利用分子跟蹤檢測和滾動回交創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因矮敗小麥抗旱新種質(zhì)

王文靜，張增民，張萌琪，閔東紅(.陜西省農(nóng)業(yè)機械鑒定推廣總站，西安 70068；.陜西省富平縣種子技術推廣中心，陜西富平 7700；

3.長春師范大學 生命科學學院，長春 130032；4.西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院，陜西楊凌 712100)

小麥是世界重要的糧食作物，是中國城鄉(xiāng)居民的主要口糧作物。目前，中國有60%以上的小麥主要分布在干旱與半干旱地區(qū)，隨著全球氣候變暖與生態(tài)環(huán)境的惡化，中國旱地面積和干旱程度不斷擴大和加劇，對中國小麥的生產(chǎn)將產(chǎn)生更加嚴峻的考驗。因此，通過遺傳改良提高小麥對干旱、鹽堿等環(huán)境脅迫的耐受性顯得更加迫切[1-3]。由于常規(guī)育種技術與方法的局限性，通過常規(guī)育種途徑創(chuàng)制抗旱種質(zhì)難以在短期內(nèi)滿足作物遺傳改良對抗旱種質(zhì)的需求，因此，挖掘抗逆基因，通過基因工程途徑，結(jié)合有限回交、滾動回交等常規(guī)育種技術手段創(chuàng)制小麥抗旱新種質(zhì)對改良品種抗旱性具有重要作用[4-8]。近年來，中國相繼在水稻和小麥等作物上利用遺傳轉(zhuǎn)化獲得的具外源基因的轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)合常規(guī)回交轉(zhuǎn)育和輪回選擇創(chuàng)制了一批抗蟲抗旱的轉(zhuǎn)基因材料[9-11]。

矮敗小麥的成功創(chuàng)制為開展小麥的輪回選擇育種和相關遺傳研究提供了重要的遺傳工具[12-17],利用矮敗小麥育種技術可以大幅度地提高雜交效率，快速培育具有目標性狀的導入系，利用分子標記輔助手段構(gòu)建輪回選擇群體，實現(xiàn)多個目標基因在優(yōu)良遺傳背景下的聚合，加快作物重要性狀的改良速度，縮短轉(zhuǎn)基因回交品系的選育時間，起到事半功倍的效果[5,15，18]。近年來利用矮敗小麥遺傳改良工具開展轉(zhuǎn)基因材料的輪回選擇育種研究，已取得了卓有成效的進展[19]。本研究以農(nóng)藝性狀全面、具備矮敗小麥特征的‘矮敗周麥18’小麥為受體，以T4代轉(zhuǎn)抗旱相關轉(zhuǎn)錄因子基因的小麥株系為供體，采用雜交、回交與滾動回交方法，開展抗旱轉(zhuǎn)基因矮敗小麥種質(zhì)創(chuàng)制，以期為抗旱轉(zhuǎn)基因矮敗小麥輪回選擇群體構(gòu)建和相關轉(zhuǎn)基因育種技術與方法研究奠定一定的材料與方法基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供體材料 T4代轉(zhuǎn)基因小麥株系‘G新春9號’(TaEBP)、‘G魯麥23-69’(GhDREB)、‘G魯麥14-299’( GmDREB1)、‘G石4185’( GmDREB3)，基因的功能驗證及轉(zhuǎn)基因植株抗逆性鑒定結(jié)果表明，這些基因的超表達能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植物、特別是轉(zhuǎn)基因小麥的非生物脅迫抗性[16-21]，是小麥抗逆遺傳育種和抗逆種質(zhì)創(chuàng)新的重要基因資源，轉(zhuǎn)基因供體材料均由中國農(nóng)科院作物科學研究所馬有志課題組提供。

1.1.2 受體材料 ‘矮敗周麥18’由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所矮敗小麥育種課題組周楊研究員饋贈，該材料是通過‘周麥18’與矮敗小麥創(chuàng)制的回交導入系，具有良好的農(nóng)藝性狀和黃淮麥區(qū)的適應性等特點。

1.2 方 法

1.2.1 外源基因的回交聚合 分別選取轉(zhuǎn)基因株系‘G新春9號’‘G魯麥23-69’‘G魯麥14-299’和‘G石4185’單株的種子各100粒，選取‘矮敗周麥18’種子300粒，于10月上旬正常播種于西北農(nóng)林科技大學小麥抗逆轉(zhuǎn)基因隔離試驗區(qū)，至當年11月下旬，對供體材料進行陽性植株分子檢測并標記，于當年12月下旬待完成春化作用后，選取各轉(zhuǎn)基因株系的陽性植株和受體材料移栽至轉(zhuǎn)基因?qū)Ｓ脺厥遗囵B(yǎng)。

雜交:待發(fā)育至抽穗末期，選取矮敗不育穗套袋，到開花期，用供體材料授粉雜交。分別收獲雜交F1代種子和供體轉(zhuǎn)基因小麥種子，破除休眠、發(fā)芽，進行綠體春化。

連續(xù)回交:綠體春化完成后，移入溫室加代培養(yǎng)。開花前選擇陽性矮敗株套袋、選擇陽性供體株花粉(均預先進行陽性植株的PCR跟蹤檢測)進行第一輪回交(BC1)，第二輪回交(BC2)依照同樣方法進行。

滾動回交:選取每一供體與矮敗小麥連續(xù)回交的BC2F1種子若干，破除休眠、發(fā)芽、春化處理后繼續(xù)溫室加代培養(yǎng)，供體材料以同樣方法處理。在苗期對矮敗小麥和供體植株分別進行外源基因檢測。待生長發(fā)育進入孕穗期后，選取檢測陽性矮敗植株套袋，在開花期，選用陽性供體植株花粉分別給攜帶不同外源基因的矮敗小麥授粉雜交，收獲雜交種，春化處理后種植；在苗期對矮敗小麥和供體植株分別進行外源基因檢測，待生長發(fā)育進入孕穗期后，選取檢測陽性矮敗植株套袋，開花期選用攜帶相同外源基因的陽性供體植株花粉分別給上代雜交的相應F1穗授粉，開始滾動回交，以聚合不同的目的基因(GBC1)，連續(xù)回交2代后(GBC2)，將所有回交種子混合種植于大田，形成矮敗小麥的小群體，使矮敗小麥混合群體內(nèi)每一個體實現(xiàn)自交的同時，在群體內(nèi)群體之間實現(xiàn)充分互交，收獲矮敗不育株雜交穗上的種子進入下一輪種植。4個抗旱相關轉(zhuǎn)錄因子基因的回交、聚合過程如圖1所示。

圖1 抗旱轉(zhuǎn)基因矮敗小麥種質(zhì)創(chuàng)制路線圖Fig.1 Germplasm creating flow of drought-resistant transgentic dwarf male-sterile wheat

1.2.2 雜交后代外源基因的跟蹤檢測 為了確保回交轉(zhuǎn)育的準確、可靠性，在最初的雜交和以后的每一輪回交之前，對各分離后代和供體植株的外源基因進行PCR檢測，并標記，以篩選陽性植株為供體授粉。具體做法如下：

DNA提取:基因組DNA采用CTAB法提取[20]，以15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并檢測其濃度。

PCR檢測:以后代植株基因組DNA為模板進行目的基因分子檢測。GhDREB、 GmDREB1、 GmDREB3、TaEBP檢測的引物序列分別為：GhDREB：5′-AGGAAGTGGGGAAAGTGGGT-3′(F)和5′-AGTGAGGTCTGTAAAGCGTCG-3′(R)，擴增片段為257 bp； GmDREB1：5′-CG GGTAGAAGAAGTCCAACATCG-3′(F)和5′-AGTCGGGCTTGAGATTGAGAGAG-3′(R)，擴增片段為423 bp； GmDREB3：5′-ATTGAACTGGGGAAAGGGTTAGT-3′(F)和5′-TGAATCGGTGAGGTGTTGCGTCG-3′(R)，擴增片段為441 bp；TaEBP采用bar基因引物檢測：5′-AGGTTCGGCCGATAGTTAGGT-3′(F)和5′-GGCTGAATGGTCTGACGTTGCG-3′(R)，擴增片段為435 bp。擴增產(chǎn)物用8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因供體植株的分子檢測

在溫室內(nèi)，待供體植株生長發(fā)育進入分蘗盛期，每個轉(zhuǎn)基因株系，各選取25株標記、編號，取其葉片，提取基因組DNA，利用PCR擴增方法，篩選陽性植株(圖2-A、B、C、D)。

A. 轉(zhuǎn)GhDREB基因株系‘G魯麥23-69’陽性植株分子檢測 PCR analysis for GhDREB gene of ‘G-Lumai 23-69’ plants；B. 轉(zhuǎn) GmDREB1基因株系‘G魯麥14-299’陽性植株分子檢測 PCR analysis for GmDREB1 gene of ‘G-Lumai 14-299’ plants；C. 轉(zhuǎn) GmDREB3基因株系‘G石4185’陽性植株分子檢測 PCR analysis for GmDREB3 gene of ‘G-Shi 4185’ plants；D. 轉(zhuǎn)TaEBP基因株系‘G新春9號’陽性植株的分子檢測 PCR analysis for TaEBP gene of ‘G-Xinchun 9’ plants；M. D2000 marker；CK+. 陽性質(zhì)粒 Positive plasmid；CK-. 陰性對照 Negative control；1-15. 轉(zhuǎn)基因株系 Transgenic lines

供體植株外源基因分子檢測結(jié)果說明，轉(zhuǎn)基因供體親本已經(jīng)接近純和，這對保證回交轉(zhuǎn)育的準確可靠性具有關鍵作用。

2.2 雜交和有限回交(BC1F1～BC2F1)

待供體和受體材料生長發(fā)育至抽穗期，選取矮敗小麥群體‘矮敗周麥18’發(fā)育健壯的不育株套袋，編號。進入開花期，選擇足購數(shù)量已檢測的轉(zhuǎn)基因陽性供體植株給矮敗不育穗人工飽和授粉雜交。成熟期，采收母本不育株上雜交種(F1代種子)，以備下一輪回交使用。將上輪收獲的雜交種子、供體材料種子破除休眠、春化后，于溫室條件培養(yǎng)至抽穗期，分別在雜交F1矮敗群體中選取不育株掛牌、編號，待進入盛花期，繼續(xù)回交、收獲。BC2依照同樣方法。

在完成供體親本和受體親本雜交的基礎后，對回交F1分離群體選株，同樣用前述4對引物分別檢測相應的F1植株，并掛牌標記。至植株進入開花前期，將檢測的矮敗陽性不育穗套袋，用相應的轉(zhuǎn)基因供體親本給其人工定向、飽和授粉，完成第一輪回交。圖3是BC1F1部分矮敗植株PCR檢測結(jié)果。

A. BC1F1群體矮敗小麥不育株目的基因GhDREB的分子檢測 PCR detection for GhDREB gene of BC1F1 dwarfing-sterile wheat；B. BC1F1群體矮敗小麥不育株目的基因TaEBP的分子檢測 PCR detection for TaEBP gene of BC1F1 dwarfing-sterile wheat；C. BC1F1群體矮敗小麥不育株目的基因 GmDREB3 的分子檢測 PCR detection for GmhDREB3 gene of BC1F1 dwarfing-sterile wheat；CK+. 陽性質(zhì)粒 Positive plasmid；CK-/CK-1. 陰性對照 Negative control；CK-2.H2O;M.D2000 marker；1-12. BC1F1群體矮敗不育植株 Dwarfing-steile plant of BC1F1 populations

由圖3的檢測結(jié)果可知，經(jīng)過一次雜交和一輪回交，外源基因均不同程度的轉(zhuǎn)育到矮敗小麥遺傳背景，這為下一輪回交奠定了材料基礎。

成熟后，收獲BC1F1矮敗小麥不育穗上的雜種種子，將其與相應的轉(zhuǎn)基因供體親本一起破除休眠、春化。通過春化階段后，所有苗期材料移入溫室，培養(yǎng)加代，以備下一輪回交(BC2)，方法與上一輪回交(BC1)相同。

2.3 滾動回交(GBC1F1～GBC2F1)

將上輪不育株回交的BC2F1種子和互交的BC1F1種子，進行破除休眠、春化處理后種植于溫室。待矮敗植株生長發(fā)育進入抽穗期后，在雜交BC2F1矮敗群體中，隨機選取發(fā)育健壯的矮桿不育植株套袋、掛牌、編號，葉片取樣，檢測。轉(zhuǎn)基因供體植株也做一定數(shù)量的PCR檢測，待矮敗小麥生長發(fā)育進入開花期后，依照父母本各自攜帶外源基因的類型，開展不同外源基因植株間的交叉授粉(滾動雜交)，成熟后收獲種子，以備下一輪回交之用。

第一輪滾動回交(GBC1) :收獲滾動雜交F1種子，將其與轉(zhuǎn)基因供體親本種子采用前述方法處理后移入加代溫室。在進入拔節(jié)期后，選取矮敗不育株、供體轉(zhuǎn)基因植株，對其攜帶目的基因進行PCR檢測，并對陽性植株掛牌標記，待生長發(fā)育進入開花期時，依照親本雙方攜方帶基因類型，進行相應的第一輪滾動回交。由圖4可知，經(jīng)過一次雜交和滾動回交后，GBC1F1植株中檢測到了 GmDREB3、TaEBP和GhDREB外源基因的回交導入。

A. 滾動回交GBC1F1矮敗小麥目的基因 GmDREB3分子檢測 PCR detection for GmDREB3 gene of GBC1F1 dwarfing-sterile wheat；B. 滾動回交GBC1F1矮敗小麥目的基因TaEBP分子檢測 PCR detection for TaEBP gene of GBC1F1 dwarfing-sterile wheat；M. D2000 marker；CK-. 陰性對照 Negative control；CK+.陽性對照 Positive plasmid；1-10. GBC1F1群體陽性不育 Positive dwarfing-sterile plant of BC1F1Populations

第二輪滾動回交(GBC2) :第一輪滾動回交結(jié)束后，收獲第一輪回交種子和相應供體陽性植株種子，種子處理與第一輪滾動回交相同。將處理好的種子幼苗移入溫室培養(yǎng)至拔節(jié)期，采用與第一輪回交相同的方法完成第二輪滾動回交(GBC2)。

群體內(nèi)交配:第二輪滾動回交結(jié)束后，收獲滾動回交不育株上F1種子，將F1種子全部混合，在隔離條件下種植于大田，讓矮敗小麥群體內(nèi)個體間充分異交、自交，即可育株與不育株之間充分互交的同時，可育株自交。成熟后，按照不育株農(nóng)藝性狀的優(yōu)劣，混收不育株種子,同時嚴格選收農(nóng)藝性狀優(yōu)良的可育株種子。

2.4 轉(zhuǎn)基因矮敗小麥外源基因聚合的分子鑒定

選用連續(xù)滾動回交兩代、群體內(nèi)交配后收獲的不育株回交種子2～3粒，發(fā)芽，水培至3葉期時剪取葉片，提取基因組DNA，以采用多重引物PCR對其進行外源基因聚合情況的PCR分子檢測,以確定外源基因的導入與否，以及導入外源基因的種類。

外源基因檢測結(jié)果表明，經(jīng)過兩輪的有限回交和兩輪的滾動回交，轉(zhuǎn)基因供體材料的目的基因已經(jīng)不同程度的回交轉(zhuǎn)育于矮敗小麥(圖5)。具體而言，分別已有TaEBP+GhDREB、 GmDREB3+ GmDREB1、 GmDREB3+GhDREB、 GmDREB3+TaEBP2個不同外源基因聚合于同一植株(分別見圖5中第1、2、3、5泳道)， GmDREB3+TaEBP+GhDREB3個不同的外源基因聚合在同一矮敗小麥植株(圖5中第4、6泳道)。

綜上，經(jīng)過抗旱轉(zhuǎn)基因株系與矮敗小麥的兩輪有限回交和兩輪滾動回交，所獲植株既具備矮敗小麥的特征，又聚集了同時攜帶多個供體的抗旱相關基因，從而使得矮敗不育植株具備了轉(zhuǎn)基因抗旱與矮敗小麥的雙重特質(zhì)，為進一步開展轉(zhuǎn)基因抗旱小麥輪回選擇育種及種質(zhì)創(chuàng)新奠定了良好基礎。

M. DNA MarkerⅠ；1：GBC2F1植株中擴增的TaEBP基因片段435 bp和GhDREB基因片段257 bp Fragment of TaEBP and GhDREB gene by PCR on GBC2F1 plant；2. GBC2F1植株中擴增的 GmDREB3基因片段441 bp和 GmDREB1基因片段423 bp Fragment of GmDREB3 and GmDREB1 gene by PCR on GBC2F1 plant；3. GBC2F1植株中擴增的 GmDREB3基因片段441 bp和GhDREB基因片段257 bp Fragment of GmDREB3 and GhDREB gene by PCR on GBC2F1 plant；4，6. GBC2F1植株中擴增的 GmDREB3基因片段441 bp、TaEBP基因片段435 bp和GhDREB基因片段257 bp Fragment of GmDREB3、TaEBP and GhDREB gene by PCR on GBC2F1 plant；5. GBC2F1植株中擴增的 GmDREB3基因片段441 bp和TaEBP基因片段435 bp Fragment of GmDREB3 and TaEBP gene by PCR on GBC2F1 plant

3 討 論

矮敗小麥是具有顯性矮核不育基因(Ms2)與顯性矮桿基因(Rht10)緊密連鎖的具有表型遺傳標記的特異種質(zhì)，是開展小麥輪回選擇育種和相關研究的重要遺傳工具和遺傳資源[12-19]。TaEBP、 GmDREB1、 GmDREB3、GhDREB屬轉(zhuǎn)錄因子基因，可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控下游若干抗逆(抗旱)基因的表達，其超量表達能明顯提高小麥對干旱等非生物脅迫的耐受性[21-26]。

本研究以‘矮敗周麥18’為遺傳改良工具，以‘G新春9號’‘G魯麥14-299’‘G魯麥23-69’‘G石4185’等分別攜帶前述4個抗旱相關轉(zhuǎn)錄因子基因的小麥株系為供體，通過有限回交、滾動回交，結(jié)合雜種后代PCR跟蹤檢測，創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因矮敗小麥新種質(zhì)，分子檢測結(jié)果表明，初步獲得了同時攜帶 GmDREB3、TaEBP、GhDREB基因于一體的矮敗小麥，為進一步利用其開展轉(zhuǎn)基因小麥的輪回選擇育種，研究雙價、多價抗旱相關轉(zhuǎn)基因植株的抗旱效果和抗旱機理，以及其它相關研究提供了重要的材料支撐。

在材料創(chuàng)制方法上，雖然采用傳統(tǒng)的回交轉(zhuǎn)育方法，但結(jié)合了外源基因的PCR分子擴增的回交后代跟蹤檢測手段，加之溫室加代技術的運用，保證種質(zhì)材料創(chuàng)新過程中外源基因?qū)氲臏蚀_性、定向性和快速性等特點。

雖然已有數(shù)個抗旱相關基因?qū)氚珨⌒←?，從理論上講，這些材料的抗旱性能應該有較大幅度的改良，但由于基因之間、基因與環(huán)境間互作等諸多因素的影響，創(chuàng)制新種質(zhì)材料的抗旱性能，如抗旱相關的農(nóng)藝性狀指標、生理生化指標等抗旱機制還有待于進一步鑒定。