三氯化鋁在酸性環(huán)境中對斑馬魚幼魚運動及學(xué)習(xí)記憶能力的影響

張萍，賀凱宏，陳建平，尚楠，牛僑，張勤麗

山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，太原 030000

鋁(Al)元素在地殼中的含量僅次于氧(O)和硅(Si)，居第三位，是地殼中含量最豐富的金屬元素,占整個地殼總重量的7.45%。雖然適量的鋁攝入對人體無害，但隨著鋁及其化合物被廣泛用作藥物、食品添加劑、水的凈化劑及各種炊具，鋁的蓄積毒性，尤其是鋁的神經(jīng)毒性也越來越受到人們的關(guān)注。研究報道，職業(yè)鋁接觸工人的尿鋁濃度[1]及退休10年后的血鋁濃度[2]仍顯著高于對照人群；鋁作業(yè)工人的認知水平和學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降[3-4]，且認知能力的下降與血鋁和尿鋁的內(nèi)暴露水平有關(guān)，甚至引起阿爾茲海默病(AD)[5-7]。動物實驗在家兔及大鼠鋁中毒模型中都發(fā)現(xiàn)了鋁致阿爾茲海默病的特征性改變[8-9]。本課題組研究表明，鋁可以導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡及tau蛋白異常磷酸化[10]，并且可以通過多種機制誘導(dǎo)神經(jīng)細胞死亡[11]，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降[12-13]。

近年來，由于人類活動的影響，酸雨問題日益嚴重，同時帶來的問題是水體的pH值降低和土壤酸化。Monette等[14]的研究表明，土壤酸化使鋁離子進入周圍的水中使水體中鋁離子聚集，鋁的溶解度增加進而使水體的pH值降低，導(dǎo)致水中無機鋁離子增加，而鋁的毒性與鋁離子的存在形式和水體的酸度值有關(guān)。無機鋁對魚類具有很大的毒性，對魚類的多個器官系統(tǒng)均可造成影響，尤其是腦組織[15]。污水處理用到的混凝劑中也含有鋁，酸化的污水可以使水中無機鋁含量升高，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示污水中過量的鋁與神經(jīng)變性有極大的關(guān)聯(lián)[16]。

研究三氯化鋁在酸性環(huán)境中對斑馬魚幼魚的可能的神經(jīng)毒性具有非常重要的意義，因為數(shù)量足夠和功能良好的神經(jīng)細胞是認知功能的必要物質(zhì)基礎(chǔ)，神經(jīng)系統(tǒng)損害必定會降低認知功能，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的下降。幼魚正處于生長發(fā)育期，神經(jīng)系統(tǒng)也正在發(fā)育完善，對外界的刺激更加敏感，如果此時遭受到損害，那么毒性作用可能會長久的存在[17]。He等[18]曾使用應(yīng)激逃避模型來研究不同pH值和鋁相互作用對斑馬魚成魚運動和學(xué)習(xí)記憶的影響，但具體的學(xué)習(xí)記憶變化情況并未詳細闡述。

本課題組已經(jīng)有學(xué)者用斑馬魚胚胎和幼魚作為實驗對象，研究了氯化鋁暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育和幼魚神經(jīng)行為的影響[19]。本次實驗在課題組之前學(xué)者的研究基礎(chǔ)之上結(jié)合其他學(xué)者的實驗方法[18]加以改進，以斑馬魚胚胎和幼魚為實驗對象，探索性運用了單一多次光刺激觀察斑馬魚幼魚到達平臺速度的光照次數(shù)作為斑馬魚幼魚學(xué)習(xí)記憶模型，探討酸性環(huán)境下鋁對斑馬魚幼魚運動能力及學(xué)習(xí)記憶能力的影響，為深入研究鋁致神經(jīng)系統(tǒng)方面疾病、斑馬魚幼魚學(xué)習(xí)記憶模型、藥物的篩選和環(huán)境治理等方面提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑和儀器

1.1.1 主要試劑

稀鹽酸(HCl，36%～38%，科密歐化學(xué)試劑有限公司，天津，中國)；結(jié)晶氯化鋁(AlCl3·6H2O, 99.5%)分析純(購于美國Sigma公司)

1.1.2 主要儀器

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(愛生科技發(fā)展有限公司ESEN-PW-5，北京，中國)；Noldus幼魚運動行為儀(Noldus Information Technology EthoVision XT-10，美國)；幼魚孵化箱(智誠ZXSR-1090，上海，中國)；循環(huán)凈水機(Heal ForceBio-Meditech RS232，香港，中國)；便攜式pH計(Alalis儀器科技有限公司PH300，上海，中國)

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組

選擇健康野生型Tu品系斑馬魚，購買于武漢國家斑馬魚資源中心，飼養(yǎng)在斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中。溫度控制在(28 ± 0.2) ℃，光照周期為光照∶黑暗=14 h∶10 h。每天規(guī)律喂食孵化出的豐年蝦2次，成魚雌雄分開飼養(yǎng)。實驗前一天將親魚按比例(雌∶雄=1∶2)放入交配缸中，里面加入養(yǎng)殖系統(tǒng)中的水。于第2天早晨取出隔板使其自然交配。采集受精后30 min的魚卵，將其放入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入孵化液(孵化液由養(yǎng)殖系統(tǒng)中的水配制，將pH調(diào)至7.2，電導(dǎo)率為500～550 μS·cm-1)，置于28.5 ℃孵化箱。將受精后6 h(6 hpf)的魚卵置于光學(xué)顯微鏡下觀察，確定其發(fā)育階段，并選擇正常的受精卵進行實驗。將6 hpf的斑馬魚胚胎分成2個大組，分別為對照組和三氯化鋁組(鋁離子濃度為2 mg.mL-1)，以觀察三氯化鋁的毒性作用。每一大組又細分為中性(pH7.4)、微酸(pH6.4)和、酸性(pH5.4)組(pH值通過加入稀鹽酸進行調(diào)節(jié))，以觀察酸性環(huán)境分別及與三氯化鋁的共同毒性作用。將斑馬魚魚卵置于6孔板中，里面加入不同組的溶液(鋁離子組溶液由斑馬魚系統(tǒng)養(yǎng)殖水配制，每個孔加入20個魚卵，10 mL的溶液，共設(shè)置8個平行組。每隔6 h觀察斑馬魚幼魚孵化情況，每天更換一半的溶液，一直持續(xù)到第7天。

1.2.2 斑馬魚幼魚機械觸動逃避反射

選擇6 hpf的斑馬魚幼魚，將其暴露在不同組的溶液中，一直持續(xù)到72 hpf。將斑馬魚幼魚置于直徑為10 cm盛有孵化液的平皿中，放在印有多個直徑為1 cm圓圈的塑封紙上。輕輕移動平皿，使斑馬魚幼魚處于圓圈的中央。然后用探針輕觸幼魚尾部，記錄其逃出圓圈的次數(shù)(身體壓在圓圈線上的不算逃出)。每個組隨機選取10條幼魚，每條幼魚機械觸動20次，時間限制在2 min。

1.2.3 斑馬魚幼魚自發(fā)運動觀察

將暴露在不同組溶液中的斑馬魚養(yǎng)至144 hpf，每個濃度組取24條幼魚放置到24孔板中，里面加入2 mL的孵化液。然后將24孔板放到Noldus幼魚運動行為儀中，采集3 min幼魚運動視頻。應(yīng)用Ethovision XT 軟件(Noldus Information Technology，美國)將運動軌跡可視化，導(dǎo)出幼魚3 min內(nèi)的運動軌跡圖、移動距離、運動速度等運動參數(shù)。設(shè)置3次重復(fù)試驗。

1.2.4 斑馬魚幼魚單一多次光刺激實驗

將暴露在不同組溶液中的斑馬魚養(yǎng)至168 hpf，每個濃度組取24條幼魚放置到24孔板中，里面加入2 mL的孵化液。利用Noldus設(shè)定好程序，黑暗3 min-光照1 min-黑暗3 min，共10個循環(huán)，應(yīng)用Ethovision XT軟件導(dǎo)出運動速度、運動距離等參數(shù)。分析幼魚到達平臺速度的次數(shù)。

1.2.5 結(jié)果統(tǒng)計和分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 斑馬魚幼魚觸動逃避反射實驗

圖1 斑馬魚幼魚觸動逃避次數(shù)注：A圖中a表示三氯化鋁組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；B圖中*表示酸性、微酸組與中性組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Fig. 1 The touch escape times of zebrafish larvaeNote: in Figure A, a indicated there is statistically significant difference between the control group and the aluminum chloride treated group (P<0.05); in Figure B, * indicated there is statistically significant difference between the neutral group and the acidic, slightly acidic group (P<0.05).

采用析因設(shè)計的方差分析方法研究發(fā)現(xiàn)酸度值與鋁之間存在交互作用(F=10.642，P<0.001)，酸性對照組與微酸、中性對照組相比，斑馬魚幼魚機械逃避次數(shù)下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.911，P<0.001)；微酸、酸性三氯化鋁組與中性三氯化鋁組相比，逃避次數(shù)顯著減少(F=54.274，P<0.001)，三氯化鋁組與對照組之間兩兩比較，微酸、酸性環(huán)境下三氯化鋁組機械逃避次數(shù)顯著減少(P<0.05)。

2.2 斑馬魚幼魚自發(fā)運動結(jié)果

采用單因素方差分析的方法研究發(fā)現(xiàn)酸性對照組與微酸、中性對照組相比，幼魚平均速度和移動距離下降(P<0.001)，微酸、酸性三氯化鋁組與中性三氯化鋁組相比平均速度和移動距離下降(P<0.001)，三氯化鋁組與對照組之間兩兩比較，中性、微酸、酸性三氯化鋁組斑馬魚幼魚平均速度和移動距離下降(P<0.001)。如下表3所示，鋁可以使斑馬魚幼魚的運動速度降低，當pH降低后，斑馬魚幼魚的速度與移動距離均顯著降低。如圖2所示，鋁暴露組與對照組相比，斑馬魚幼魚運動軌跡減少，并且更加雜亂無章。

圖2 斑馬魚幼魚自發(fā)運動軌跡圖注：A. 中性對照組；B. 中性三氯化鋁組；C. 微酸對照組；D. 微酸三氯化鋁組；E. 酸性對照組；F. 酸性三氯化鋁組。Fig. 2 The spontaneous motion picture of zebrafish larvaeNote: A. Neutral control group; B. Neutral aluminum chloride treated group; C. Slightly acidic control group. D. Slightly acidic aluminum chloride treated group; E. Acidic control group; F. Acidic aluminum chloride treated group.

酸性Acidic微酸Slightly acidic中性Neutral對照組Control鋁離子組Aluminum對照組Control鋁離子組Aluminum對照組Control鋁離子組Aluminum平均速度/(mm·s-1)Mean velocity/(mm·s-1)2.86±0.1482a2.51±0.1451bc2.88±0.12152.74±0.2062bc3.28±0.18982.92±0.1714c移動距離/mmMoving distance/mm513.450±26.53a450.283±26.12bc514.766±21.61487.709±36.74bc547.632±35.37523.667±30.83c

注：a表示酸性對照組、微酸對照組與中性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；b表示酸性、微酸三氯化鋁組與中性三氯化鋁組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；c表示三氯化鋁組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Note： a indicated there is statistically significant difference between the acidic, slightly acidic control group and the neutral control group (P<0.05); b indicated there is statistically significant difference between the acidic, slightly acidic aluminum treated group and the neutral aluminum treated group (P<0.05); c indicated the difference between the aluminum chloride treated group and the control group was statistically significant (P<0.05).

2.3 斑馬魚幼魚單一多次強光刺激結(jié)果

采用析因設(shè)計的方差分析方法研究結(jié)果表明三氯化鋁組與不同酸度值之間存在交互作用(F=9.086，P<0.001)，酸性對照組與微酸、中性對照組相比，幼魚到達平臺速度的光照次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.331，P<0.001)，微酸、酸性三氯化鋁組與中性三氯化鋁組相比斑馬魚幼魚到達平臺速度的潛伏次數(shù)均顯著增加(F=56.299，P<0.001)，三氯化鋁組與對照組之間兩兩比較，中性、微酸和酸性三氯化鋁組斑馬魚幼魚到達平臺速度的潛伏次數(shù)顯著增加(P<0.001)。

圖3 斑馬魚幼魚單一多次強光刺激速度變化注： A. 不同酸度值環(huán)境下三氯化鋁組幼魚到達平臺速度的光照次數(shù)；B. 中性環(huán)境下幼魚到達平臺速度的光照次數(shù)；C. 微酸環(huán)境下幼魚到達平臺速度的光照次數(shù)；D. 酸性環(huán)境下幼魚到達平臺速度的光照次數(shù)。Fig. 3 The speed change of zebrafish larvae induced by single multiple strong light stimulationNote: A. The illumination times when zebrafish larvae reached the platform speed in aluminum chloride treated groups under diffenrent acidity environment; B. the illumination times when zebrafish larvae reached the platform speed in neutral environment; C. the illumination times when zebrafish larvae reached the platform speed in slightly acidic environment; D. the illumination times when zebrafish larvae reached the platform speed in acidic environment.

酸性Acidic微酸Slightly acidic中性Neutral對照組Control三氯化鋁組Aluminum對照組Control三氯化鋁組Aluminum對照組Control三氯化鋁組Aluminum光照次數(shù)Illumination times4.125±0.462a4.792±0.721bc4.375±0.4185.833±0.702bc5.208±0.5096.875±0.612c

注：a酸性對照組、微酸對照組與中性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；b表示酸性、微酸三氯化鋁組與中性三氯化鋁組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；c表示三氯化鋁組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Note： a indicated there is statistically significant difference between the acidic, slightly acidic control group and the neutral control group (P<0.05); b indicated there is statistically significant difference between the acidic, slightly acidic aluminum treated group and the neutral aluminum treated group (P<0.05); c indicated the difference between the aluminum chloride treated group and the control group was statistically significant (P<0.05).

3 討論(Discussion)

本次實驗用到的模式動物是斑馬魚，斑馬魚作為一種新型的脊椎動物模型，具有典型的脊椎動物腦部特征，并且分子遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)背景明確，大多數(shù)基因都與人類有著50%～80%的同源性和神經(jīng)行為的相似性，在毒理學(xué)神經(jīng)發(fā)育中應(yīng)用廣泛[20]。如史慧勤等[21]用斑馬魚作為模式動物，觀察氯丙嗪暴露對斑馬魚胚胎和幼魚早期神經(jīng)發(fā)育的影響，崔國禎等[22]研究鋁對斑馬魚幼魚的神經(jīng)毒性作用及其轉(zhuǎn)錄組學(xué)。與小鼠和大鼠等動物模型相比，斑馬魚具有產(chǎn)卵量大，實驗周期短，胚胎透明易于觀察，給藥方式簡單，樣本數(shù)量大，可以確保統(tǒng)計學(xué)意義等優(yōu)點。

目前，已經(jīng)有相對標準的實驗方法T迷宮來檢測成魚的學(xué)習(xí)記憶能力，但是對于幼魚的學(xué)習(xí)記憶模型并未有統(tǒng)一的標準。各個學(xué)者正在積極探索斑馬魚幼魚的學(xué)習(xí)記憶模型，如胡占英等[23]在研究長春新堿對斑馬魚幼魚學(xué)習(xí)記憶影響時，就使用了3次強光刺激觀察斑馬魚幼魚對光驚恐反射的學(xué)習(xí)記憶情況。本次實驗綜合各個學(xué)者的研究方法，以斑馬魚胚胎和幼魚為實驗對象，使用單一多次強光刺激作為幼魚的學(xué)習(xí)記憶模型，結(jié)合多種實驗方法詳細闡述酸性環(huán)境下低濃度鋁暴露對斑馬魚幼魚運動能力和早期學(xué)習(xí)記憶的影響情況。

水體酸度值的改變能夠使魚類的生理及生化功能改變，進而引起魚類的運動能力下降,鋁能以離子形式(三價鋁離子)通過魚鰓部不斷積累導(dǎo)致鈉鉀-ATP酶活性減弱，使金屬毒性不斷加深，致使魚類運動活性減弱[14, 24]。本次實驗通過研究低濃度三氯化鋁分別在中性、微酸、酸性情況下對斑馬魚幼魚運動能力的影響，說明酸度值與鋁離子之間存在交互作用，pH值降低可以增加鋁離子對斑馬魚幼魚的毒性效應(yīng)。雖然關(guān)于斑馬魚及其他魚類的神經(jīng)回路還不十分清楚，但是可以通過大量的行為模型來檢測其學(xué)習(xí)記憶能力，比如斑馬魚T迷宮是通過食物刺激來檢測斑馬魚成魚學(xué)習(xí)記憶能力[25-26]，也有學(xué)者通過建立應(yīng)急回避條件模型即電擊與斑馬魚趨暗性等條件和非條件刺激結(jié)合起來，檢測斑馬魚幼魚學(xué)習(xí)記憶能力[27]。但是，這類實驗操作起來復(fù)雜，電流不易控制，容易對斑馬魚幼魚造成器質(zhì)性損傷，不能很好地檢測其學(xué)習(xí)記憶能力。有研究表明，7 dpf的斑馬魚幼魚對單一的刺激過程具有學(xué)習(xí)記憶能力[28]。本次實驗根據(jù)斑馬魚幼魚在黑暗環(huán)境下突然給予強光刺激，斑馬魚幼魚會出現(xiàn)驚恐反射同時速度突然下降。如此反復(fù)，速度會下降到一個最低點后保持不變，我們將這個最低的速度稱為平臺速度。分析其達到平臺速度的刺激次數(shù)后，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？赡苁嵌啻螐姽獯碳ひ院?，斑馬魚幼魚產(chǎn)生了學(xué)習(xí)記憶能力，再次給于強光刺激后速度也不會發(fā)生變化，可以將此實驗做為斑馬魚幼魚的一個學(xué)習(xí)記憶模型。

本次實驗結(jié)果提示，三氯化鋁在微酸和酸性環(huán)境下，能導(dǎo)致斑馬魚幼魚運動能力及學(xué)習(xí)記憶能力下降，并且酸度值越小，對斑馬魚幼魚運動和學(xué)習(xí)記憶的影響更顯著。酸度值與三氯化鋁之間存在協(xié)同作用，酸性環(huán)境可以使三氯化鋁毒性增加。接下來研究中，我們將不斷探尋檢測斑馬魚幼魚學(xué)習(xí)記憶更加簡便合適的模型，并且使用斑馬魚作為模式動物，更加深入地研究鋁的神經(jīng)毒性及其作用機制。