結(jié)直腸癌組織中HIF—1α與miR—138的表達(dá)變化及其與患者預(yù)后的相關(guān)性探討

李日增 夏建福 蔣義 鄭昭科

[摘要] 目的 探討結(jié)直腸癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1a（HIF-1a）與microRNA-138（miR138）的表達(dá)變化及與其患者預(yù)后的相關(guān)性。 方法 選擇2016年1月～2017年8月科室收治的結(jié)直腸患者70例，設(shè)為觀察組，患者行手術(shù)治療，術(shù)中取結(jié)直腸癌病灶組織；以癌旁組織設(shè)為對照組。采用免疫組織化學(xué)法完成兩組HIF-1α與miR138蛋白表達(dá)測定，記錄結(jié)直腸癌組織患者病理資料，包括：年齡、腫瘤直徑、腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)情況，對上述病理資料進行單因素分析；采用COX回歸模型分析結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138與患者預(yù)后的相關(guān)性。 結(jié)果 觀察組結(jié)腸癌組織中HIF-1α與miR138陽性率，均高于對照組（P<0.05）；單因素及COX回歸模型分析結(jié)果表明：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽性率與性別、年齡無相關(guān)性（P>0.05）；結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽性率與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤呈正相關(guān)性（P<0.05）。 結(jié)論 結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138均呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者預(yù)后具有一定的相關(guān)性，加強患者HIF-1α與miR138水平測定能評估患者預(yù)后，值得推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌組織；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；microRNA-138；表達(dá)變化；COX回歸模型

[中圖分類號] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）21-0021-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α） and microRNA-138 （miR138） in colorectal cancer and its correlation with prognosis. Methods A total of 70 colorectal patients were selected from January 2016 to August 2017 as the observation group. The patients were treated with surgery and the colorectal cancer tissue was taken during the operation. The adjacent tissue was used as a control group. The expression of HIF-1α and miR138 protein in the two groups was determined by immunohistochemical method. The pathological data of colorectal cancer tissues were recorded including age， tumor diameter， tumor stage， differentiation， lymph node metastasis and postoperative recurrence. Data were analyzed by univariate analysis； COX regression models were used to analyze the association between HIF-1α and miR138 in patients with colorectal cancer and their prognosis. Results The positive rates of HIF-1α and miR138 in the observation group were higher than those in the control group（P<0.05）. The results of univariate and COX regression analysis showed that there was no correlation between the positive rates of HIF-1α and miR138 in colorectal cancer tissues and gender， age（P>0.05）. The positive rates of HIF-1α and miR138 in colorectal cancer tissues were positively correlated with tumor size， tumor stage， lymph node metastasis， differentiation and infiltration（P<0.05）. Conclusion The expressions of HIF-1α and miR138 in colorectal cancer tissue are high. The expression level of HIF-1α and miR138 is correlated with the prognosis of patients. Strengthening the measurement of HIF-1α and miR138 levels can evaluate the prognosis of patients and is worthy of popularization and application.

[Key words] Colorectal cancer tissue； Hypoxia-inducible factor-1α； MicroRNA-138； Expression changes； COX regression model

大腸癌屬于臨床上發(fā)生率較高的惡性腫瘤，包括結(jié)腸癌與直腸癌。文獻(xiàn)報道顯示[1]：大腸癌發(fā)病率由低到高依次為直腸、乙狀結(jié)腸、升結(jié)腸及降結(jié)腸，其發(fā)病機制復(fù)雜，多與生活方式、遺傳及大腸腺瘤有關(guān)，且疾病發(fā)生率呈年輕化趨勢，影響我國居民健康及生活。目前，臨床上對于結(jié)直腸癌以手術(shù)治療為主，通過手術(shù)能切除病灶組織，延長患者壽命，但是多數(shù)患者術(shù)后5年生存率僅50.0%[2]。因此，加強結(jié)直腸癌患者早期診斷、治療對改善患者預(yù)后具有重要的意義。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，能促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，能在多種機制下促進腫瘤糖酵解[3]。microRNA屬于是一種單鏈非編碼小片段RNA調(diào)控分子，能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長發(fā)育、分化及凋亡[4]。microRNA-138是microRNA的一種，在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。因此，加強HIF-1α與miR138水平測定及研究與患者預(yù)后的相關(guān)性能為患者治療提供依據(jù)和參考。本課題以2016年1月～2017年8月科室收治的結(jié)直腸患者70例，探討結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138的表達(dá)變化及與其患者預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月～2017年8月科室收治的結(jié)直腸患者70例，設(shè)為觀察組，男42例，女28例，年齡36～75歲，平均（57.58±5.61）歲。腫瘤分期：Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期31例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；是否浸潤：發(fā)生浸潤21例，未發(fā)生浸潤49例。分化程度：低分化23例，中分化21例，高分化26例。預(yù)后：預(yù)后良好52例，預(yù)后差18例。以癌旁組織設(shè)為對照組。本課題得到醫(yī)院倫理委員會同意，患者對檢測方案簽署同意書。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合結(jié)直腸癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，患者均經(jīng)手術(shù)病理檢查最終確診；（2）能耐受手術(shù)治療，能遵循醫(yī)囑完成相關(guān)檢查、治療者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重心、肝、腎功能異常及伴有明顯精神異常者；（2）合并多種惡性腫瘤者；（3）合并糖尿病、高血壓、慢性阻塞性肺疾病等慢性疾病者[6]。

1.3 主要儀器和試劑

本課題所需的儀器與試劑包括：包埋機（型號EG1150H）、脫水劑（型號ASP300S）、鼠抗人HIF-1α單克隆抗體（NBP1-30333）、鼠抗人miR138單克隆抗體、EDTA（ZLI9069）、免疫組化試劑盒（SP9001），其廠家見表1。

1.4 方法

（1）檢測方法。采用免疫組織化學(xué)法完成兩組HIF-1α與miR138蛋白表達(dá)測定：①標(biāo)本采集。圍術(shù)期取病灶部位組織，采用免疫組織化學(xué)法測定兩組HIF-1α與miR138蛋白表達(dá)。②檢測方法。向制備的切片組織中放入1份30.0%H2O2及10份蒸餾水，加入內(nèi)源性酶常溫下10 min滅火，采用蒸餾水連續(xù)3次洗滌。將切片放置在0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0，利用電爐加熱，煮沸后間隔5 min，連續(xù)反復(fù)2次，常溫下冷卻后加入PBS進行2次洗滌，常溫下加入濃度5%BSA封閉液，甩去多余液體后加入一滴HIF-1α與miR138蛋白（稀釋濃度為1：100）單克隆抗體，采用PBS3次洗滌，每次2 min。采用DBA顯色試劑盒中在1 mL底物中加入1滴HIF-1α與miR138蛋白二抗，混合均勻后制備DBA工作液，常溫下顯色，完畢后利用蘇木素復(fù)染、脫水、透明后封片，倒置顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞時數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量的比例，每個標(biāo)本測定3次，取平均值[7]。③判定方法。以細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F裝視為陽性。參考奧爾雷德評分標(biāo)準(zhǔn)從細(xì)胞陽性數(shù)（1～4分）及染色強度（0～12分）進行判斷，得分越高，陽性率越高。評定時每個標(biāo)本連續(xù)測定3次，在200倍光鏡下取5個視野，取平均值[8]。（2）病理資料的統(tǒng)計。采用免疫組織化學(xué)法完成兩組HIF-1α與miR138蛋白表達(dá)測定，記錄結(jié)直腸癌組織患者病理資料，包括：年齡、腫瘤直徑、腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)情況，對上述病理資料進行單因素分析[9]；參考WHO實體瘤標(biāo)準(zhǔn)對患者手術(shù)后治療效果從CR（完全緩解）、PR（部分緩解）、PD（疾病進展）、SD（疾病穩(wěn)定）角度進行評估，將CR+PR視為預(yù)后良好；PD+SD視為預(yù)后差。（3）相關(guān)性。采用COX回歸模型分析結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件處理，計數(shù)資料行χ2檢驗，采用[n（%）]表示，計量資料行t檢驗，采用（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HIF-1α與miR138陽性率比較

觀察組結(jié)腸癌組織中HIF-1α與miR138陽性率，均高于對照組（P<0.05）。見表2、封三圖1。

2.2 結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽性率表達(dá)單因素分析

單因素結(jié)果表明：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽性率與性別、年齡無相關(guān)性（P>0.05）；結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽性率與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤呈正相關(guān)性（P<0.05）。見表3。

2.3 結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138與預(yù)后的相關(guān)性研究

COX回歸模型分析結(jié)果表明：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽性率與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤呈正相關(guān)性（P<0.05）。見表4。

3 討論

結(jié)直腸癌均為臨床上常見的惡性腫瘤，且發(fā)生率呈上升、年齡化趨勢，嚴(yán)重影響我國居民健康[10]。由于結(jié)直腸癌發(fā)病早期臨床癥狀缺乏特異性，多數(shù)患者一旦確診，已經(jīng)是中、晚期，喪失了最佳治療時機。因此，加強患者早期診斷、治療對改善患者預(yù)后具有重要的意義[11]。

HIF-1具有HIF-1α、HIF-1β兩種亞型，而HIF-1α是腫瘤細(xì)胞缺氧狀態(tài)下適應(yīng)的中心調(diào)節(jié)因子，多與腫瘤細(xì)胞血管的形成、增殖及轉(zhuǎn)移有關(guān)。對于正常人而言，HIF-1α主要以解離狀態(tài)存在，導(dǎo)致其暫時喪失活性。但是，當(dāng)機體組織細(xì)胞處于低氧狀態(tài)時HIF-1α將會與HIF-1β相互結(jié)合，導(dǎo)致其表達(dá)水平迅速升高，有助于促進新生血管的形成，加快腫瘤的轉(zhuǎn)移[12-13]。本研究中，觀察組結(jié)腸癌組織中HIF-1α與miR138陽性率，均高于對照組（P<0.05）。提示：HIF-1α在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，能直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究表明：無限增殖是腫瘤細(xì)胞最重要的特征，不斷快速增殖能引起腫瘤細(xì)胞氧耗增加，而當(dāng)腫瘤細(xì)胞所需的氧超過組織供給時將會發(fā)生缺氧。此外，HIF-1α能通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，削弱患者治療效果。miR138參與抑郁等精神活動有關(guān)，能抑制機體免疫反應(yīng)及新生血管的形成。文獻(xiàn)報道顯示[13]：miR138能參與新生血管的形成，能抑制血管內(nèi)皮因子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移。同時，miR138能參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且在腫瘤干細(xì)胞中miR138多呈高表達(dá)，會引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換，能提高腫瘤標(biāo)志物水平[14]。本研究中，單因素及COX回歸模型分析結(jié)果表明：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138陽性率與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤呈正相關(guān)性（P<0.05）。提示：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138均呈高表達(dá)，并且表達(dá)水平受到的影響因素有關(guān)。為了提高患者治療效果，改善患者預(yù)后，患者手術(shù)治療過程中可加強HIF-1α與miR138水平監(jiān)測，動態(tài)了解及評估患者疾病嚴(yán)重程度，善于根據(jù)監(jiān)測結(jié)果調(diào)整治療方案，使得患者的治療更具科學(xué)性、合理性[15]。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中HIF-1α與miR138均呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者預(yù)后具有一定的相關(guān)性，加強患者HIF-1α與miR138水平測定能評估患者預(yù)后，值得推廣應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 葛麗衛(wèi)，謝偉峰，顧金華，等.結(jié)直腸癌患者組織中HIF-1α和GLS2表達(dá)水平與病理程度和預(yù)后的相關(guān)性[J].中華普外科手術(shù)學(xué)雜志：電子版，2017，11（3）：265-268.

[2] 李妮，謝贛豐，李文花，等.缺氧誘導(dǎo)因子1α和2型谷氨酰胺酶在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2016，38（5）：496-500.

[3] Tuomisto A，García-Solano J，Sirni？觟 P，et al. HIF-1α expression and high microvessel density are characteristic features in serrated colorectal cancer[J].Virchows Archiv，2016，469（4）：1-10.

[4] 宋軍民，楊超，李震，等.微小RNA-155和WEE1在結(jié)腸癌中的作用及其表達(dá)的相關(guān)性[J].中華實驗外科雜志，2015，32（2）：397-399.

[5] 郭靖，尚楊楊，汪榮泉.結(jié)直腸癌及缺氧的結(jié)直腸癌細(xì)胞中HIF-1α與miRNA-200b表達(dá)的相關(guān)性[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2016，38（6）：545-549.

[6] 王茜，時延龍，畢經(jīng)旺.p-mTOR與HIF-1α在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國腫瘤生物治療雜志，2015，22（6）：779-784.

[7] Shang Y，Chen H，Ye J，et al. HIF-1/Ascl2/miR-200b regulatory feedback circuit modulated the epithelial-mesenchymal transition （EMT） in colorectal cancer cells[J]. Experimental Cell Research，2017，360（2）：243.

[8] 趙繼明，彭健.MicroRNA-132在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2016，26（5）：48-52.

[9] 張麗靜，王園園，朱娜娜，等.結(jié)直腸癌中miR-139-5p與TGIF1的表達(dá)及相關(guān)性的研究[J].腫瘤，2015，35（10）：1127-1134.

[10] 楊通印，郝朗松，郭德正.缺氧誘導(dǎo)因子1α、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1和乳酸脫氫酶5在結(jié)直腸癌的表達(dá)及其意義[J].中華病理學(xué)雜志，2017，46（2）：93-97.

[11] Tanaka S，Hosokawa M，Ueda K，et al. Effects of decitabine on invasion and exosomal expression of miR-200c and miR-141 in oxaliplatin-resistant colorectal cancer cells[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin，2015，38（9）：1272-1279.

[12] 惠菲菲，劉凱，楊家和，等.同時性結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中Kiss-1蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9蛋白的表達(dá)及意義[J].中華消化外科雜志，2016，15（2）：153-160.

[13] 秦樂，曾妍.E-cadherin缺失表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)性多元Cox回歸分析[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2017， 33（1）：7-9.

[14] Tanaka S，Hosokawa M，Yonezawa T，et al. Induction of epithelial-mesenchymal transition and down-regulation of miR-200c and miR-141 in oxaliplatin-resistant colorectal cancer cells[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin，2015，38（3）：435-440.

[15] Hsiao KY，Wu MH，Chang N，et al. Coordination of AUF1 and miR-148a to destabilize DNA methyltransferase 1 mRNA under hypoxia in endometriosis[J]. Molecular Human Reproduction，2015，21（12）：894.

[16] Bustamante-Marin XM，Cook MS，Gooding J，et al. Left-biased spermatogenic failure in 129/SvJ Dnd1Ter/+ mice correlates with differences in vascular architecture，oxygen availability，and metabolites[J]. Biology of Reproduction，2015，93（3）：78.

[17] 武雪亮，薛軍，王立坤，等.DNA結(jié)合分化抑制蛋白1和基質(zhì)金屬蛋白酶9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與微血管密度的相關(guān)性[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2016，38（6）：696-701.

[18] 周仲國，王若婧，潘志忠，等.Pim-3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系[J].廣東醫(yī)學(xué)，2015，36（23）：3627-3630.

[19] 汪毅，袁偉，馬肖，等.miR-152在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系[J].中華腫瘤雜志，2016，38（10）：763-766.

[20] 武雪亮，王立坤，薛軍，等.結(jié)直腸癌組織中DNA結(jié)合分化抑制蛋白1和MMP-9的表達(dá)及其與LMVD的相關(guān)性[J].腫瘤防治研究，2016，43（11）：959-963.

（收稿日期：2018-01-09）