果褐斑病菌群體遺傳多樣性和遺傳分化分析

陜西省關(guān)中地區(qū)蘋(píng)果褐斑病菌群體遺傳多樣性的參數(shù)如表3所示，結(jié)果顯示，關(guān)中西部地區(qū)群體的等位基因觀測(cè)數(shù)為1.84，有效等位基因數(shù)為1.47，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.28，Shannon 信息指數(shù)為0.43，高于中部地區(qū)和東部地區(qū)，說(shuō)明關(guān)中西部地區(qū)的群體遺傳多樣性高于關(guān)中中部和東部。

陜西省關(guān)中地區(qū)蘋(píng)果褐斑病菌群體遺傳分化程度的參數(shù)如表4所示，結(jié)果顯示，關(guān)中平原不同地區(qū)的遺傳分化程度不同。其中東部、西部、中部地區(qū)遺傳分化系數(shù)(Gst)分別為0.17、0.14、0.13，東部的遺傳分化系數(shù)高于中部和西部。在群體水平上，遺傳分化系數(shù)為0.03，即群體內(nèi)的遺傳多樣性占總?cè)后w遺傳多樣性的97%，群體間的遺傳多樣性占總?cè)后w多樣性的3%，說(shuō)明遺傳分化主要發(fā)生在群體內(nèi)。關(guān)中中部的基因流(Nm=1.62)高于西部(Nm=1.51)和東部(Nm=1.24)，表明不同地區(qū)的種群間存在不同程度的基因交流，其中中部地區(qū)種群間的基因交流更廣泛。由表中數(shù)據(jù)可以看出，不同區(qū)域之間的群體基因交流也存在差異，其中關(guān)中東部和西部地區(qū)之間的基因流最大(Nm=7.79)，其次為關(guān)中東部和中部之間(Nm=3.97)，關(guān)東中部和西部之間的基因交流相對(duì)較少(Nm=3.85)，說(shuō)明關(guān)中東部和西部地區(qū)之間存在更頻繁的基因交流。

表3 陜西關(guān)中地區(qū)蘋(píng)果褐斑病菌群體遺傳多樣性分析Table 3 Genetic diversity analysis of D.mali populations in Guanzhong Shaanxi

表4 陜西關(guān)中地區(qū)蘋(píng)果褐斑病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化分析Table 4 Genetic structure and genetic differentiation analysis of D.mali populations in Guanzhong Shaanxi

2.5 不同縣(區(qū))蘋(píng)果褐斑病菌種群的聚類分析

遺傳距離和遺傳一致度是衡量群體之間的遺傳分化程度的重要指標(biāo)之一，通過(guò)分析蘋(píng)果褐斑病菌群體的遺傳距離和遺傳一致度，結(jié)果(表5)顯示，不同縣(區(qū))群體之間的遺傳距離范圍為0.036 1～0.144 9；其中白水縣和眉縣的遺傳距離最近，為0.036 1，同時(shí)兩者之間的遺傳一致度最高；楊凌區(qū)和陳倉(cāng)區(qū)之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.144 9，遺傳一致度最低。根據(jù)群體的遺傳一致度，使用NTsys-2.0軟件進(jìn)行不同地區(qū)蘋(píng)果褐斑病菌群體聚類分析，結(jié)果(圖4)顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.92時(shí)，7個(gè)縣(區(qū))的病菌被分為3個(gè)類群，類群1包括陳倉(cāng)區(qū)；類群2包括鳳翔縣、乾縣、白水縣、眉縣、扶風(fēng)縣，為優(yōu)勢(shì)類群；類群3包括楊凌區(qū)。以上結(jié)果表明，不同地理種群之間的遺傳距離存在差異，種群之間的遺傳親緣關(guān)系與分離株的地理來(lái)源之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性。

表5 不同縣(區(qū))蘋(píng)果褐斑病菌株的遺傳距離Table 5 Nei’s genetic distance of D.mali in different counties

圖4 陜西關(guān)中地區(qū)蘋(píng)果褐斑病菌不同自然種群的 UPGMA 聚類圖Fig.4 The UPGMA dendrogram of D.mali populations in Guanzhong Shaanxi

3 討 論

ISSR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用是由于其重復(fù)性良好，且比RAPD更穩(wěn)定，通過(guò)檢測(cè)多個(gè)遺傳位點(diǎn)之間的差異，表現(xiàn)出更高的多態(tài)性，是一種高效、可靠的分子標(biāo)記技術(shù)。研究表明，通常在3′或5′端錨定的二核苷酸重復(fù)的ISSR引物具有高度的多態(tài)性[16-18]。本研究的ISSR引物篩選結(jié)果也表明，二核苷酸重復(fù)的引物多態(tài)性較高，平均值為92.3%。通常來(lái)說(shuō)，相比較于其他的三核苷酸和四核苷酸序列，ISSR引物的重復(fù)序列為(AG)、(GA)、(CT)、(TC)、(AC)、(CA)時(shí)，引物表現(xiàn)出更高的多態(tài)性[6]，這與本研究篩選到的多態(tài)性引物序列特征相符合。由此可見(jiàn)，本研究使用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析病原菌的遺傳多樣性是可靠的。

種群遺傳多樣性分析結(jié)果表明，渭南市白水縣群體遺傳多樣性水平最高。李旻等[19]利用ISSR標(biāo)記研究球孢白僵菌遺傳多樣性，認(rèn)為其遺傳多態(tài)性差異與地理環(huán)境以及氣候有關(guān)。蘋(píng)果褐斑病在陜西省各蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，但是各地的發(fā)病程度卻不相同，相比較于其他6個(gè)縣(區(qū))，白水縣晝夜溫差大，夜間在葉片上易形成潮濕的環(huán)境，利于病害發(fā)生，因此該地區(qū)褐斑病發(fā)生嚴(yán)重[20]。據(jù)此推測(cè)各地種群遺傳多樣性差異與病害發(fā)生的嚴(yán)重程度有關(guān)。

遺傳分化系數(shù)是衡量群體間和群體內(nèi)相對(duì)遺傳變異大小的重要指標(biāo)，能夠很好的解釋群體遺傳變異。種群之間的基因分化水平與很多因素有關(guān)，如長(zhǎng)期進(jìn)化歷史和物種的性質(zhì)、基因流動(dòng)、種群隔離等[21]。本研究中從群體水平分析發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果褐斑病菌種群間的遺傳分化程度較低，病菌的遺傳分化主要發(fā)生在群體內(nèi)；同時(shí)群體之間存在基因流動(dòng)，存在均質(zhì)化作用，不易出現(xiàn)遺傳分化，不同地區(qū)之間也存在菌源流動(dòng)?；蛄鞯拇嬖谀軌蛴绊懭后w的遺傳結(jié)構(gòu)，基因流傳播越順暢則遺傳分化程度越低[22]。王建鋒等[23]利用TP-M13-SSR 自動(dòng)熒光檢測(cè)技術(shù)，分析陜西省小麥條銹菌群體遺傳結(jié)構(gòu)，認(rèn)為基因流是陜西省小麥條繡菌群體遺傳分化程度低的影響因素之一。因此推測(cè)導(dǎo)致蘋(píng)果褐斑病菌群體間遺傳分化程度低的原因是群體間基因流動(dòng)頻繁。

本研究中對(duì)于蘋(píng)果褐斑病菌種群遺傳變異的分析，將有助于研究遺傳變異與其他表型性狀如致病性的相關(guān)性。另一方面，種群的遺傳多樣性與物種的進(jìn)化發(fā)展相關(guān)聯(lián)[21]，可進(jìn)一步為抗病育種工作提供理論依據(jù)。但是由于本研究的供試菌株分離樣品僅局限于陜西省關(guān)中地區(qū)，因此對(duì)于更多地區(qū)病原菌之間的遺傳多樣性，尚待深入研究論證。