抑制紫色素桿菌12472群感效應(yīng)放線菌的篩選

穆永其，曾 紅，陳 偉,2

(1.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

由于抗菌藥物的濫用，細(xì)菌耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)重，使新抗生素的產(chǎn)生速度遠(yuǎn)低于細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生速度。以直接殺死微生物或抑制其生長(zhǎng)的傳統(tǒng)靶點(diǎn)和篩選方法獲得的抗生素，無(wú)法從根本上解決細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題[1]。細(xì)菌耐藥性是由群感效應(yīng)控制的，其調(diào)控細(xì)菌色素產(chǎn)生、毒力基因表達(dá)、生物膜形成等[2]。因此，研發(fā)不抑菌抑制群感效應(yīng)(Quorum sensing，QS)的新型藥物，有望改良細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的重點(diǎn)。

越來(lái)越多的研究表明，細(xì)菌耐藥性與生物膜形成有關(guān)[3]。許多細(xì)菌由于具有形成生物膜的能力而對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性[4]。而QS則是控制生物膜形成的重要機(jī)制[5]。因此，尋找群感效應(yīng)抑制劑(QS inhibitors，QSI)有望從新的角度解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題。本研究以源自新疆南疆地區(qū)的放線菌為材料，紫色素桿菌ATCC 12472為靶標(biāo)菌，篩選群感效應(yīng)抑制劑，為以QS為靶標(biāo)的新型藥物研發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

1.1.1 菌株 紫色素桿菌ATCC 12472 由中國(guó)海洋大學(xué)饋贈(zèng)。170 株新疆南疆地區(qū)放線菌均來(lái)自兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基 高氏一號(hào)培養(yǎng)基：淀粉 20.0 g，KNO31.0 g，F(xiàn)eSO40.01 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂 16.0 g，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌 30 min。

Am6培養(yǎng)基：淀粉 20.0 g，葡萄糖 10.0 g，蛋白胨 5.0 g，酵母浸膏 5.0 g，CaCO35.0 g，瓊脂 16.0 g，pH 7.0，115 ℃滅菌 30 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 16.0 g，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌 30 min。

1.2 放線菌菌株活化及發(fā)酵

將保藏的放線菌，菌液涂布于固體平板上，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng) 3～7 d 進(jìn)行活化，觀察菌落生長(zhǎng)情況。在生長(zhǎng)良好的固體平板菌上用藍(lán)槍頭打菌餅，接種于 500 mL、裝液量為150 mL的種子培養(yǎng)基中(每瓶接 5～10 個(gè)菌餅)，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 5～7 d。將生長(zhǎng)良好的種子液按4%的接種量接種于 500 mL、裝液量為 150 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 7 d，同時(shí)觀察菌體生長(zhǎng)情況。發(fā)酵液 12 000 r/min 離心 15 min，取上清，0.45 μm 微孔濾膜無(wú)菌過(guò)濾，去除菌體后，-20 ℃貯藏，備用[6]。

1.3 放線菌發(fā)酵液對(duì)紫色素桿菌12472群感效應(yīng)的影響

采用微量板半定量法[7]檢測(cè)放線菌發(fā)酵液對(duì)ChromobacteriumviolaceumATCC 12472 群感效應(yīng)抑制能力：按 1∶100 的接種比例將過(guò)夜培養(yǎng)的 12472 菌液 100 μL，接種至 10 mL LB培養(yǎng)基中，振蕩搖勻。配制最終體積分?jǐn)?shù)為50%的發(fā)酵液與菌液的混合液，吸取 200 μL 混合液至 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每株接種 4 孔。每一培養(yǎng)板中同時(shí)設(shè)對(duì)照(等體積的 12472 菌液)與空白對(duì)照(等體積的 LB 培養(yǎng)基)各 4 孔。30 ℃ 恒溫靜置培養(yǎng) 24 h 后，取出 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板觀察色素產(chǎn)生情況。用酶標(biāo)儀測(cè) OD590，檢測(cè)紫色素桿菌的生長(zhǎng)情況。所有試驗(yàn)均在不同時(shí)間重復(fù) 3 次。

1.4 紫色桿菌素定量方法

按Choo等[8]的方法測(cè)量紫色桿菌素：吸取1 mL培養(yǎng)好的菌液于1.5 mL離心管中，13 000 r/min 離心 10 min，使紫色桿菌素和菌體充分沉淀。去掉上清液，加 1 mL 二甲亞砜(DMSO)于離心管中，渦旋充分振蕩，使紫色桿菌素溶解于DMSO 中。13 000 r/min 再次離心10 min，沉淀菌體及碎屑。測(cè)定上清 OD585nm處的光吸收值。

1.5 放線菌的分子生物學(xué)鑒定

參照文獻(xiàn)[9]介紹的方法，PCR擴(kuò)增放線菌的16S rDNA基因，送測(cè)序公司測(cè)序后比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制紫色素桿菌12472色素產(chǎn)生的放線菌篩選

從170株新疆南疆地區(qū)放線菌中篩選抑制紫色素桿菌12472色素產(chǎn)生的菌株。用微孔板半定量法初篩，選出抑制效果最好的有37株，占檢測(cè)總菌株數(shù)的 21.74%；抑制效果適中的有22株，占檢測(cè)總菌株數(shù)的 12.94%；抑制效果最差的有52株，占檢測(cè)總菌株數(shù)的 30.59%；促進(jìn)紫色經(jīng)過(guò)多次發(fā)酵復(fù)篩，選出活性穩(wěn)定、抑制紫色素桿菌12472色素產(chǎn)生效果最好的放線菌菌株5株(圖2)，分別為TRM10325、10303′、20813、10311、11402。用紫色桿菌素定量方法，定量經(jīng)發(fā)酵液處理后紫色素桿菌產(chǎn)色素能力的改變情況。其中放線菌TRM10325、10303′、20813、10311、11402的發(fā)酵液使紫色素桿菌12472產(chǎn)色素能力分別降低75.13%、65.46%、68.61%、84.72%和70.21%。

素桿菌生長(zhǎng)的有45株，占檢測(cè)總菌株數(shù)的 26.47%；抑制紫色素桿菌生長(zhǎng)的有14株，占檢測(cè)總菌株數(shù)的 8.24%(圖1)。

圖1 170 株放線菌抑制紫色素桿菌色素產(chǎn)生能力檢測(cè)Fig.1 Performance of 170 actinomycetes strains on violacein production of C.violaceum ATCC12472

2.2 菌株鑒定

根據(jù) 16S rDNA 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[10](圖3)。測(cè)序結(jié)果在 NCBI 中比對(duì)[11]，顯示5株菌TRM10325、10303′、20813、10311、11402均為鏈霉菌屬。

圖2 5株放線菌發(fā)酵液對(duì)紫色桿菌素產(chǎn)生的抑制Fig.2 Inhibition of violaceum production by five strains of actinomyces extract

圖3 5株鏈霉菌TRM10325、10303′、20813、10311、11402 基于16S rDNA鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 The 16S rDNA Neighbor-joining phylogenetic tree of strain TRM10325,10303′,20813,10311,11402

3 討 論

選取兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從新疆南疆地區(qū)分離鑒定的放線菌，篩選抑制紫色素桿菌12472色素產(chǎn)生的活性菌株。經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證，得到5株不抑菌、但抑制其紫色桿菌素產(chǎn)生的放線菌，分別為TRM10325、10303′、20813、10311、11402，經(jīng)鑒定5株菌均為鏈霉菌屬。

在試驗(yàn)初期發(fā)現(xiàn)紫色素桿菌12472不易存活，因此對(duì)其存活時(shí)間進(jìn)行摸索。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基上的菌存活時(shí)間為16 d，在存活12 d以內(nèi)活性最好。轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基中的菌存活時(shí)間約為13 d，在存活11 d以內(nèi)活性最好。因此，從存活時(shí)間的長(zhǎng)度來(lái)看，轉(zhuǎn)接自固體培養(yǎng)基上的菌存活時(shí)間更久，所以在做活性驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，會(huì)優(yōu)先選擇固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的紫色素桿菌。而關(guān)于紫色素桿菌12472存活時(shí)間的試驗(yàn)，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

從試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不抑制菌生長(zhǎng)、但抑制其紫色桿菌素的產(chǎn)生，主要有3種情況：①菌體正常生長(zhǎng)，但幾乎是無(wú)色的，只有微量的紫色桿菌素產(chǎn)生。②菌體正常生長(zhǎng)，紫色桿菌素恢復(fù)的很快，24 h 后就恢復(fù)正常的紫色。③菌體正常生長(zhǎng)，紫色桿菌素恢復(fù)較慢，24 h后只有薄薄的紫色。過(guò)幾天后，紫色又會(huì)恢復(fù)正常。為了排除抑菌導(dǎo)致紫色桿菌素減少的情況，做如下處理：首先用酶標(biāo)儀測(cè)OD590，與紫色素桿菌的對(duì)照組進(jìn)行比較，看菌體生長(zhǎng)量是否下降，下降證明抑菌；其次用觀察法驗(yàn)證，抑菌的孔一般是透亮的，而有菌體生長(zhǎng)的孔呈渾濁。

本試驗(yàn)所用的微孔板半定量法是篩選 QSI 的有效方法，其中用96孔板法篩選紫色素桿菌QSI，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。用微孔板半定量法對(duì)放線菌發(fā)酵液進(jìn)行群感效應(yīng)抑制活性的篩選，得到37株不抑菌，但抑制紫色素桿菌12472色素產(chǎn)生的放線菌菌株，其中TRM10325、10303′、20813、10311、11402等5株菌，經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證，抑制活性較好。在后續(xù)的試驗(yàn)中，將對(duì)活性放線菌進(jìn)行大批量發(fā)酵，分離純化單體活性化合物，探究其抑制機(jī)制，希望能為細(xì)菌感染提供新的治療策略，并為研發(fā)新藥提供試驗(yàn)依據(jù)。