白細(xì)胞介素-6對(duì)人卵巢癌細(xì)胞中雌激素受體亞型的調(diào)控作用

張桐碩，馬曉霞，宋姜楠，李艷秋，楊 靜，王 越

卵巢癌的病死率位居?jì)D科腫瘤之首，雌激素被公認(rèn)為是卵巢癌的致病因素之一，雌激素的作用與雌激素受體(ER)不同類型的表達(dá)比例有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典ER包括雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ)兩大類亞型，同屬于核受體超家族。臨床上以他莫西芬(TAM)為代表性的抗雌激素藥物對(duì)卵巢癌的預(yù)后改善效果有限，多達(dá)50%的ERα陽(yáng)性卵巢癌始終對(duì)TAM不敏感，成為該病輔助性激素治療的一大挑戰(zhàn)。多項(xiàng)研究提示，ERα和ERβ的表達(dá)比率可能是影響惡性婦科腫瘤內(nèi)分泌治療效果的重要因素[1-2]，但卵巢癌ER亞型的上游調(diào)控機(jī)制及調(diào)控因子尚不清楚。白細(xì)胞介素-6(IL-6)是卵巢癌炎性分泌網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因子，在卵巢癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用[3]。臨床資料顯示，卵巢癌患者IL-6的高表達(dá)與內(nèi)分泌治療敏感性差密切相關(guān)。我們推測(cè)IL-6誘導(dǎo)卵巢癌內(nèi)分泌治療抵抗的一種潛在機(jī)制是調(diào)控ER亞型的表達(dá)水平。本研究借助生物信息學(xué)手段初步分析卵巢癌臨床樣本中IL-6與ER亞型在轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性，通過體外實(shí)驗(yàn)證明IL-6對(duì)卵巢癌細(xì)胞ER亞型表達(dá)的影響，探討IL-6、ER與卵巢癌耐藥的關(guān)系，期待對(duì)卵巢癌的預(yù)后評(píng)價(jià)和逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌治療耐藥有所幫助?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與材料 人卵巢腺癌A2780細(xì)胞和人乳突狀卵巢腺癌CAOV-3 細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，本實(shí)驗(yàn)室保存。重組人IL-6購(gòu)自美國(guó)R&D公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。胎牛血清購(gòu)自新西蘭BioInternational公司。TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen產(chǎn)品。RNA逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自北京康維世紀(jì)生物科技公司。2×Premix Taq由大連寶生物公司提供。100 bp DNA Marker購(gòu)自北京天根生化科技公司。BCA 蛋白定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。全蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)公司?？笶Rα單克隆抗體、抗ERβ單克隆抗體購(gòu)自加拿大Millipore公司。抗β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó) KPL 公司。

1.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定與分組 本課題組前期工作證實(shí)，對(duì)TAM治療敏感的A2780細(xì)胞不分泌IL-6但表達(dá)其受體，對(duì)TAM耐藥的CAOV-3細(xì)胞高表達(dá)IL-6及其受體，因此選取這兩種細(xì)胞模型來(lái)研究 IL-6誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)分泌藥物耐藥機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室前期已通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒法成功構(gòu)建出IL-6過表達(dá)或抑制表達(dá)卵巢癌細(xì)胞模型，用ELISA法分別鑒定出IL-6低、中、高分泌水平的3個(gè)A2780細(xì)胞克隆和IL-6中、高抑制分泌的2個(gè)CAOV-3細(xì)胞克隆。同時(shí)將轉(zhuǎn)染空載體的A2780和CAOV-3細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1癌癥基因圖譜(TCGA)探索卵巢癌的基因相關(guān)性：利用cbioportal 在線軟件(http://www.cbioportal.org/) 收集TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢癌樣本的mRNA表達(dá)(來(lái)源于microarray)及其匹配的生存狀態(tài)。數(shù)據(jù)預(yù)處理后保留上述資料完整的535例卵巢癌。分別將樣本的IL-6表達(dá)與ERα/ERβ表達(dá)比率由低到高排序，以中位數(shù)劃分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，比較2組的無(wú)進(jìn)展生存期。再分析樣本總體的IL-6與ERα、ERβ基因的相關(guān)性。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及 IL-6 預(yù)處理：分別采用濃度為5、25、50 ng/ml的IL-6連續(xù)處理A2780 細(xì)胞10 d，期間每2 d 更換1次新鮮的培養(yǎng)液并加入相同濃度的IL-6。上述細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的IL-6過表達(dá)的A2780和IL-6抑制表達(dá)的CAOV-3細(xì)胞株均用含有100 ml/L胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3.3RNA提取及RT-PCR法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞ER亞型mRNA的表達(dá)：抽提RNA按TRIzol試劑說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系：cDNA 1.0 μl，2×Premix Taq 10 μl，上、下游引物各10 pmol，加雙蒸水至總體積20 μl。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 5 min預(yù)變性；94℃ 30 s變性，59℃ 45 s退火，72℃ 1 min 延伸，34 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10min。檢測(cè)所用引物見表1。待PCR反應(yīng)結(jié)束，取產(chǎn)物5μl于12 g/L瓊脂糖凝膠中電泳。結(jié)果利用Image J軟件進(jìn)行分析，以目的基因與內(nèi)參的灰度比值作為mRNA的相對(duì)表達(dá)豐度。

1.3.4Western blot 法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞ER亞型蛋白的表達(dá)：取經(jīng)不同處理的A2780 細(xì)胞或CAOV3細(xì)胞，以RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度后，在蛋白上清中加入loading buffer煮沸變性。將40 μg/孔的蛋白加入12% SDS-PAGE膠電泳分離。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF濾膜，濾膜用5%脫脂牛奶封閉室溫 1 h后，加入特異性一抗，4℃孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。漂洗后化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。以目的蛋白與內(nèi)參的灰度比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)豐度。

表1 反轉(zhuǎn)錄聚合鏈反應(yīng)引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)?；虮磉_(dá)量的相關(guān)性研究采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，Kaplan-Meier生存分析采用Log-rank檢驗(yàn)。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1IL-6和ER亞型基因在卵巢癌樣本的分布及與臨床預(yù)后的關(guān)系 分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的535例卵巢癌標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)IL-6者無(wú)進(jìn)展生存率低于低表達(dá)者(P<0.05)。見圖1A。同時(shí)，高ERα/ERβ表達(dá)比率者3年無(wú)進(jìn)展生存率低于低表達(dá)比率者(P<0.05)。見圖1B。相關(guān)性分析顯示，IL-6基因與ERα基因呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，見圖2A。而與ERβ基因呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。見圖2B。

圖1 卵巢癌樣本中不同表達(dá)水平IL-6和ERα/ERβ比率的3年無(wú)進(jìn)展生存期曲線圖

圖2 卵巢癌中IL-6基因與ERα、ERβ基因的相關(guān)性

2.2從外源性和內(nèi)源性過表達(dá)2種途徑比較IL-6對(duì)ER亞型的作用 用外源性IL-6處理A2780 細(xì)胞后能明顯上調(diào)ERα基因和蛋白的表達(dá)，同時(shí)能明顯下調(diào)ERβ基因和蛋白的表達(dá)，且IL-6對(duì)ERα的上調(diào)和ERβ的下調(diào)作用均呈劑量依賴性。見圖3。與A2780細(xì)胞空白處理組和空載體轉(zhuǎn)染組比較，內(nèi)源性過表達(dá) IL-6的A2780細(xì)胞中ERα基因和蛋白的表達(dá)明顯提高，同時(shí)ERβ基因和蛋白的表達(dá)明顯降低，且ER亞型的變化程度隨低、中、高3種IL-6過表達(dá)等級(jí)依次增大。見圖4。

圖3外源性過表達(dá)IL-6對(duì)A2780細(xì)胞ERα、ERβ表達(dá)的影響

A: 不同濃度IL-6處理后ERα、ERβ的mRNA表達(dá)水平(RT-PCR)；B: 不同濃度IL-6處理后ERα、ERβ的蛋白表達(dá)水平(Western Blot)

圖4內(nèi)源性過表達(dá)IL-6對(duì)A2780細(xì)胞ERα、ERβ表達(dá)的影響

A: 不同濃度IL-6處理后ERα、ERβ的mRNA表達(dá)水平(RT-PCR)；B: 不同濃度IL-6 ERα、ERβ的蛋白表達(dá)水平(Western Blot)

2.3內(nèi)源性抑制IL-6表達(dá)可下調(diào)CAOV-3 細(xì)胞ERα及上調(diào)其ERβ的表達(dá) 與CAOV-3細(xì)胞空白處理組和空載體轉(zhuǎn)染組比較，內(nèi)源性抑制表達(dá)IL-6的CAOV-3細(xì)胞中ERα基因和蛋白的表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)ERβ基因和蛋白的表達(dá)水平明顯提高，且IL-6 高抑制表達(dá)比中抑制表達(dá)的ER亞型變化程度更大。見圖5。

圖5內(nèi)源性抑制表達(dá)IL-6對(duì)CAOV-3細(xì)胞ERα、ERβ表達(dá)的影響

A: 不同IL-6抑制表達(dá)等級(jí)的ERα、ERβ的mRNA表達(dá)水平(RT-PCR)；B: 不同IL-6抑制表達(dá)等級(jí)的ERα、ERβ蛋白表達(dá)水平(Western Blot)

3 討論

流行病學(xué)研究表明，雌激素暴露與卵巢癌發(fā)生的危險(xiǎn)性密切相關(guān)[4]。以拮抗雌激素為手段的內(nèi)分泌療法因其靶點(diǎn)精準(zhǔn)，不良反應(yīng)相對(duì)較少而成為一種具有吸引力的卵巢癌治療方式；該療法的常用藥物主要有選擇性ER調(diào)節(jié)劑TAM及芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑[5]。TAM藥理機(jī)制是競(jìng)爭(zhēng)性地與ER結(jié)合來(lái)阻斷雌激素的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)[6]。TAM防止對(duì)雌激素依賴型乳腺癌的復(fù)發(fā)、病死率的降低效果顯著[7]，但對(duì)卵巢癌的療效欠佳。TAM的耐藥機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。ERα是臨床上預(yù)測(cè)抗雌激素治療敏感性的重要指標(biāo)[8]，目前90%的回顧性研究支持ERβ高表達(dá)能提高抗雌激素療效這一假說[2,9]。ERα與ERβ共同影響內(nèi)分泌治療的療效，因此研究卵巢癌中ER亞型的調(diào)控機(jī)制，對(duì)臨床的預(yù)后及治療意義重大。

正常卵巢組織中ERα、ERβ均有表達(dá)且處于平衡狀態(tài)，當(dāng)卵巢發(fā)生癌變時(shí)，這種平衡將被打破[10]。與乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌相似，ERα被發(fā)現(xiàn)是卵巢癌細(xì)胞增殖的主要促進(jìn)因子，而ERβ則抑制卵巢癌的惡性演變[11]，ERα/ER的表達(dá)比率常隨細(xì)胞癌變而升高，與不良預(yù)后表型之間呈正相關(guān)[12]。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，隨著ERα/ERβ表達(dá)比率升高，卵巢癌患者無(wú)進(jìn)展生存率降低，驗(yàn)證了這一臨床結(jié)論。然而就ERα和ERβ的表達(dá)水平是如何改變卵巢癌對(duì)內(nèi)分泌治療敏感性的研究尚不充分。鑒于乳腺癌與卵巢癌在激素敏感性、激素受體的表達(dá)水平、對(duì)TAM的反應(yīng)模式等方面存在諸多共性，本研究從乳腺癌TAM耐藥的分子機(jī)制獲得啟示。在細(xì)胞漿內(nèi)ER與17-β雌二醇(E2)結(jié)合形成二聚體后，從基因組和非基因兩條途徑發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。首先，在基因組調(diào)節(jié)途徑中，ERα、ERβ入核充當(dāng)了雌激素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因，結(jié)合激活蛋白-1(AP-1)增強(qiáng)子元件從而啟動(dòng)相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄[13]。而在AP1位點(diǎn)，ERα與E2結(jié)合后該位點(diǎn)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性，ERβ正好相反，與E2結(jié)合后使之喪失轉(zhuǎn)錄活性。ER-AP1這一模式逆轉(zhuǎn)了配體的作用，被認(rèn)為是乳腺癌抗雌激素治療耐藥的機(jī)制之一[14]。其次，在非基因組調(diào)節(jié)途徑中，ER能與負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和干擾的蛋白質(zhì)相互作用，進(jìn)而參與到信號(hào)通路的調(diào)節(jié)中[15]。MAPK、Hedgehog、PI3K/Akt和mTOR等信號(hào)通路的失調(diào)是TAM耐藥的一個(gè)重要假說[16]。魏麗等[17]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞MCF-7中ERα和ERβ可分別促進(jìn)和抑制信號(hào)通路PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路的活化，從而增強(qiáng)和降低細(xì)胞對(duì)TAM的耐藥性。

炎癥微環(huán)境是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的重要因素，IL-6作為功能最廣泛的炎性細(xì)胞因子之一，與多種雌激素相關(guān)腫瘤的生長(zhǎng)聯(lián)系顯著，IL-6的高表達(dá)通常預(yù)示著腫瘤患者預(yù)后不佳。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，卵巢癌高表達(dá)IL-6者比低表達(dá)IL-6者的無(wú)進(jìn)展生存率低，與該觀點(diǎn)相符。卵巢癌的不良預(yù)后很大程度上可歸因于原發(fā)性或獲得性耐藥的產(chǎn)生，與鉑類及紫杉醇類等化療耐藥的機(jī)制不同，內(nèi)分泌耐藥的獲得途徑繞不開ER這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[18]，E2能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞分泌IL-6，而ER阻斷劑又可完全抑制該作用，提示雌激素及其受體與IL-6存在著相互間的調(diào)控關(guān)系。本研究首先從TCGA中的大規(guī)模芯片數(shù)據(jù)得知，在卵巢癌中IL-6基因與ERα基因呈正相關(guān)、與ERβ基因呈負(fù)相關(guān)，由此初步推測(cè)，IL-6能上調(diào)ERα并下調(diào)ERβ的表達(dá)。為使結(jié)果更具說服力，本研究挑選了兩種細(xì)胞株并設(shè)置了過表達(dá)IL-6和抑制表達(dá)IL-6兩個(gè)干預(yù)方向，最后從正反兩個(gè)方向證明了IL-6能促進(jìn)ERα并抑制ERβ的表達(dá)，再聯(lián)系ERα和ERβ對(duì)TAM耐藥分別起到的增強(qiáng)和逆轉(zhuǎn)作用，便可解釋IL-6促進(jìn)TAM耐藥的臨床現(xiàn)象。

本研究以ER亞型的表達(dá)水平為研究重點(diǎn)，對(duì)IL-6誘導(dǎo)的內(nèi)分泌治療耐藥機(jī)制進(jìn)行了探索和補(bǔ)充。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上討論的國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)展，我們勾勒出IL-6通過調(diào)控ER亞型表達(dá)誘導(dǎo)TAM耐藥的模式圖，見圖6。

圖6IL-6通過調(diào)控ER亞型表達(dá)誘導(dǎo)TAM耐藥分子機(jī)制

綜上所述，本研究證明了IL-6能促進(jìn)ERα并抑制ERβ的表達(dá)，豐富了對(duì)雌激素、ER與 IL-6 之間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，但其作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。以本研究作為理解IL-6對(duì)ER調(diào)控作用的切入點(diǎn)，一方面可為利用血清IL-6等體液活檢手段預(yù)測(cè)卵巢癌患者對(duì)抗體激素藥物的反應(yīng)、指導(dǎo)個(gè)體化治療方案提供理論依據(jù)；另一方面，提示應(yīng)用包括IL-6抑制劑在內(nèi)的多位點(diǎn)聯(lián)合靶向治療，可能是未來(lái)預(yù)防和逆轉(zhuǎn)卵巢癌內(nèi)分泌治療耐藥的良好策略。