5 類致瀉性大腸埃希氏菌多重熒光PCR檢測方法的建立

胡安妥，王 娉，張彩霞,3，蔡 陽,4，陳 穎,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心，北京 100176；2.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023；3.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430070；4.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林 長春 130062）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常被稱為大腸桿菌，為人和動物腸道中的正常棲居菌。在相當長的一段時間內(nèi)，大腸桿菌被認為是非致病菌[1-2]。直到20世紀中期，人們才認識到一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物具有病原性[3]。通常將能引起腹瀉癥狀的特殊血清型的大腸埃希氏菌稱為致瀉性大腸埃希氏菌（diarrheagenic E. coli，DEC）。根據(jù)其流行病學特征、發(fā)病機制及臨床特征等，可將致瀉性大腸埃希氏菌分為腸致病性大腸埃希氏菌（enteropathogenic E. coli，EPEC）、腸出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagic E. coli，EHEC）、腸產(chǎn)毒大腸埃希氏菌（enterotoxigenic E. coli，ETEC）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasive E. coli，EIEC）、腸聚集性大腸埃希氏菌（enteroaggregative E. coli，EAEC）以及彌散黏附性大腸桿菌（diffuse adherent E. coli，DAEC）[4-5]。

致瀉大腸埃希氏菌所產(chǎn)生的致病物質(zhì)主要包括定居因子、黏附素、外毒素以及腸毒素等[6-7]，不同類型的致瀉大腸埃希氏菌的侵襲部位以及產(chǎn)生的致病物質(zhì)均有差別，可經(jīng)食物和飲用水在人群中廣泛傳播，造成嚴重疫情[8-9]。對致瀉大腸埃希氏菌檢測與甄別方法為選擇性分離、生化鑒定、血清學鑒定等[10]，實驗周期較長，且一般實驗室很難擁有完備的大腸桿菌診斷血清。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術由于其靈敏度高、可靠性強等優(yōu)點被廣泛應用于病原體的檢測，目前已有研究采用單重PCR、多重PCR以及實時熒光PCR等技術對致瀉大腸埃希氏菌進行檢測，以達到檢測其毒力基因、不同DEC致病型別區(qū)分以及DEC同其他食源性致病菌區(qū)分的目的。因熒光PCR技術同時具有自動化程度高、可同時進行多重反應，具有實時性和準確性等優(yōu)點，利用該技術進行病原體的檢測成為研究熱點之一。本研究以5 種致瀉大腸埃希氏菌為研究對象，對同一樣本采用A、B 2 個熒光PCR反應體系鑒別EPEC、EHEC、EIEC、ETEC以及EAEC 5種致瀉大腸埃希氏菌，可為致瀉大腸埃希氏菌區(qū)分和鑒別提供參考，也對該菌的控制預防及流行監(jiān)控有著十分重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實驗菌株共計143 株，其中包括非致瀉大腸桿菌71 株、EPEC 7 株、EHEC 8 株、EIEC 6 株、ETEC 2 株、EAEC 11 株、DAEC 2 株、沙門菌6 株、克羅諾桿菌6 株、蠟樣桿菌6 株、單核細胞性李斯特菌6 株、金黃色葡萄球菌6 株、志賀菌6 株，均為本實驗室保存。

1.1.2 引物及探針

根據(jù)GenBank上查找的各毒力基因的序列設計引物及探針。引物及探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，信息見表1。

1.1.3 試劑

Ex Taq酶、10×buffer、dNTPs、pMD19-T vector載體寶生物工程（大連）有限公司；TOP10大腸桿菌感受態(tài)細胞 天根生化科技北京（有限）公司；質(zhì)粒小提試劑盒、氨芐西林 生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒 美國Promega公司；X-gal及IPTG美國Bio-Rad公司；Master Mix buffer 美國Applied Biosystems公司；LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

5804R離心機 德國Rppendorf公司；Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度PCR儀、7500 fast real-time PCR system實時定量PCR儀 美國ABI公司；DYY-6C電泳儀北京六一儀器廠；4000MP 凝膠成像儀 德國Gene Genius公司；DU640核酸蛋白分析儀 德國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒的制備

參考王娉等[16]的方法，制備eae、stx1、stx2、ipaH、estla、estlb、elt、uidA、aggR、astA 11 組基因的重組質(zhì)粒，并調(diào)整各重組質(zhì)粒質(zhì)量濃度至20 μg/mL。

1.3.2 單重實時熒光PCR擴增

分別以11 組基因的重組質(zhì)粒為模板，進行實時熒光PCR擴增，驗證eae、stx1、stx2、ipah、estla、estlb、elt、uidA、aggR、astA等基因探針及引物有效性。PCR反應體系和條件如下：Master Mix Buffer 12.5 μL、上下游引物各1 μL、探針0.5 μL、模板2 μL，ddH2O補足至25 μL。50 ℃預熱2 min，95 ℃預變性10 min；然后40 個循環(huán)為95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min。

1.3.3 多重實時熒光PCR方法的建立

本研究共采用A、B 2 個PCR反應體系，分別對5 種致瀉埃希氏菌進行檢測，A體系可用于EPEC、EHEC、EIEC檢測和大腸埃希氏菌種屬鑒定，B體系可用于ETEC和EAEC檢測。致病型別的判定標準如表2所示。

表2 5 類致瀉埃希氏菌致病型別的判定標準Table 2 Criteria for determination of 5 pathogenic types of DEC

A、B 2 個反應體系采用25 μL擴增體系，A反應擴增使用的DNA模板為eae、stx1、stx2、uidA、ipaH 5 個構(gòu)建好的重組質(zhì)粒DNA按體積比1∶1∶1∶1∶1混合；B反應擴增使用的DNA模板為estla、estlb、aggR、pic、elt、astA 6 個構(gòu)建好的重組質(zhì)粒DNA按體積比1∶1∶1∶1∶1∶1混合。固定探針與引物體積比為1∶2，探針5 個梯度濃度設置為0.01、0.04、0.08、0.12、0.15 μmol/L，通過正交試驗篩選引物、探針的可行濃度配比，在正交試驗結(jié)果基礎上進行體系的微調(diào)，確定探針及引物濃度的最優(yōu)組合，并以優(yōu)化好的反應體系摸索多重熒光PCR的最佳反應條件。

1.3.4 靈敏度檢測

將A、B體系中使用的混合模板用10 倍倍比稀釋法稀釋，使用優(yōu)化好的反應體系及條件，分別進行實時熒光PCR擴增，樣品Ct值小于等于30為陽性，判定為可以檢出，Ct值大于35為陰性，判定為不可檢出，Ct值介于30～35之間為可疑樣本，重復實驗，Ct值仍小于35，且曲線有明顯的對數(shù)增長期，則判定為可以檢出，否則判定為不可檢出[17-18]。

1.3.5 特異性檢測

煮沸法提取金黃色葡萄球菌、志賀菌、沙門菌、單核細胞性李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、克羅諾桿菌6 種常見食源性致病菌基因組DNA，調(diào)整質(zhì)量濃度至20 μg/mL，采用25 μL擴增體系，含DNA模板2 μL，進行各菌種特異性基因驗證[19-20]及本研究中11 組基因的單重熒光PCR驗證，以保證DNA模板質(zhì)量，并排除檢測結(jié)果假陰性可能，之后使用本研究建立的實時熒光PCR方法進行擴增，驗證該方法的特異性。

1.3.6 分離菌株的檢測

將本室保存的107 株大腸埃希氏菌用作待檢菌株，使用本研究建立的實時熒光PCR方法進行擴增，評價該方法的準確性及適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重實時熒光PCR驗證結(jié)果

分別以獲得的11 組基因的重組質(zhì)粒DNA為模板，在單重實時熒光反應體系及條件下擴增相應的目的基因，11 組基因均能被相應探針和引物特異性擴增出具有明顯對數(shù)增長期的S型曲線，擴增熒光值在100 000～1 750 000之間。

2.2 多重實時熒光PCR體系及條件優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化多重實時熒光PCR反應各引物及探針濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等參數(shù)后，最終確定體系組成如表3所示。

PCR反應參數(shù)為：50 ℃加熱2 min，95 ℃預變性10 min，循環(huán)95 ℃變性15 s，適溫退火1 min，共40 個循環(huán)。如圖1所示，A體系可用于檢測eae、stx1、stx2、uidA、ipaH基因，B體系可用于檢測estla、estlb、aggR、pic、elt、astA基因。

表3 多重熒光PCR體系組成Table 3 Components of multiplex real-time PCR systems

圖1 最優(yōu)體系及反應條件下A、B反應體系熒光PCR擴增結(jié)果Fig. 1 Real-time PCR amplification results with systems A and B under optimal reaction system and conditions

2.3 靈敏度檢測結(jié)果

A體系所用混合模板中單個質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度為4 μg/mL，通過計算得出質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)濃度為1.32×1012copies/mL，10 倍倍比稀釋后，使得質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度達到4×10-1～4×10-9μg/mL（對應質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)濃度為1.32×1011～1.32×103copies/mL）；B體系所用混合模板中單個質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度為3.3 μg/mL，通過計算得出質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)濃度為1.1×1012copies/mL，10 倍倍比稀釋后，使得質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度達到3.3×10-1～3.3×10-9μg/mL（對應質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)濃度為1.1×1011～1.1×103copies/mL）。A體系中當質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度達到4×10-6μg/mL（對應質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)濃度為1.32×106copies/mL）時，重復實驗，曲線并無明顯的對數(shù)增長期，判定為不能檢出，當質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度達到4×10-5μg/mL（對應質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)濃度為1.32×107copies/mL）時，重復實驗，擴增曲線有明顯的對數(shù)增長期，判定為可以檢出（圖2A）；B體系中當質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度達到3.3×10-6μg/mL（對應質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)濃度為1.1×106copies/mL）時重復實驗，曲線并無明顯的對數(shù)增長期，判定為不能檢出，當質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度達到3.3×10-5μg/mL（對應質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)濃度為1.1×107copies/mL）時，重復實驗，擴增曲線有明顯的對數(shù)增長期，判定為可以檢出（圖2B）。每個實時熒光PCR反應體系中模板加入量為2 μL，則A體系每個反應管中的拷貝數(shù)為2.6×104，提示每個反應管中有2.6×104個拷貝的目的基因時即可被檢出；B體系每個反應管中的拷貝數(shù)為2.2×104，提示每個反應管中有2.2×104個拷貝的目的基因時即可被檢出。

圖2 最佳體系及條件下A體系和B體系各質(zhì)粒DNA系列稀釋擴增曲線Fig. 2 Amplification curves of plasmid DNA in systems A and B under optimal reaction system and conditions

2.4 特異性檢測結(jié)果

表4 特異性檢測結(jié)果Table 4 Results of specificity test

如表4所示，6 種常見食源性致病菌各自特異性基因檢測結(jié)果均為陽性，且用建立的多重實時熒光PCR方法對6 種常見食源性致病菌進行檢測，檢測結(jié)果為金黃色葡萄球菌、沙門菌、單核細胞性李斯特菌、克羅諾桿菌以及蠟樣芽孢桿菌在A、B體系中均無擴增曲線，志賀菌在A體系中擴增出ipaH基因曲線，B體系中無擴增曲線，與11 種基因的單重熒光PCR檢測結(jié)果一致，可保證檢測結(jié)果不是假陰性。

2.5 分離菌株檢測結(jié)果

表5 107 株分離菌株熒光PCR檢測結(jié)果Table 5 Real-time PCR detection of 107 isolated strains

用建立的多重實時熒光PCR方法對本實驗室保存的107 株大腸埃希氏菌進行檢測，如表5所示。7 株EPEC菌株均在A體系中擴增出uidA以及eae基因曲線，B體系中無擴增曲線，菌株判定結(jié)果均為EPEC；8 株EHEC菌株均在A體系中擴增出stx1+stx2、eae以及uidA基因曲線，菌株判定結(jié)果均為EHEC；6 株EIEC菌株均在A體系中擴增出uidA以及ipaH基因曲線，B體系中無擴增曲線，菌株判定結(jié)果均為EIEC；2 株ETEC菌株在A體系中擴增出uidA基因曲線，在B體系中擴增出astA、elt以及estla+estlb基因曲線，菌株判定結(jié)果為ETEC；11 株EAEC菌株被分為2 種基因型，9 株菌株在A體系中擴增出uidA基因曲線，在B體系中擴增出astA基因曲線，2 株菌株在A體系中擴增出uidA基因曲線，在B體系中擴增出astA以及aggR+pic基因曲線，菌株判定結(jié)果均為EAEC。71 株非致瀉大腸埃希氏菌在A體系中擴增出uidA基因曲線，在B體系中無擴增曲線，菌株判定結(jié)果均為大腸埃希氏菌（表5）。107 株菌株的熒光PCR判定結(jié)果與庫內(nèi)菌株血清型信息一致，與本室前期進行的單重PCR檢測結(jié)果也完全一致，與此相比，熒光PCR方法在判定其致病型別上效率較高。

3 討論與結(jié)論

致瀉大腸埃希氏菌傳統(tǒng)的檢測方法如分離培養(yǎng)、生化鑒定以及血清學鑒定等，耗時耗力，而且不能有效地區(qū)分致瀉大腸埃希氏菌和非致瀉大腸埃希氏菌，因此，在傳統(tǒng)的檢測方法基礎上，有必要進行大腸埃希菌的毒力基因檢測，以避免漏檢及提高其檢出率[21]。

目前已有利用PCR技術檢測毒力基因達到區(qū)分大腸埃希氏菌致病型別的相關研究，其研究方法一般為單重普通PCR、多重普通PCR以及多重熒光PCR。單重PCR方法通過檢測大腸埃希氏菌中保守基因片段，雖特異性強、穩(wěn)定性好，但只針對某類菌的檢測和鑒定，無法區(qū)分不同致病型別的大腸埃希氏菌。多重普通PCR方法多用于某一類或幾類致瀉大腸埃希氏菌的鑒定和檢測，以及不同致病型別致瀉大腸埃希氏菌的區(qū)分，王濤等[22]使用多重PCR方法檢測腸出血性大腸埃希菌O157:H7，確立了stx1、stx2、eaeA和hlyA 4 組毒力基因為篩查基因，檢測靈敏度達到1.33×104CFU/μL，但不能覆蓋所有致病型別大腸埃希氏菌的檢測；趙愛蘭等[23]使用多重PCR方法鑒定5 類致瀉性大腸埃希菌和志賀菌，確立8 組基因為篩查基因建立了多重PCR方法，達到了致瀉大腸埃希氏菌的檢測和鑒定的目的，但普通PCR擴增結(jié)果需進行凝膠電泳進行檢測，較為費時費力。多重實時熒光PCR方法目前則多用于大腸埃希氏菌同沙門菌、志賀菌等的區(qū)分或某類大腸埃希氏菌的鑒定，如金玉娟等[24]利用多重實時熒光PCR方法檢測3 種致瀉性大腸埃希菌和志賀菌，同樣不能覆蓋所有致病型別致瀉埃希氏菌的檢測。本研究選取5 種致瀉大腸埃希氏菌11 組基因為靶基因設計引物和探針，建立多重實時熒光PCR方法，用于5 種致瀉埃希氏菌的檢測和致病型別的判定，對每種致瀉大腸埃希氏菌采用2～4重熒光PCR檢測，判定其致病性別，較之上述方法，該法具有更高的針對性、檢測準確度以及區(qū)分力，且操作簡便，省時省力，整個檢測可在2 h內(nèi)完成。

使用本方法進行大腸埃希氏菌檢測時，有幾類情況需要注意，有研究顯示只有95%大腸埃希氏菌可檢出uidA基因，存在不能檢出的個例[25]；另外，毒力基因可在細菌間轉(zhuǎn)移，實際檢測過程中可能存在一株菌中同時含有源自不同致病型別大腸埃希氏菌毒力基因的可能性。本研究在進行ETEC菌株的檢測過程中，擴增出estla+estlb、uidA以及elt基因的同時，還擴增出了astA基因，有文獻報道astA基因可在細菌間轉(zhuǎn)移[26]，當與其他毒力基因檢測結(jié)果同時陽性時，則astA基因不作為型別判定依據(jù)。此外，由于EIEC菌株和志賀菌所引起的臨床腹瀉癥狀十分相似，且在實際檢測中也發(fā)現(xiàn)EIEC菌株和志賀菌均可檢出ipaH基因[27-29]，uidA基因為大腸埃希氏菌特異性基因[30]，EIEC可檢出而志賀菌不能檢出，所以本研究采用uidA基因及ipaH基因共同檢測EIEC，可根據(jù)檢測結(jié)果區(qū)分EIEC與志賀菌[31]。

綜上所訴，本研究建立致瀉大腸埃希氏菌多重熒光PCR檢測方法，采用2 個體系對5 類致瀉大腸埃希氏菌進行檢測和鑒定，檢測靈敏度可達到2.2×104～2.6×104copies/反應，34 株致瀉埃希氏菌菌株和71 株非致瀉埃希氏菌菌株驗證結(jié)果同本實驗室單重普通PCR驗證結(jié)果基本相同，說明該方法具有較高的準確度，實驗過程中對致瀉大腸埃希氏菌和其他食源性致病菌進行檢測，只有致瀉大腸埃希氏菌與志賀菌能夠產(chǎn)生擴增曲線，而其他食源性致病菌不能產(chǎn)生擴增曲線，說明該方法具有較好的特異性，可為食品生產(chǎn)銷售或質(zhì)量監(jiān)控過程中的快速檢測和大批量檢測提供技術手段。