補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合抗真菌藥物治療侵襲性念珠菌病的實(shí)驗(yàn)研究

林通 張玉奇 李小悅

[摘要]目的 探討補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合抗真菌藥物治療IC小鼠的有效性和可能機(jī)制。方法 60只雄性昆明小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺預(yù)處理后腹腔注射白念珠菌混懸液，制作IC小鼠模型。造模成功后隨機(jī)分為對(duì)照組（n=30）和實(shí)驗(yàn)組（n=30）。兩組均給予抗真菌藥物灌胃治療，實(shí)驗(yàn)組同時(shí)給予補(bǔ)中益氣湯[4 g/（kg·d）]灌胃，對(duì)照組同時(shí)給予等量生理鹽水灌胃。觀察兩組的第7天生存率；采用ELISA檢測(cè)IC小鼠肝組織、血清中的TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)IC小鼠淋巴細(xì)胞亞群中CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+的表達(dá)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組第7天的生存率顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組IC小鼠肝組織和血清中IL-10均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；兩組IC小鼠肝組織和血清中的TNF-α、IL-6表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組IC小鼠淋巴細(xì)胞亞群中CD4+/CD8+比值顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；兩組IC小鼠淋巴細(xì)胞亞群中CD3+、CD4+、CD8+比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合抗真菌藥物可以提高IC小鼠第7天的生存率，可能與提高細(xì)胞免疫功能和降低免疫抑制的發(fā)生有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]侵襲性念珠菌病；補(bǔ)中益氣湯；有效性；細(xì)胞因子

[中圖分類號(hào)] R519.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）8（c）-0047-04

[Abstract] Objective To investigate the effectiveness and possible mechanism of Buzhongyiqi Decoction combined with anti-fungal agents treating invasive candidiasis. Methods Sixty male Kunming mice were pretreated with CTX and then injected with Candida albicans suspension in abdominal cavity， the IC mice model was made. After modeled successfully， they were randomly divided into control group （n=30） and experimental group （n=30）. Two groups were given anti-fungal therapy， while mice in the experimental group were given Buzhongyiqi Decoction of 4 g/（kg·d）and the control group was given the same amount of normal saline. The survival rate in the seventh day in the two groups were observed. The expressions of TNF-α， IL-6 and IL-10 in liver tissues and serum of IC mice were detected by ELISA. The expressions of CD3+， CD4+， CD8+ and CD4+/CD8+ in lymphocyte subsets of IC mice were detected by flow cytometry. Results The survival rate in the seventh day of the experimental group was significantly higher than that of the control group （P<0.05）. The expressions of IL-10 in liver tissue and serum of IC mice in the experimental group were significantly lower than those of the control group （P<0.05）. There were no significant difference in liver tissue and serum on expressions of TNF-αand IL-6 in IC mice between the two groups （P>0.05）. The ratio of CD4+/CD8+ in lymphocyte subsets of IC mice in the experimental group were significantly higher than that of the control group （P<0.05）. There were no significant difference of CD3+， CD4+ and CD8+ expressions in lymphocyte subsets of IC mice between the two groups （P>0.05）. Conclusion Buzhongyiqi Decoction combined with anti-fungal agents can improve the survival rate in the seventh day of IC mice， which may be related to the enhancement of cellular immune function and the reduction of immunosuppression.

[Key words] Invasive candidiasis； Buzhongyiqi Decoction； Effectiveness； Cytokine

近年來(lái)，由于廣譜抗生素和免疫抑制藥物的使用、器官移植及有創(chuàng)導(dǎo)管技術(shù)的開展，侵襲性念珠菌?。╥nvasive candidiasis，IC）的發(fā)病率不斷上升，正越來(lái)越受到臨床重視[1]。我們的前期研究顯示，免疫功能低下參與IC的發(fā)生、發(fā)展，提高免疫功能可以改善IC小鼠的預(yù)后[2]。作為臨床治療脾虛證的經(jīng)典方劑之一，補(bǔ)中益氣湯具有補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)舉陷的功效[3]。已有基礎(chǔ)研究證實(shí)，補(bǔ)中益氣湯可提高脾氣虛動(dòng)物模型的免疫功能[4]。本研究擬探討補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合抗真菌藥物治療IC動(dòng)物模型的有效性和可能機(jī)制，為補(bǔ)中益氣湯應(yīng)用于IC的臨床治療提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型的建立

選取60只雄性昆明小鼠[許可證編號(hào)：SCXK（粵）2009-0011]，體重20～25 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

實(shí)驗(yàn)開始前2 d給予環(huán)磷酰胺200 mg/kg預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)開始前1 d給予環(huán)磷酰胺100 mg/kg預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)開始后第4天給予環(huán)磷酰胺200 mg/kg復(fù)制免疫缺陷小鼠模型。將白念珠菌（沙保弱培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h）配制標(biāo)準(zhǔn)混懸液（1×109 cfu/ml），采用腹腔注射白念珠菌混懸液的方法，制作IC小鼠模型[5-6]。

1.2主要試劑

中藥復(fù)方為黃芪30 g，升麻6 g，柴胡6 g，邊條參10 g，炙甘草15 g，當(dāng)歸6 g，橘皮6 g，白術(shù)10 g。所有藥材均購(gòu)自廣州市藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為合格品。生藥加適量水浸泡30 min，煎煮2次（分別為1.5 h和1 h），將濾液混合并濃縮至補(bǔ)中益氣湯1 g/ml，4℃保存?zhèn)溆?；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞，H32020857）；白念珠菌（由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供，ATCC90028）；伊曲康唑口服液（比利時(shí)楊森，H20130425）；ELISA試劑盒（美國(guó)R&D; system公司，批號(hào)：20175244231）；FITC熒光抗體（美國(guó)Pharmingen公司，批號(hào)：201564587）。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

將造模成功的60只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組30只。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均給予抗真菌藥物灌胃治療（伊曲康唑口服液，50 mg/kg，Q12 h，稀釋成1 ml溶液）。實(shí)驗(yàn)組同時(shí)給予補(bǔ)中益氣湯4 g/（kg·d）灌胃，對(duì)照組同時(shí)給予等量生理鹽水灌胃。動(dòng)物模型建立后第7天處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm腎組織勻漿，沙保弱培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行腎組織念珠菌菌落計(jì)數(shù)，以明確是否建模成功。采集肝組織標(biāo)本儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用[5-6]。

1.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

兩組IC小鼠第7天生存率；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后取肝臟勻漿，取上清液；留取腹主動(dòng)脈血0.5 ml。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)IC小鼠肝組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-10表達(dá)；采用ELISA檢測(cè)IC小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10的表達(dá)；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)IC小鼠淋巴細(xì)胞亞群中CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組IC小鼠第7 天生存率的比較

實(shí)驗(yàn)組IC小鼠第7 天累計(jì)死亡10只，對(duì)照組累計(jì)死亡18只。實(shí)驗(yàn)組的第7天生存率（66.7%）顯著高于對(duì)照組（40.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.038）。

2.2兩組IC小鼠肝組織中TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)的比較

實(shí)驗(yàn)組IC小鼠肝組織中的IL-10表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；兩組IC小鼠肝組織中的TNF-α、IL-6表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.3兩組IC小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)的比較

實(shí)驗(yàn)組IC小鼠血清中的IL-10表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組IC小鼠血清中的TNF-α、IL-6比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

2.4兩組淋巴細(xì)胞亞群的比較

實(shí)驗(yàn)組的CD4+/CD8+比值顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組的CD3+、CD4+、CD8+比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

3討論

3.1 IC的發(fā)病機(jī)制

IC是臨床常見病、多發(fā)病，與有創(chuàng)操作、廣譜抗感染藥物的使用、慢性基礎(chǔ)疾病直接相關(guān)，常導(dǎo)致預(yù)后不良和治療費(fèi)用增加[7]。念珠菌屬，尤其是最常見的白念珠菌，在生理狀態(tài)下定植在消化道，一旦出現(xiàn)創(chuàng)傷、應(yīng)激等病理生理學(xué)改變，就會(huì)通過(guò)多種渠道播散感染，即發(fā)生侵襲性改變。目前臨床使用的抗真菌藥物以三唑類、棘白菌素類和多烯類為主，其作用靶點(diǎn)是破壞真菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜及其組分。隨著卡泊芬凈、伏立康唑等新型抗真菌藥物投入臨床，IC擺脫了既往治療藥物缺乏的尷尬境地，但I(xiàn)C治療效果仍不容樂(lè)觀，探索IC新的治療靶點(diǎn)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

西醫(yī)和中醫(yī)對(duì)于IC的發(fā)病機(jī)制有相似的見解。通過(guò)大量臨床研究，鑒于念珠菌是機(jī)會(huì)致病菌的事實(shí)，目前西醫(yī)認(rèn)為，免疫功能紊亂在IC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8-9]。T輔助淋巴細(xì)胞在組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHCⅡ）的限制下，分化為Thl和Th2兩類。Thl細(xì)胞可分泌IL-2、干擾素（IFN）、TNF、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等，通過(guò)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)吞噬、殺滅真菌；同時(shí)使細(xì)胞變性、壞死、血管通透性增加，導(dǎo)致組織和器官損傷。Th2細(xì)胞可分泌IL-4、IL-10等，通過(guò)刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，對(duì)真菌感染起調(diào)理素樣作用，同時(shí)抑制Thl細(xì)胞功能，使感染遷延[10-11]。淋巴細(xì)胞參與IC發(fā)病機(jī)制的表現(xiàn)在CD4+/CD8+比值的變化，已得到基礎(chǔ)和臨床研究的證實(shí)[2]。

中醫(yī)認(rèn)為，IC的病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，邪盛正衰[10]。衛(wèi)氣發(fā)揮正氣防御外邪的作用，是肺、脾、腎功能協(xié)調(diào)旺盛的結(jié)果，即衛(wèi)氣化生于腎中之陽(yáng)氣，充養(yǎng)于中焦脾胃，散布于肺氣的宣發(fā)，而三臟協(xié)調(diào)旺盛的關(guān)鍵又在于脾[12-13]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中醫(yī)脾與淋巴的免疫功能密切相關(guān)[12-14]?！镀⑽刚摗分赋觥皟?nèi)傷脾胃，百病由生”。脾不僅主運(yùn)化水谷精微，為后天之本，還能行使防御功能。IC多因年老、久病、長(zhǎng)期臥床、外傷等原因致肺脾虧虛，痰濕、痰熱等外邪乘虛而入，肺失宣降、脾失健運(yùn)所致[10-15]。補(bǔ)中益氣湯為宋代李杲《內(nèi)外傷辨惑論》之方劑，具有補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)舉陷之功，是臨床上治療脾虛證的經(jīng)典方劑。研究表明，補(bǔ)中益氣湯可提高脾氣虛動(dòng)物模型中的免疫器官指數(shù)，有助于提高免疫功能[12-16]。目前針對(duì)補(bǔ)中益氣湯治療脾虛動(dòng)物模型的研究?jī)H限于T淋巴細(xì)胞增殖能力和脾淋巴細(xì)胞抗氧化損傷，尚無(wú)將補(bǔ)中益氣湯用于治療IC動(dòng)物模型的相關(guān)研究[11-17]。

3.2免疫調(diào)理治療與IC的綜合救治

基于抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)和提升細(xì)胞免疫的免疫調(diào)理一度是膿毒癥治療的希望，但存在以下幾點(diǎn)問(wèn)題：膿毒癥范疇涵蓋內(nèi)外科疾病及其他基礎(chǔ)疾病，疾病一致性較差，不利于小樣本研究評(píng)價(jià)；免疫調(diào)理治療重在宏觀治療，即外周血炎癥指標(biāo)和細(xì)胞免疫指標(biāo)變化趨勢(shì)，但免疫調(diào)理治療的靶器官以及細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能是否發(fā)生改變尚難以有效評(píng)估。我們的前期研究結(jié)果顯示，補(bǔ)中益氣湯可以通過(guò)抑制氮化應(yīng)激水平促進(jìn)念珠菌病動(dòng)物模型肝細(xì)胞線粒體的生物發(fā)生，降低氮化應(yīng)激程度與肝細(xì)胞保護(hù)的相關(guān)作用，提示補(bǔ)中益氣湯可能促進(jìn)IC動(dòng)物模型的肝功能修復(fù)[13-18]。因此本研究通過(guò)以下設(shè)計(jì)，闡述觀點(diǎn)：補(bǔ)中益氣湯是否可以降低IC動(dòng)物模型的死亡率；補(bǔ)中益氣湯是否可以減輕靶器官炎癥和全身炎癥反應(yīng)綜合征；補(bǔ)中益氣湯是否可以改善IC動(dòng)物模型中細(xì)胞的免疫功能。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組IC大鼠第7天的生存率顯著高于對(duì)照組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組IC大鼠肝組織和血清中的IL-10表達(dá)均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞亞群中CD4+/CD8+比值顯著高于對(duì)照組（P<0.05），提示補(bǔ)中益氣湯可以提高IC小鼠第7天生存率，可能與提高細(xì)胞免疫功能和降低免疫抑制的發(fā)生有關(guān)。

免疫調(diào)理治療闡釋了IC的重要發(fā)病機(jī)制，是IC治療的重要研究方向。本研究提示，補(bǔ)中益氣湯在IC治療中有一定的應(yīng)用前景，其量效關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

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