高強度聚焦超聲對大鼠卵巢癌的治療效果及對免疫功能的影響

熊慧 劉小紅 周欣 楊智利 肖菊花

[摘要]目的 探討高強度聚焦超聲（HIFU）對大鼠卵巢癌的治療效果及對免疫功能的影響。方法 選取40只SD大鼠構(gòu)建原位卵巢癌模型，隨機分為對照組、HIFU組，每組20只。HIFU組行局部HIFU治療，對照組給予假照射處理。觀察兩組大鼠的生存狀態(tài)，檢測腫瘤生長情況；HE染色觀察腫瘤組織形態(tài)學變化；利用流式細胞儀檢測血漿中CD4+、CD8+水平。結(jié)果 HIFU組大鼠經(jīng)HIFU治療7 d生活狀態(tài)無變化或有好轉(zhuǎn)，對照組大鼠逐漸衰竭。HIFU組大鼠的中位生存時間為（48.0±4.5）d，明顯長于對照組的（40.0±3.6）d（P<0.05）。HIFU組大鼠瘤體平均重量為（1.37±0.92）g，顯著低于對照組的（2.86±0.73）g（P<0.05）。HIFU組大鼠卵巢組織發(fā)生顯著形態(tài)學變化，血漿中CD4+較對照組顯著增高， CD8+較對照組顯著降低，CD4+/CD8+較對照組提高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 HIFU具有抑制腫瘤生長的作用，可能與增強機體免疫功能有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]卵巢癌；高強度聚焦超聲；免疫

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）8（c）-0044-03

[Abstract] Objective To investigate the treatment effect of high intensity focused ultrasound on ovarian cancer and its influence on immune function of rats. Methods A total of 40 SD rats were selected to construct ovarian cancer in situ models and were randomly divided into control group and HIFU group. HIFU group was treated with local HIFU， while the control group was treated with sham irradiation. The survival state of rats in the two groups were observed， the growth of the tumor were detected， the histomorphological changes of the tumor were observed by HE staining， and the level of CD4+ and CD8+ in the plasma were detected by flow cytometry. Results In HIFU group， the living conditions of the rats were not changed or improved treated by HIFU for 7 days， while the rats in the control group gradually failed. The median survival time of rats in HIFU group was （48.0±4.5） d， which was significantly longer than that in the control group （[40.0±3.6] d） （P<0.05）. The average weight of tumor in HIFU group was （1.37±0.92） g， which was significantly lower than that in control group （[2.86±0.73] g） （P<0.05）. There were significant morphological changes in the ovarian tissue of rats in HIFU group， and the CD4+ in the plasma was significantly higher than that in the control group， while the CD8+ was significantly lower than the control group， and the CD4+/CD8+ was higher than the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion HIFU may inhibit tumor growth， which may be related to enhancing immune function of the body.

[Key words] Ovarian cancer； High intensity focused ultrasound； Immunization

卵巢癌死亡率在女性生殖道惡性腫瘤中僅次于宮頸癌[1]。全球每年新發(fā)患者約19.2萬，死亡人數(shù)卻高達11.4萬[2]。由于早期難以檢測且生長部位隱蔽，發(fā)現(xiàn)時70%～80%已發(fā)展為晚期[3-4]。目前，常規(guī)的手術(shù)、化療嚴重影響患者的生存質(zhì)量。因此，針對腫瘤無法切除或者情況較差的患者，急需新的治療模式來改善預(yù)后。高強度聚焦超聲（HIFU）是一種非侵入性治療腫瘤的新技術(shù)[5-6]，研究發(fā)現(xiàn)，HIFU除可以有效破壞癌組織外[7]，還提高機體的抗腫瘤免疫力[7]，為卵巢癌的治療提供新思路。

本課題首次采用Walker-256建立原位卵巢癌模型，觀察HIFU的治療效果以及對腫瘤免疫的影響，以探尋一種較好的微創(chuàng)治療方法。

1材料與方法

1.1實驗材料

Walker-256腫瘤細胞由中國醫(yī)學科學院提供，40只雌性SD大鼠[許可證編號：SYXK（贛）2015-0001]，購自南昌大學動物中心，體重250～300 g，所有大鼠飼養(yǎng)于實驗室動物房，實驗中對動物的處置符合醫(yī)學倫理學標準。

1.2動物模型的建立

大鼠卵巢癌模型構(gòu)建根據(jù)本課題組前期研究方法[8]，SD大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺，取腹部旁縱切口逐層進腹。將1 mm3大小的Walker-256腫瘤組織塊種植在卵巢內(nèi)。構(gòu)建成功14 d后，隨機分為對照組和HIFU組，每組20只。HIFU組大鼠進行HIFU治療，對照組給予假照射處理。

1.3 HIFU治療過程

大鼠麻醉固定后掃描皮下腫瘤超聲圖像，點間距1.6 mm，功率30 W，時間1 s，總治療時間約60 s，治療過程中實時監(jiān)控超聲圖像，根據(jù)消融后超聲灰度圖的變化估算消融體積，消融1次完成。

1. 4觀察指標

大鼠解剖后分離收集腫瘤組織進行稱量，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對照組平均瘤重-HIFU組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。HE染色法觀察腫瘤組織形態(tài)學變化；利用流式細胞儀檢測血漿中CD4+與CD8+百分比，并計算CD4+/CD8+值。

1.5統(tǒng)計學方法

利用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，采用Kaplan-Meier進行生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1大鼠的一般狀況及兩組生存時間的比較

大鼠在構(gòu)建卵巢癌模型14 d后逐漸出現(xiàn)皮毛松散、行動遲緩以及腹水，14 d內(nèi)均無死亡。大鼠經(jīng)HIFU治療7 d內(nèi)，生活狀態(tài)無變化或有好轉(zhuǎn)，對照組大鼠逐漸衰竭。HIFU組大鼠中位生存時間為（48.0±4.5）d，明顯長于對照組的（40.0±3.6）d（P<0.05）（圖1）。

2.2大鼠瘤體生長情況

HIFU組大鼠瘤體平均重量為（1.37±0.92）g，顯著低于對照組的（2.86±0.73）g（P<0.05）；其抑瘤率為52.11%，提示HIFU治療具有顯著抑制腫瘤生長的作用。

2.3大鼠卵巢腫瘤組織形態(tài)學變化

大鼠卵巢組織經(jīng)HE染色在光鏡下觀察，對照組大鼠卵巢組織內(nèi)可見不規(guī)則癌巢，腫瘤細胞排列緊密，異型性明顯，形態(tài)不規(guī)則，漿少、核分裂相多見、腫瘤內(nèi)部可見部分壞死（圖2A）；HIFU組大鼠卵巢組織細胞呈現(xiàn)皺縮，核染色質(zhì)邊集，可見明顯大面積壞死，并伴有炎癥細胞浸潤（圖2B）。

2.4兩組大鼠治療后細胞免疫功能相關(guān)指標的比較

卵巢癌大鼠經(jīng)HIFU治療后，血液中CD4+較對照組顯著增高，CD8+較對照組顯著降低，CD4+/CD8+較對照組提高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

3討論

HIFU最早被應(yīng)用于腦部實驗與神經(jīng)選擇性損傷實驗研究[9]，其原理是利用超聲波可以穿透軟組織的物理特性，使靶區(qū)的組織出現(xiàn)凝固性壞死[10-12]，該技術(shù)為卵巢癌等實體腫瘤患者的治療提供了新思路[13]。

本實驗利用原位移植法構(gòu)建大鼠卵巢癌模型，該模型的生物學行為與臨床病程更相似[14]。經(jīng)HIFU治療后大鼠生存狀態(tài)無惡化，并能降低大鼠瘤體平均重量，抑瘤率超過50%，且病理檢查證實能引起卵巢組織形態(tài)學改變，加速癌組織的壞死，這都較直觀地證實了HIFU能有效抑制卵巢癌大鼠腫瘤組織的生長。

研究發(fā)現(xiàn)，HIFU在破壞癌組織的同時，可提高機體的抗腫瘤免疫力[15-16]。有報道稱，HIFU治療能影響瘤荷W256肝癌鼠局部組織中T淋巴細胞亞群組成而提高其免疫能力[17]。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌大鼠經(jīng)HIFU治療后CD4+細胞和CD8+細胞發(fā)生變化，其中CD4+細胞增加明顯，且CD4+/CD8+細胞比值>1，提示HIFU治療能改善大鼠的免疫功能。

HIFU抑瘤作用主要是加速瘤組織的凝固性壞死[18-19]。此外，HIFU可暴露隱蔽的腫瘤抗原，加速清除殘余癌細胞[20]。但HIFU在治療卵巢腫瘤中的效果仍需進一步研究。

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