桑黃素對子宮內(nèi)膜癌AN3-CA細(xì)胞凋亡和侵襲的影響

陳良鳳，王 建， 王雪梅

子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤，全世界范圍內(nèi)每年約有74 000人死于該病[1-2]。Bokhman[3]將子宮內(nèi)膜癌分為I型和II型：I型是雌激素相關(guān)的子宮內(nèi)膜癌，與肥胖癥及子宮內(nèi)膜增生相關(guān)，預(yù)后較好；II型是雌激素非依賴性的非子宮內(nèi)膜癌(主要為漿液性和透明細(xì)胞癌)，與萎縮性子宮內(nèi)膜相關(guān)，預(yù)后較差。盡管多數(shù)子宮內(nèi)膜癌分級低、分期早，預(yù)后可；但高級別和晚期的子宮內(nèi)膜癌病死率高且預(yù)后差[4]。目前子宮內(nèi)膜癌主要采取手術(shù)聯(lián)合放化療治療，患者的耐受性及預(yù)后不理想[5]，故非傳統(tǒng)藥物治療正成為治療無反應(yīng)或不愿意接受標(biāo)準(zhǔn)藥物治療的子宮內(nèi)膜癌患者候選方式。

桑黃素是從姜黃植物根中提取的一類具有廣泛抗癌作用潛力的藥劑，因其有抗炎和化療的特性且毒性小，廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療[6-7]。研究證實，桑黃素能選擇性作用于癌細(xì)胞而不損傷正常細(xì)胞[8]，其抑制腫瘤的潛在機制可能與抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成及癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡有關(guān)[9]。桑黃素及其類似物對多種腫瘤模型包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[10]、結(jié)腸直腸癌[11]、肺癌[12]、卵巢癌[13]、乳腺癌[14]和口腔癌[15]等均有抑制作用，但對子宮內(nèi)膜癌的作用少有報道。本研究擬探討桑黃素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞惡性行為的影響及相關(guān)作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗細(xì)胞系和試劑：子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3-CA由上海細(xì)胞生物研究所提供。細(xì)胞在含有10%胎牛血清(FBS)，100 mg/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至80%左右濃度時進行傳代、凍存和后續(xù)的實驗。RPMI-1640培養(yǎng)液、10% 新生小牛血清、含100 u/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素、0.25% 胰酶溶液購自Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO) 購自Sigma公司。MMP-2、MMP-9及GAPDH一抗購自abcam公司，二抗購自武漢三鷹公司。

1.1.2實驗藥物和試劑：桑黃素購自Sigma公司。將桑黃素溶解于DMSO，濃度分別設(shè)定為0、10、20、40 μmol/L。Annexin V-FITC /PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海美季生物技術(shù)有限公司。CCK-8試劑盒購自百賽克生物技術(shù)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞活性的測定：使用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞的活性。將AN3-CA細(xì)胞接種在96孔板中，每孔1×104個細(xì)胞和100 μl培養(yǎng)基。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。更換新培養(yǎng)基。細(xì)胞用分別以0、10、20、40 μmol/L濃度的桑黃素處理24 h和48 h。處理后，將96孔板中的培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基替換。然后加入20 μl的CCK-8溶液，并在37℃下孵育4 h。使用酶標(biāo)儀板在450 nm波長下測量不同組的OD值。實驗重復(fù)3次。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡：流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染色被認(rèn)為是理想的定量測定細(xì)胞凋亡的方法。將AN3-CA細(xì)胞以2×106的密度接種在6孔板中細(xì)胞/孔并生長24 h。然后用不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的桑黃素處理24 h。加入100 μl細(xì)胞懸液5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI，并將細(xì)胞在黑暗中孵育30 min。 PI(5 μl，濃度為10 μg/ml)加入細(xì)胞，在黑暗中再次孵育10 min。實驗重復(fù)3次。

1.2.3Transwell侵襲實驗：通過Transwell對AN3-CA細(xì)胞侵襲能力測定。將AN3-CA細(xì)胞在含有0.1%FBS的DMEM中培養(yǎng)24 h后，將在無血清的DMEM中的2×105個饑餓細(xì)胞用含有基質(zhì)膠的小室(直徑6.5 μmol/L，孔徑為8 μm，Corning，NY，USA)接種在上室中，將具有10%FBS的培養(yǎng)基置于下腔中。在37℃下孵育24 h后，小心地去除上膜表面上的細(xì)胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈過后，于倒置顯微鏡下計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.4蛋白免疫印跡檢測：根據(jù)蛋白相對分子質(zhì)量大小，配制凝膠，根據(jù)所測蛋白濃度適量加入蛋白樣品及每孔5 μl的蛋白marker。跑膠，首先加壓80 V，保證所有樣品在同一水平線，待樣品至分離膠處，將電壓加到120 V。切膠，根據(jù)所需條帶大小，對照蛋白Marker進行切膠，并準(zhǔn)備與所切膠條相同大小濾紙2片和PVDF膜(浸泡甲醇15 s)。按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序按序排好，并趕出氣泡，壓緊，在250 mA恒流下，按1 kD蛋白1 min進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PBST洗膜1次，并放入脫脂奶粉中封閉1 h;一抗，PBST洗膜1次，將膜浸入稀釋好的一抗中，4 ℃過夜；二抗，PBST洗膜3次，將膜浸入稀釋好的二抗中，常溫下孵育1 h；顯影，PBST洗膜3次后，在暗室中曝光并分析。

2 結(jié)果

2.1不同濃度桑黃素對子宮內(nèi)膜癌AN3-CA細(xì)胞活性的比較 與對照組比較，當(dāng)桑黃素作用24 h時，細(xì)胞活性分別為100.0%、(71.3±4.2)%、(62.9±3.7)%、(57.5±7.8)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.62，P<0.05)；當(dāng)桑黃素作48 h時，細(xì)胞活性分別為100.0%、(31.0±6.3)%、(26.1±2.7)%、(18.6±4.4)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=257.5，P<0.05)。AN3-CA的細(xì)胞活性以時間和劑量依賴性方式減少。見圖1。

2.2不同濃度桑黃素對子宮內(nèi)膜癌AN3-CA細(xì)胞凋亡的比較 當(dāng)桑黃素作用濃度分別為0、10、20、40 μmol/L時，細(xì)胞的凋亡率分別為[(3.9±0.3)%、(9.6±1.0)%、(16.2±0.8)%、(25.8±3.2)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=88.68,P<0.05)。AN3-CA細(xì)胞的凋亡率以劑量依賴性方式增加，藥物濃度越高，細(xì)胞的凋亡率越高。見圖2。

2.3不同濃度桑黃素對子宮內(nèi)膜癌AN3-CA細(xì)胞侵襲的比較 以0、10、20、40 μmol/L濃度的桑黃素處理AN3-CA細(xì)胞48 h后，穿過的細(xì)胞數(shù)量分別為(78.2±7.3)、(59.3±6.5)、(58.7±10.8)、(35.0±5.2)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.7,P<0.05)，盡管在10、20 μmol/L桑黃素濃度作用細(xì)胞時的侵襲細(xì)胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但40 μmol/L時，侵襲細(xì)胞數(shù)量少于其他濃度組。AN3-CA細(xì)胞的侵襲能力以劑量依賴性方式減少，藥物濃度越高，細(xì)胞侵襲能力越弱。見圖3。

2.4不同濃度桑黃素對子宮內(nèi)膜癌AN3-CA細(xì)胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)MMP-2和MMP-9的比較 不同濃度桑黃素作用后MMP-2的相對表達量分別為1.00、0.73±0.05、0.53±0.12、0.25±0.06，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.21，P<0.05)和MMP-9的相對表達量分別為1.00、0.81±0.06、0.48±0.08、0.32±0.12，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=35.09,P<0.05)。在使用桑黃素時MMP-2和MMP-9的表達顯著降低，且呈劑量依賴性方式減少。見圖4。

圖1不同濃度桑黃素對子宮內(nèi)膜癌AN3-CA細(xì)胞活性的影響

圖2不同濃度桑黃素對子宮內(nèi)膜癌AN3-CA細(xì)胞凋亡的影響

圖3 不同濃度桑黃素對子宮內(nèi)膜癌AN3-CA細(xì)胞侵襲的影響

圖4不同濃度桑黃素影響子宮內(nèi)膜癌AN3-CA細(xì)胞表達MMP-2和MMP-9蛋白的影響

3 討論

近年來，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率增高[16]，且其對化療藥物的耐藥性升高，故降低該類患者的病死率及尋找新的治療方式十分重要。目前越來越多的學(xué)者將研究重點放在天然產(chǎn)物中提取出的抗腫瘤活性化合物上。桑黃素已被報道顯示等如抗氧化劑、抗炎和抗癌能力多種生物學(xué)作用[7]。據(jù)報道黃酮類化合物與傳統(tǒng)放化療治療相比，對癌癥的控制效果更明顯[17]。Chun等[18]發(fā)現(xiàn)桑黃素與端粒酶抑制劑MST-312聯(lián)用可改善癌癥預(yù)后。Gupta等[19]認(rèn)為桑黃素通過抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3，可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長。文獻報道，桑黃素可通過直接下調(diào)肺癌細(xì)胞系中miR-135b的表達發(fā)揮抗腫瘤功能[20]。本研究通過CCK-8檢測不同濃度桑黃素作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系A(chǔ)N3-CA，結(jié)果顯示,隨著桑黃素濃度增加，AN3-CA細(xì)胞活性明顯受抑制且隨時間延長抑制作用加強；為進一步探尋桑黃素對AN3-CA細(xì)胞凋亡及侵襲的影響，本研究分別使用流式染色及Transwell實驗對桑黃素作用后的AN3-CA進行評估，發(fā)現(xiàn)桑黃素作用后AN3-CA細(xì)胞凋亡明顯增加，遷移能力明顯減弱；均提示桑黃素對子宮內(nèi)膜癌存在抑制作用。

MMP-2和MMP-9在癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基膜Ⅳ型膠原降解中發(fā)揮重要作用[21]。MMP-9的過度表達可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、遷移，桑黃素能作用于MMP-2和MMP-9，使其表達顯著降低[22]，可能是其抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和及侵襲的關(guān)鍵，而桑黃素是否能通過抑制MMP-2和MMP-9表達有效抑制子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移及侵襲尚未可知。本研究結(jié)果顯示，在使用桑黃素后，MMP-2和MMP-9的表達顯著降低，且隨著濃度劑量的升高抑制效應(yīng)越顯著。說明桑黃素可能通過下調(diào)MMP-9或MMP-2表達來抑制AN3-CA細(xì)胞遷移和侵襲。

綜上所述，桑黃素可明顯抑制子宮內(nèi)膜癌AN3-CA細(xì)胞活性、遷移，并可促進其凋亡，機制可能是通過調(diào)節(jié)MMP-2及MMP-9的表達來實現(xiàn)。本研究將繼續(xù)進行桑黃素作用于臨床子宮內(nèi)膜癌樣本、動物模型及潛在機制的研究，為子宮內(nèi)膜癌新治療方式提供有效證據(jù)。