棉花黃萎病生防芽孢桿菌S12產芽孢培養(yǎng)基的響應面優(yōu)化

李全勝，張國麗，呂 寧，陳 云，武冬梅，謝宗銘

(1.新疆農墾科學院 生物技術研究所，作物種質創(chuàng)新與基因資源利用兵團重點實驗室,新疆石河子 832000；2.新疆農墾科學院，新疆石河子 832000；3.新疆農墾科學院 農田水利與土壤肥料研究所，新疆石河子 832000)

大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)寄主范圍廣泛，可侵染600多種植物，其侵染棉花引發(fā)的棉花黃萎病是一種世界范圍的毀滅性土傳病害，給棉花生產造成了巨大的損失[1-3]。在新疆棉花主產區(qū)，長期連作和秸稈還田現象普遍，導致土壤中黃萎病菌菌源量逐年增加，病害發(fā)生也呈現逐年擴大和加重趨勢，嚴重阻礙了新疆棉花產業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[4-6]。隨著公眾環(huán)保意識和健康意識的增強，采用生物菌劑替代化學農藥進行作物土傳病害的防治，成為近年來國內外研究的熱點。芽孢桿菌是目前生防菌劑中應用最為廣泛的菌種之一，其適應環(huán)境能力強，可產生耐逆芽孢，分泌多種拮抗物質，對多種病原菌具有抑制作用，具有較高的開發(fā)應用價值[7-10]。

發(fā)酵工藝是將生防芽孢桿菌推向工業(yè)化生產的關鍵步驟，通過優(yōu)化能夠充分發(fā)掘菌種的潛在能力，提高生產效率，降低生產成本。Mizumoto等[11]通過對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)RB14-CS培養(yǎng)基優(yōu)化，發(fā)現葡萄糖和豆餅粉是影響其產伊枯草菌素A的主要因子。張冬冬等[12]采用Plackett-Burman試驗確定了巨大芽孢桿菌(Bacillusmalacitensis)Z-5生產芽孢最適碳源、氮源和無機鹽分別為玉米粉、MnSO4·H2O和豆餅粉，優(yōu)化后芽孢產量達到1.97×109mL-1；張文芝等[13]采用正交試驗法對蠟質芽孢桿菌(Bacilluscereus)AR156發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得出麥芽糖和黃豆粉能顯著提高芽孢產量，芽孢生成率在97%以上。張麗霞等[14]采用響應面分析法通過對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B908的培養(yǎng)基優(yōu)化，確定了玉米粉、碳酸鈣和豆餅粉是影響發(fā)酵液中菌體數量的主要因子。微生物的發(fā)酵過程十分復雜，以上研究均表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機鹽的組成及其濃度配比均對芽孢的形成、抑菌物質合成以及生產成本控制有重要影響，是菌劑商品化生產應用的基礎[15-17]。

枯草芽孢桿菌S12是微生物資源發(fā)掘及利用團隊分離自新疆棉田根際土壤的一株廣譜抑菌菌株，尤其對棉花黃萎病病菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長具有較強的抑制作用[18]，具備生防菌劑產業(yè)化開發(fā)的潛力。芽孢含量是影響生防菌劑貯藏運輸和應用效果的關鍵因素[19-21]，因而產芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化對菌株工業(yè)化和商品化生產有著重要意義。為了使芽孢產量達到最大化，本研究采用Plackett-Burman試驗設計、最陡爬坡試驗和BoxBehnken試驗設計對芽孢桿菌S12產芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基組分及其配比進行優(yōu)化，以期為該菌株的工業(yè)發(fā)酵生產和開發(fā)利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 生防菌株S12由本實驗室(作物種質創(chuàng)新與基因資源利用兵團重點實驗室)從新疆石河子市棉田根際土壤中分離，通過對該菌株的形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定和16S rDNA的序列分析，確定菌株S12為枯草芽孢桿菌，保存于本實驗室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 NA(nutrient agar)培養(yǎng)基：每1 000 mL 蒸餾水中含蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、pH 7.0～7.2，用于細菌菌株的活化。NB(nutrient broth)培養(yǎng)基：每1 000 mL蒸餾水中含蛋白胨10 g，牛肉浸膏3 g，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2，用于細菌生長曲線的測定。初始培養(yǎng)基：每1 000 mL蒸餾水中含葡萄糖 20 g、蛋白胨 10 g、Na2HPO4·2H2O 4 g、NaH2PO4·2H2O 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2·2H2O 0.2 g、pH 7.0～7.2，用于發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。上述培養(yǎng)基滅菌條件均為1×105Pa滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液制備 將保存的菌株S12接種于NA培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h進行活化。取100 mL三角瓶分裝NB培養(yǎng)基40 mL，接種NA培養(yǎng)基上活化的菌株S12后，于搖床30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)14 h作為種子液。

1.2.2 生長曲線測定 將菌株S12種子液以1%的接種量，接入40 mL NB培養(yǎng)基中(100 mL 三角瓶)，200 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 取發(fā)酵液測吸光值(OD600)，繪制生長曲線。

1.2.3 單因素試驗設計 選取6種碳源(葡萄糖、淀粉、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、玉米粉)、6種氮源(酵母粉、豆餅粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨)及6種無機鹽(MgSO4·7H2O、CaCl2、CaCO3、ZnCl2、K2HPO4、MnSO4·H2O)，在初始培養(yǎng)基的基礎上，分別以單因素變化以上的碳源、氮源或無機鹽的種類及濃度，配制各種發(fā)酵培養(yǎng)基。將培養(yǎng)14 h的種子液接入配制的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1%，100 mL的三角瓶裝液量為40 mL，200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)60 h。以發(fā)酵液菌株S12的芽孢產量為指標，依次確定合適的碳源、氮源和無機鹽，每次確定后的結果進入隨后的優(yōu)化條件試驗。

1.2.4 芽孢產量檢測 采用系列稀釋平板菌落計數，菌株S12培養(yǎng)后的發(fā)酵液經過80 ℃水浴15 min后，梯度稀釋到10-6～10-7，取0.1 mL發(fā)酵稀釋液均勻涂布到NA平板上，每處理重復3次，24 h后記錄菌落數。

1.2.5 培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗設計 在初始培養(yǎng)基的基礎上，采用Plackett-Burman試驗設計對單因素試驗確定的9種營養(yǎng)成分進行全面考察，并確定對菌株S12芽孢產量影響較大的因子，然后對這些因子進行最陡爬坡路徑試驗，采用適當的梯度改變較大影響因子在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度，考察菌株S12芽孢產量變化趨勢，確定最適濃度范圍，最后利用響應面分析法(Response surface methodology)中的Box-Behnken試驗設計，根據相應的試驗表進行試驗后，對數據進行二次回歸擬合得到二階響應面模型，預測發(fā)酵液中菌株S12芽孢產量最大值所對應的關鍵因子的最優(yōu)組合，并進行驗證。

1.2.6 統(tǒng)計分析 采用Design-Expert v8.0.6.1軟件進行Plackett-Burman試驗和Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗設計，運用該軟件的數據分析功能進行數據分析，得到擬合方程，進行試驗方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株S12生長曲線

菌株S12的生長曲線顯示(圖1)，0～4 h為生長延滯期，4～16 h為對數生長期，16 h后進入穩(wěn)定期，因此，通過該結果可以確定種齡14 h的培養(yǎng)液可作為種子液，此時菌體生長速率最快，又達到較高的菌體濃度，且細胞大小比較一致，生長活力強。

2.2 碳源對芽孢產量的影響

以蛋白胨1.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%為基礎培養(yǎng)基，分別加入1.0%、2.0%的6種不同碳源，進行發(fā)酵試驗，比較不同碳源種類和濃度對菌株S12發(fā)酵液中芽孢產量的影響。圖2表明，以2.0%玉米粉為碳源時，芽孢產量最高，達到4.1×108mL-1；其次為麥芽糖和葡萄糖，因此選擇玉米粉、麥芽糖和葡萄糖作為Plackett-Burman試驗碳源的考察因子。

圖1 菌株S12生長曲線Fig.1 Growth cure of strain S12

1.葡萄糖 Glucose；2.淀粉 Starch；3.麥芽糖 Maltose；4.蔗糖 Sucrose；5.甘露醇 Mannitol；6.玉米粉 Corn meal

2.3 氮源對芽孢產量的影響

以玉米粉2.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%為基礎培養(yǎng)基，分別加入1.0%、2.0%的6種不同氮源，進行發(fā)酵試驗，圖3表明，6種氮源對菌株S12芽孢產量的影響依次為：牛肉膏>大豆蛋白胨>豆餅粉>酵母粉>胰蛋白胨>硫酸銨；1.0%牛肉膏為氮源時芽孢產量最高，達到5.3×108mL-1，因此選擇牛肉膏、大豆蛋白胨、豆餅粉為Plackett-Burman試驗氮源的考察因子。

1.酵母粉 Yeast extract；2.豆餅粉 Bean cake powder；3.牛肉膏 Beef extract；4.大豆蛋白胨 Soybean tryptone；5.胰蛋白胨 Tryptone；6.硫酸銨 Ammonium sulfate

2.4 無機鹽對芽孢產量的影響

以玉米粉2.0%、牛肉膏1.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%作為基礎培養(yǎng)基，分別加入0.05%、0.1%的6種不同無機鹽，比較不同無機鹽種類和濃度對菌株S12發(fā)酵液中芽孢產量的影響，結果(圖4)表明：0.1% CaCO3對菌株S12發(fā)酵的促進作用最強，芽孢產量達到6.2×108mL-1；其次為K2HPO4、MnSO4·H2O。因此，以CaCO3、K2HPO4、MnSO4·H2O為Plackett-Burman試驗無機鹽成分的考察因子。

1.MgSO·7H2O; 2.CaCl2; 3.CaCO3; 4.ZnCl2; 5.K2HPO4; 6.MnSO4·H2O

2.5 Plackett-Burman試驗設計及結果

根據單因素試驗確定的9種營養(yǎng)成分作為影響因子進行考察，分別為玉米粉、麥芽糖、葡萄糖、豆餅粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、CaCO3、K2HPO4、MnSO4·H2O，選用9因子2水平試驗次數N=12的設計，表1和表2中A、B、C、D、E、F、G、J和K分別代表玉米粉、麥芽糖、葡萄糖、豆餅粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4、MnSO4·H2O、CaCO3，用H和L代表虛擬因子以考察試驗誤差，每個因子取低水平(-1)和高水平(+1)，2個水平見表1，通過不同的組合，檢測發(fā)酵液中芽孢產量，試驗設計方案及結果見表2。通過Design Expert v8.0.6.1軟件對芽孢產量測定結果進行統(tǒng)計分析，獲得多元一次回歸方程：Y1=331.00+103.67A-29.67B-16.33C-13.00D+161.00E-13.00F-19.67G-25.00J+47.00K，式中Y1為芽孢產量的預測值，A、B、C、D、E、F、G、J、K分別為玉米粉、麥芽糖、葡萄糖、豆餅粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4、MnSO4·H2O、CaCO3質量分數的編碼水平。

表1 Plackett-Burman試驗因素及水平設置Table 1 Factors and level design of Plackett-Burma test

表2 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of Plackett-Burma test

由芽孢產量影響因素主效應分析結果可知(表3)，回歸模型的值為0.007 8<0.05，說明該模型顯著，即該模型在被研究的整個回歸區(qū)域擬合很好。培養(yǎng)基中各因素對菌株S12芽孢產量的影響效應大小順序依次為：大豆蛋白胨>玉米粉>CaCO3>麥芽糖>MnSO4·H2O>K2HPO4>葡萄糖>豆餅粉、牛肉膏。其中大豆蛋白胨(P=0.001 4)、玉米粉(P=0.003 3)、CaCO3(P=0.016 0)是主要的影響因子。因此，本試驗結果確定大豆蛋白胨、玉米粉、CaCO3為影響S12菌株芽孢產量的主要因子。

2.6 最陡爬坡路徑試驗設計及結果

根據Plackett-burman試驗結果，對玉米粉、大豆蛋白胨和CaCO33個主要影響因子進行最陡爬坡路徑試驗，確定此3因子的最適質量分數范圍。隨玉米粉、大豆蛋白胨和CaCO3質量分數的增加，發(fā)酵液中芽孢產量的變化趨勢先上升后下降(表4)，玉米粉1.5%，大豆蛋白胨1.5%，CaCO30.08%時對應的芽孢產量達到最大值，為3因子的最大響應值區(qū)域。

表3 Plackett-burman試驗設計的方差分析Table 3 Variance analysis of Plackett-Burma test

表4 最陡爬坡路徑試驗設計及結果Table 4 Design and results of steepest climbing test

2.7 響應面分析的試驗設計及結果

3個重要因子的最適質量分數范圍確定后，以玉米粉為1.5%、大豆蛋白胨為1.5%、CaCO3為0.08%為中心點，進行3因素(玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO3)3水平(-1、0、1)的響應面分析試驗。芽孢產量的測定結果見表5。通過Design Expert軟件對優(yōu)化試驗數據進行二次多項式回歸擬合，獲得芽孢產量對玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO3質量分數的二次多項式回歸方程為：Y2=724.00+21.50A+46.50E+33.00K+80.00AE+35.00AK-17.00EK+43.00A2-187.00E2-32.00K2(Y2芽孢產量的預測值，A、E、K分別為玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO3質量分數)。

該二次多項模型及其各項的方差分析結果表明(表6)，該模型回歸P值<0.000 1，失擬項P值為0.554 2>0.05，說明回歸方程的顯著性和可靠性很高，因此該模型可以用于菌株S12芽孢產量發(fā)酵優(yōu)化的理論分析和預測。另外，二次響應面回歸模型的決定系數R2值為0.980 6，說明回歸方程的擬合程度較好，預測值和實測值之間具有高度的相關性，可以用于該菌株芽孢產量的理論預測。

本研究根據二次多項模型并利用Design Expert v8.0.6.1軟件繪制出響應面分析圖(圖5至圖7)，每個響應面分別代表2個獨立變量之間的相互作用，此時第3個變量保持在0水平。其中，圖5是CaCO3質量分數編碼值為0時，玉米粉和大豆蛋白胨質量分數對芽孢產量的交互影響；圖6是大豆蛋白胨質量分數編碼值為0時，玉米粉和CaCO3質量分數對芽孢產量的交互影響；圖7是玉米粉質量分數編碼值為0時，大豆蛋白胨和CaCO3質量分數對芽孢產量的交互影響。從圖5可以看出，在本試驗條件下，大豆蛋白胨質量分數的變化對芽孢產量變化的影響較大，其中在中質量分數時能獲得較高的芽孢產量。從圖6可以看出，玉米粉和CaCO3質量分數的變化對芽胞產量變化的影響較小。從圖7可以看出，大豆蛋白胨質量分數的變化對芽孢產量變化的影響較大，其中在中質量分數時能獲得較高的芽孢產量。因此，可以確定該菌株產芽孢培養(yǎng)基中大豆蛋白胨質量分數處于中間水平時能獲得較高的芽孢產量。

表5 Box-Behnken試驗設計及結果Table 5 Design and results of Box-Behnken test

表6 Box-Behnken試驗設計方差分析Table 6 Variance analysis of Box-Behnken experiment

圖5 玉米粉和大豆蛋白胨質量分數對芽孢產量交互影響的三維曲面圖(A)和相應等高線圖(B)Fig.5 Stereo images and contour of response surface of spore yield under interaction of maize flour and soybean tryptone

圖6 玉米粉和CaCO3質量分數對芽孢產量交互影響的三維曲面圖(A)和相應等高線圖(B)Fig.6 Stereo images and contour of response surface of spore yield under interaction of maize flour and CaCO3

圖7 大豆蛋白胨和CaCO3質量分數對芽孢產量交互影響的三維曲面圖(A)和相應等高線圖(B)Fig.7 Stereo images and contour of response surface of spore yield under interaction of soybean tryptone and CaCO3

2.8 最佳芽孢產量與驗證

為了得到菌株S12芽孢產量的最佳培養(yǎng)基組成，將所得回歸方程分別對各自變量取一階偏導等于零。得到如下方程式：

21.5+80E+35K+86A=0

46.5+80A-17K-374E=0

33+35A-17E-64K=0

求解方程組，可得模型極值坐標為：A=-0.394 1，E=0.026 7，K=0.293，相當于玉米粉質量分數為1.30%，大豆蛋白粉質量分數為1.51%，CaCO3質量分數為0.08%。按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分即玉米粉1.30%，大豆蛋白胨1.51%，CaCO3質量分數為0.08%，NaH2PO4·2H2O 0.2%、Na2HPO4·2H2O 0.4%，優(yōu)化后芽孢產量達到7.46×108mL-1，同初始培養(yǎng)基(1.53×108mL-1)相比提高了387.58%，并且與預測芽孢產量7.29×108mL-1接近，可見該模型能較好地預測芽孢的實際產量。

3 討 論

隨著綠色生態(tài)農業(yè)發(fā)展的需求以及“減肥減藥”的需要，生物制劑越來越受到人們青睞。其中生物農藥主要通過微生物發(fā)酵產業(yè)化生產獲得。微生物的發(fā)酵機理相對復雜，易受多種因素的影響，如菌種生物學特性、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等。因此，發(fā)酵工藝優(yōu)化對芽孢桿菌發(fā)酵水平的提高起著重要的促進作用，通過對發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化可以提高發(fā)酵液中菌體和芽孢的產量，并降低生產成本[22-23]。

芽孢是產芽孢類細菌在生長繁殖過程中產生的一種抗逆休眠體，并非細菌生活史中不可缺少的部分，它的形成受營養(yǎng)物質和環(huán)境因素的影響[22]。張冬冬等[12]對菌株BacillusmalacitensisZ-5進行了產芽孢培養(yǎng)基優(yōu)化，結果表明碳源對菌株的芽孢產量影響最大，其次是無機鹽，氮源影響最小，發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后配方(質量分數)為：玉米粉1.66%，豆餅粉1.30%，MnSO4·H2O 0.07%，優(yōu)化后芽孢產量達到1.97×109mL-1；王倩等[24]在搖瓶發(fā)酵基礎上對Bacillusmegaterium1-12芽孢形成的主要影響因素進行了考察，并采用單因素和正交試驗確定了最佳產孢的培養(yǎng)基組成：玉米粉1%，大豆蛋白胨1%，CaCl2·2H2O 0.1%，MnSO4·H2O 0.05%。以上研究均表明，培養(yǎng)基成分及其配比是影響芽孢形成和產量的重要因素。

自然情況下，菌體遇到不利因素時才產生芽孢。當營養(yǎng)匱乏時，雖然芽孢形成率高，但芽孢總數過低；當營養(yǎng)豐富時，菌體生長繁殖快但芽孢形成率低，所以進行產芽孢培養(yǎng)基組成研究非常必要。因此，本研究通過搖瓶發(fā)酵試驗采用Plackett-Burman試驗設計和響應面法中的Box-Behnken試驗設計對枯草芽孢桿菌S12的產芽孢培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，通過優(yōu)化確定玉米粉、大豆蛋白胨和CaCO3為主效應因子并得出三者的組成配比分別為：1.30%、1.51%和0.08%。通過模型預測的芽孢產量為7.29×108mL-1，經驗證結果為7.46×108mL-1，表明模型預測與試驗驗證結果基本一致，用該模型可以合理、有效地預測菌株S12的芽孢產量。碳源、氮源和無機鹽均是芽孢桿菌生長和芽孢形成所必須的營養(yǎng)物質。本研究結果表明，當玉米粉作為碳源時，能促進菌株S12芽孢的形成，而且廉價易得，這與王倩等[24]的研究結果一致；而當大豆蛋白胨作為氮源時，菌株S12發(fā)酵液中芽孢產量最大，這不同于張冬冬等[12]的豆餅粉作為氮源時芽孢產量最大的結果，可能是由于芽孢桿菌菌株的不同，或是菌株的生長環(huán)境不同等原因造成的。姚露燕等[25]、張冬冬等[12]和段玲玲等[26]的研究表明，Mn2+既可以促進芽孢桿菌菌體生長，也可以促進芽孢形成，而K+和Ca2+在提高芽孢形成率方面發(fā)揮著重要作用。本研究結果也表明，金屬離子Ca2+、K+和Mn2+均能促進芽孢的產生并提高了芽孢產量，可能是這3種金屬離子參與了碳水化合物的代謝以及芽孢形成相關酶作用的發(fā)揮[27]。

本試驗僅對菌株S12產芽孢發(fā)酵所需要的培養(yǎng)基成分及其配比進行了室內搖瓶發(fā)酵的初步研究，在提高芽孢產率的同時，降低了生防菌劑原藥的生產成本。后期還需進一步對其發(fā)酵條件包括培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等因素進行優(yōu)化，并通過罐上發(fā)酵確定相應的發(fā)酵參數。