TLR4信號(hào)通路在HBV感染腎小管上皮細(xì)胞自噬調(diào)控中的作用研究

張曉田，金 李，李慧賢，楊世峰，牛 丹，路萬(wàn)虹

腎臟損害是慢性乙肝病毒(HBV)感染最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗原(HBcAg)在腎小球、腎小管及腎小動(dòng)脈血管壁沉積，同時(shí)伴隨腎臟炎癥、系膜增生及腎功能損害等病理征象[1]。我國(guó)慢性HBV感染人群約有1億人，HBV感染及其并發(fā)癥的防治對(duì)提高國(guó)民生活和醫(yī)療水平至關(guān)重要，是一個(gè)亟待解決的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題[2]。目前HBV感染腎損害的病理機(jī)制尚未完全明確，細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞利用溶酶體降解受損細(xì)胞器和大分子蛋白質(zhì)，并將其重新納入能量循環(huán)的過(guò)程。在感染性或炎性疾病中，細(xì)胞自噬是一把雙刃劍，適度的自噬對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要，過(guò)度自噬則可能引起更嚴(yán)重的細(xì)胞死亡和組織損傷[3-4]。本研究設(shè)計(jì)體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察HBV感染過(guò)程中Toll樣受體4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路與腎小管上皮細(xì)胞自噬的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2，購(gòu)自上海名勁生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 TLR4激動(dòng)劑LPS-PG(上?？道噬锟萍加邢薰?，tlrl-ppglps)，TLR4抑制劑TAK-242(杭州聯(lián)科生物，2A-13871-5)；RPMI 1640 培養(yǎng)基(上海浩然生物技術(shù)有限公司，12633-012)；胎牛血清(上海浩然生物技術(shù)有限公司，16000044)；DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，DA1010)；CCK-8試劑盒(北京碧云天，C0038)；細(xì)胞核蛋白與漿蛋白抽泣試劑盒(北京碧云天，P0027)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京碧云天，P0010S)；TLR4、NF-κB、p62、LC-3B、Beclin-1 及β-actin抗體均購(gòu)自Abcam官網(wǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 無(wú)菌操作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司，JB-CJ-1000FX )，細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)，WJ-3-160q)，低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf，Eppendorf 5427 R)，倒置顯微鏡(德國(guó)Olympus，CKX53 )，恒溫振蕩器(上海啟步生物科技有限公司，BSW-211C)，垂直電泳及電轉(zhuǎn)印裝置及其配套耗材(均為美國(guó)伯樂(lè)原裝，型號(hào)Mini-PROTEAN Tetra)，電動(dòng)勻漿器(美國(guó)Kimble，749521-1500)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)方法 將人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，采用RPMI 1640 培養(yǎng)基+10%的胎牛血清，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合至80%左右進(jìn)行傳代。取2代細(xì)胞接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)置空白組、HBV感染組、TLR4激動(dòng)劑組和TLR4抑制劑組?？瞻捉M僅培養(yǎng)2代HK-2細(xì)胞；HBV感染組加入HBV感染的人血清，所用血清均分離于本科室接收的慢性HBV感染患者；TLR4激動(dòng)劑組同時(shí)加入HBV感染的人血清和10 ng/ml的LPS-PG；TLR4抑制劑組同時(shí)加入HBV感染的人血清和10 ng/ml的TAK-242。37℃，5%CO2，培養(yǎng)7 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并采用CCK-8試劑盒測(cè)定HBV感染組、TLR4激動(dòng)劑組和TLR4抑制劑組的細(xì)胞毒性活力。

1.5TLR4信號(hào)通路測(cè)定方法 細(xì)胞培養(yǎng)7 d后進(jìn)行爬片，采用24孔板和配套的細(xì)胞爬片專(zhuān)用玻片進(jìn)行操作，使用前玻片泡酸過(guò)夜，清洗，高壓消毒和烤干。胰酶消化細(xì)胞重懸于1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105；24孔板中先放入蓋玻片，再接種細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，丙酮固定并取出；取出后的蓋玻片可直接蓋于載玻片上，50%甘油封片后即可進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。滴加0.3%的過(guò)氧化氫(H2O2)孵育30 min，清除內(nèi)源性H2O2酶活性，PBS清洗5 min×3次，0.5%的Triton X-100孵育20 min，以增加細(xì)胞通透性，起到破膜和暴露抗原的目的。一抗孵育，4℃過(guò)夜，TLR4與NF-κB的抗體濃度均為1∶500，PBS清洗5 min×3次；二抗孵育，37℃孵育40 min。DAB試劑盒顯色，梯度乙醇脫水之后，封片鏡檢。并采用圖像分析軟件ImagePro Plus 分析陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度。

1.6細(xì)胞自噬測(cè)定方法 細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗細(xì)胞，并采用蛋白質(zhì)抽提試劑盒提取總蛋白，進(jìn)行免疫蛋白印跡(WB)實(shí)驗(yàn)。組裝電泳槽，配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠和電泳緩沖液，以每個(gè)電泳通道10 μg的蛋白量進(jìn)行電泳，先以60 V電泳30 min以清除凝膠內(nèi)雜質(zhì)，再調(diào)至90 V電泳1 h，此時(shí)蛋白按照分子量大小依次分割為不同的條帶。組裝電轉(zhuǎn)印裝置，配置轉(zhuǎn)印緩沖液，以80 V電轉(zhuǎn)印30 min，麗春紅染液觀察轉(zhuǎn)印效果。條帶筆直清晰者進(jìn)行封閉與抗體孵育，封閉液和抗體稀釋液均以脫脂牛奶配置，封閉液濃度為5%，抗體稀釋液為3%，β-actin、Beclin-1、p62和LC-3B的一抗?jié)舛染鶠?∶2000，4℃孵育過(guò)夜；二抗的濃度分別為1∶2000、1∶1500、1∶2000和1∶1800，37℃孵育90 min?？贵w孵育完畢，PBST液清洗，ECL熒光顯色，暗室顯影，拍照，采用圖像分析軟件Image J分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與毒力活性 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線大致呈雙S型，符合細(xì)胞生長(zhǎng)一般規(guī)律。對(duì)照組生長(zhǎng)速率最快，HBV感染組明顯變慢，TLR4激動(dòng)劑組最慢，TLR4抑制劑組位于HBV感染組和對(duì)照組之間。經(jīng)CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)得，TLR4激動(dòng)劑組細(xì)胞毒性活力高于HBV感染組和TLR4抑制劑組，且HBV感染組高于TLR4抑制劑組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組腎小管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.2TLR4信號(hào)通路表達(dá)水平 HBV感染組、TLR4激動(dòng)劑組和TLR4抑制劑組TLR4與NF-κB表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。TLR4激動(dòng)劑組TLR4與NF-κB表達(dá)水平高于HBV感染組，TLR4抑制劑組低于HBV感染組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組腎小管上皮細(xì)胞TLR4信號(hào)通路表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與HBV感染組比較，cP<0.05；與TLR4激動(dòng)劑組比較，eP<0.05

2.3細(xì)胞自噬表達(dá)水平 HBV感染組、TLR4激動(dòng)劑組、TLR4抑制劑組Beclin-1和LC-3B表達(dá)水平均高于對(duì)照組，P62表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.05)。與HBV感染組比較，TLR4激動(dòng)劑組Beclin-1 和LC-3B表達(dá)水平升高，P62表達(dá)水平降低(P<0.05)；TLR4抑制劑組Beclin-1和LC-3B表達(dá)水平均降低，P62表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組腎小管上皮細(xì)胞TLR4信號(hào)通路表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與HBV感染組比較，cP<0.05；與TLR4激動(dòng)劑組比較，eP<0.05

3 討論

腎損傷是HBV感染的最常見(jiàn)并發(fā)癥之一，近幾年來(lái)，細(xì)胞自噬是其病理機(jī)制的研究熱點(diǎn)[5-6]。細(xì)胞自噬是指細(xì)胞通過(guò)溶酶體系統(tǒng)降解受損細(xì)胞器和長(zhǎng)半衰期蛋白的過(guò)程，能被饑餓、創(chuàng)傷應(yīng)激、病原菌入侵等激活，其目的在于及時(shí)清理細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)，并分解供能，以在惡性環(huán)境中維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。TLRs是機(jī)體內(nèi)的非特異性免疫分子，能快速識(shí)別突破機(jī)體物理屏障的病原微生物；TLRs還是非特異性免疫和獲得性免疫的橋梁，在識(shí)別病原微生物后，能夠通過(guò)免疫介質(zhì)及其信號(hào)通路激活細(xì)胞免疫[7-8]。TLR4是目前已發(fā)現(xiàn)最特殊的TLRs，可識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌脂多糖及病毒的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，因此TLR4及其相關(guān)信號(hào)通路對(duì)細(xì)菌與病毒均有免疫調(diào)控活性[9]。在心腦血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究中，楊會(huì)如等[10]證實(shí)啟動(dòng)TLR4/NF-κB通路能夠激活自噬信號(hào)，對(duì)抗缺血缺氧性損傷。HBV感染致腎損傷中也有自噬信號(hào)異常激活，但是否與TLR4/NF-κB通路有關(guān)尚不明確。

本研究采用HBV感染患者的血清感染人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng)和TLR4靶向干預(yù)實(shí)驗(yàn)，以分析TLR4/NF-κB通路對(duì)自噬是否有調(diào)控作用。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線來(lái)看，HBV感染后HK-2細(xì)胞的生長(zhǎng)速率明顯減慢，這主要是因?yàn)椴《靖腥疽鹆思?xì)胞死亡。文獻(xiàn)報(bào)道[11]，在HBV感染后，肝臟病理組織同時(shí)存在凋亡小體和自噬小體，兩者共同參與了HBV感染的病理進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，TLR4激動(dòng)劑組細(xì)胞生長(zhǎng)速率進(jìn)一步減慢，TLR4抑制劑組的細(xì)胞生長(zhǎng)速率有所升高，說(shuō)明抑制TLR4信號(hào)對(duì)于緩解HBV感染引發(fā)的細(xì)胞死亡有緩解作用。在所有TLR4相關(guān)信號(hào)中，TLR4/NF-κB通路是橋接病原微生物免疫、炎性損傷及局部組織壞死的關(guān)鍵通路[12]，因此本研究選擇這兩個(gè)關(guān)鍵介質(zhì)展開(kāi)分析，結(jié)果證實(shí)HBV感染后TLR4/NF-κB信號(hào)通路被激活，TLR4和NF-κB表達(dá)水平同時(shí)上調(diào)。

本研究對(duì)各組細(xì)胞的Beclin-1、LC-3B和P62表達(dá)均做了測(cè)定，三者在自噬生理病理中具有不同的意義：Beclin-1是細(xì)胞自噬的“守門(mén)人”，主要介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位于吞噬泡的過(guò)程，以此調(diào)節(jié)自噬體膜合成和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，是自噬小體形成與成熟的必需物質(zhì)[13-14]。LC-3B具有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，靜息狀態(tài)下以前者為主要存在形式，定位于胞質(zhì)，當(dāng)自噬流被激活后，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ并移位于胞膜，同時(shí)由于LC3-Ⅱ的分子量較LC3-Ⅰ有所降低，WB實(shí)驗(yàn)可同時(shí)看到LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩條條帶，因此多數(shù)研究以WB實(shí)驗(yàn)測(cè)定LC-3B的表達(dá)水平，并以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ作為衡量自噬強(qiáng)度的重要指標(biāo)[15-16]。真核細(xì)胞主要存在兩種蛋白降解系統(tǒng)，泛素蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體系統(tǒng)，p62是SQSTM1基因編碼的泛素結(jié)合蛋白，也稱(chēng)為SQSTM1蛋白，在細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡中均介導(dǎo)重要機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道[17]，無(wú)論自噬上游還是下游信號(hào)被阻斷，都會(huì)導(dǎo)致P62聚集，P62表達(dá)與自噬強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)HBV感染組的Beclin-1 和LC-3B表達(dá)水平升高，P62表達(dá)水平降低，說(shuō)明HBV感染激活了腎小管上皮細(xì)胞的自噬，這可能是一種自我保護(hù)機(jī)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路后自噬水平加強(qiáng)，而抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路后自噬水平有所減弱，證實(shí)通過(guò)靶向干預(yù)TLR4能夠調(diào)控HBV感染腎小管上皮細(xì)胞的自噬。

綜上所述，本研究證實(shí)TLR4信號(hào)通路在腎小管上皮細(xì)胞HBV感染過(guò)程中可能參與了細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用，可能是其病理機(jī)制的重要組成部分，具有深入研究的價(jià)值。