魚類海豚鏈球菌病研究進(jìn)展

羅曉雯，李 莉，朱永肖，裴 超，孔祥會(huì)

( 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)最初由Pier等[1]自美國舊金山捕獲的亞馬遜淡水海豚——亞河豚(Iniageoffrensis)皮下“高爾夫球”樣化膿灶中分離出來，因此被命名為海豚鏈球菌。1978年，Pier等[2]自美國紐約尼亞加拉大瀑布水族館皮膚受損的亞河豚上第二次分離到海豚鏈球菌，之后在美國俄亥俄州的患病亞河豚中也可分離出該菌[3]。關(guān)于海豚鏈球菌感染魚類的報(bào)道始于20世紀(jì)80年代，Kitao等[4]自患病的尼羅羅非魚(Oreochromisnilotica)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和香魚(Plecoglossusaltivelis)中分離出海豚鏈球菌，之后在澳大利亞、美國、中國等世界各地均相繼出現(xiàn)有關(guān)海豚鏈球菌感染魚類的報(bào)道。海豚鏈球菌感染魚類引起疾病爆發(fā)，導(dǎo)致魚類大批量死亡，嚴(yán)重威脅到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。筆者就當(dāng)前國內(nèi)外有關(guān)海豚鏈球菌的研究概況進(jìn)行綜述，以期為魚類海豚鏈球菌的檢測(cè)和疾病防控提供參考。

1 海豚鏈球菌的病原學(xué)

海豚鏈球菌屬于芽孢桿菌綱、乳桿菌目、鏈球菌科、鏈球菌屬，具有感染宿主廣、傳染性強(qiáng)、死亡率高等特點(diǎn)。1994年版的《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》將其歸入化膿性鏈球菌[5]，將ATCC29178作為模式菌株。

海豚鏈球菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性菌(圖1a)，為球形或卵圓形，直徑約為0.2～0.8 μm，有莢膜，無鞭毛，無運(yùn)動(dòng)性，不形成芽孢，通常在液體培養(yǎng)基中呈長鏈排列，在固體培養(yǎng)基中呈短鏈或成對(duì)排列。在綿羊血平板上30 ℃培養(yǎng)48 h，菌落呈現(xiàn)白色小圓點(diǎn)(直徑≤1 mm)[6]，不能水解過氧化氫酶和氧化酶。Barnes等[7]利用精氨酸水解和核糖產(chǎn)酸初步將海豚鏈球菌分為兩個(gè)血清型，Ⅰ型菌株精氨酸雙解酶和核酸酶均為陽性，Ⅱ型菌株均為陰性。Bachrach等[8]使用RAPD方法將海豚鏈球菌分為兩個(gè)核酸型，若海豚鏈球菌的基因組可擴(kuò)増出750 bp的條帶，則為Ⅰ型，反之為Ⅱ型。

海豚鏈球菌有α和β兩種溶血類型，其溶血型與血平板中所加的血液和基礎(chǔ)培養(yǎng)基有關(guān)。Eldar等[9-11]研究發(fā)現(xiàn)，海豚鏈球菌在含5%的牛血或人血的平板上呈現(xiàn)α溶血或部分α溶血(一條窄的β溶血環(huán)被一條更寬的α溶血環(huán)圍繞)，而在添加5%羊血的平板上呈完全β溶血(圖1b)。Nguyen等[12]研究顯示，海豚鏈球菌在含3%的馬血心浸液血平板(HIA)上呈β溶血，而在含3%的馬血Todd-Hewitt平板(THA)上呈α溶血。其溶血環(huán)的大小與血平板中所加的血液有關(guān)，海豚鏈球菌在含有羊血的平板上產(chǎn)生的溶血環(huán)相比人血和牛血平板產(chǎn)生的溶血環(huán)更寬[10]。

圖1 海豚鏈球菌的革蘭氏染色形態(tài)(a)[13]及在5%羊血平板上的溶血活性(b)[14]

2 魚類海豚鏈球菌病的流行病學(xué)

目前國內(nèi)外有關(guān)報(bào)道顯示，海豚鏈球菌可以感染30余種魚類，導(dǎo)致其發(fā)病(表1)。魚類海豚鏈球菌病一般發(fā)生在6—10月，尖吻鱸(Latescalcarifer)感染海豚鏈球菌后，在25～28 ℃時(shí)死亡率最高[15]。但是一些魚類在低溫時(shí)也易感染海豚鏈球菌，沈智華等[16]發(fā)現(xiàn)，浙江省網(wǎng)箱養(yǎng)殖眼斑擬石首魚(Sciaenopsocellatus)在7—12月均有被海豚鏈球菌感染的現(xiàn)象發(fā)生；羅璋等[17]報(bào)道顯示，天津市某養(yǎng)殖場的銀鼓魚(Selenotocamultifasciata)3月發(fā)生海豚鏈球菌病，發(fā)病率超過50%；張俊等[18]報(bào)道，羅非魚、花鱸(Lateolabraxjaponicus)、尖吻鱸全年均有可能感染海豚鏈球菌，但不同魚類對(duì)海豚鏈球菌的易感程度不同，羅非魚較其他魚類更易感且感染程度強(qiáng)，而花鱸也遠(yuǎn)比石斑魚(Epinephelis)、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)和眼斑擬石首魚等易感染海豚鏈球菌。體表損傷、水環(huán)境條件惡劣等常是導(dǎo)致魚類感染發(fā)病的重要因素[18]。

表1 海豚鏈球菌感染魚類的報(bào)道

3 魚類海豚鏈球菌病的臨床癥狀

魚類被海豚鏈球菌感染的臨床癥狀分為急性和亞急性型，感染率與魚的種類及規(guī)格、菌株的毒力、養(yǎng)殖環(huán)境條件相關(guān)[18]。急性感染的魚類常出現(xiàn)爆發(fā)性死亡，但無典型癥狀[28]。亞急性感染的病魚常出現(xiàn)體色發(fā)黑、食欲減退、嗜睡、脊椎畸形、單側(cè)或雙側(cè)眼球突出、角膜混濁(圖2a)，鰓蓋下緣、胸鰭基部、體表的其他部位有出血現(xiàn)象(圖2b)，鰭條邊緣褪色、肛門紅腫，死前出現(xiàn)間斷性狂游、翻滾或轉(zhuǎn)圈等癥狀[38]。有些病魚腦部充血(圖2c)[39]，腹腔有血色腹水，肝、脾、腎等臟器充血腫脹、變色(圖2d)，嚴(yán)重者肝臟和腎臟糜爛[17]。也有表現(xiàn)為膽囊腫大、膽汁暗綠，腸道內(nèi)無食物，后腸腸壁充血等癥狀[6,35]，或在心外膜上出現(xiàn)大量“米粒樣大小”泡樣囊狀物[40]等癥狀。

圖2 卵形鯧鲹(a,c)和西伯利亞鱘(b,d)被海豚鏈球菌感染的癥狀[40]a.眼突或角膜混濁；b.胸鰭基部點(diǎn)狀出血；c.腦出血腫脹；d.肝臟發(fā)白，彌散性點(diǎn)狀出血.

4 海豚鏈球菌的致病機(jī)理

Zlotkin等[41]認(rèn)為，海豚鏈球菌感染魚類發(fā)病是一個(gè)多步驟的過程。首先，水環(huán)境中的海豚鏈球菌經(jīng)魚體受傷部位直接感染或經(jīng)消化道途徑侵入魚體，進(jìn)入血液循環(huán)，利用吞噬細(xì)胞的保護(hù)躲避宿主免疫系統(tǒng)，穿透血—腦屏障，進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Russo等[42]通過試驗(yàn)魚體腔注射海豚鏈球菌發(fā)現(xiàn)，注射后2 d內(nèi)，魚體血液、脾、腎、腦中的細(xì)菌持續(xù)增加，之后血液、脾、腎中的鏈球菌數(shù)量減少或維持在一定密度，而腦中細(xì)菌數(shù)量繼續(xù)上升，直至病魚死亡。Aamri 等[43]認(rèn)為，在鏈球菌逃避吞噬細(xì)胞的吞噬作用中，莢膜起到了非常關(guān)鍵的作用，海豚鏈球菌的莢膜可有效地阻止宿主免疫分子與病原菌的結(jié)合與激活。

Weinstein等[44]的研究顯示，致病性和非致病性海豚鏈球菌的脈沖場凝膠電泳分子分型識(shí)別系統(tǒng)圖譜存在一定的差異，推測(cè)有一種或多種特異基因編碼的毒力因子決定著海豚鏈球菌的致病性。Fuller等[45]比較了海豚鏈球菌致病菌株與非致病菌株間致病力的差異，發(fā)現(xiàn)兩者均具有良好的黏附和侵襲功能，但具備直接的細(xì)胞毒性和抵抗吞噬細(xì)胞的清除能力是決定其致病性的關(guān)鍵因素。海豚鏈球菌主要的致病因子有M蛋白、鏈球菌溶血素S、莢膜多糖、葡萄糖磷酸變位酶、α-烯醇化酶、C5a肽酶等毒力因子。

4.1 M蛋白

M蛋白由simA和simB基因編碼，是一類由復(fù)合基因調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控的表面蛋白，是海豚鏈球菌主要的毒力因子之一[46]。Baiano等[47]首次克隆了海豚鏈球菌(K288)的simA(QMA0076)，M蛋白能夠結(jié)合人類纖維蛋白原，還能與鱒魚免疫球蛋白的FC結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，有利于細(xì)菌黏附上皮細(xì)胞和逃避吞噬細(xì)胞。

4.2 鏈球菌溶血素S

鏈球菌的細(xì)胞溶素包括A群鏈球菌的溶血素S、溶血素O，B群鏈球菌的 β-溶血素/細(xì)胞溶素。這些溶血素均與致病菌的毒力有著密切的關(guān)系[48]。Locke等[46]研究表明，海豚鏈球菌溶血素S能損傷紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，還可能促進(jìn)腦血管創(chuàng)傷，這是其發(fā)揮毒性的主要作用方式。

4.3 莢膜多糖

Fuller 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，海豚鏈球菌致病株能產(chǎn)生莢膜多糖，而非致病菌株不產(chǎn)生，提示海豚鏈球菌的致病性可能與莢膜多糖有關(guān)。Miller等[49]研究也顯示，具有莢膜多糖的海豚鏈球菌菌株毒性要比無莢膜多糖的菌株毒性強(qiáng)，莢膜多糖能夠抑制和調(diào)理吞噬細(xì)胞的吞噬作用，阻止宿主補(bǔ)體因子C3b的沉積，產(chǎn)生莢膜多糖是海豚鏈球菌逃避被吞噬細(xì)胞吞噬最有效的方式之一，而且莢膜多糖也能增強(qiáng)溶血素S的形成。

Barnes等[7]發(fā)現(xiàn)，血清Ⅱ型的海豚鏈球菌由于莢膜表面抗原覆蓋率更高，具有更強(qiáng)的抗吞噬活性。Locke等[50]利用等位基因交換突變技術(shù)構(gòu)建了莢膜△cpsD突變株，發(fā)現(xiàn)突變株的莢膜比野生株莢膜明顯要薄，同時(shí)抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬作用也變?nèi)?，進(jìn)一步證明莢膜多糖與菌體抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬作用有關(guān)。

4.4 葡萄糖磷酸變位酶

葡萄糖磷酸變位酶與莢膜合成有關(guān)，它由pgmA基因編碼，包含571個(gè)氨基酸，在維持正常細(xì)胞壁形態(tài)、莢膜表達(dá)和對(duì)抗宿主先天性免疫中發(fā)揮作用。Buchanan等[51]用△pgm的突變株(pgmA缺失株)和野生株對(duì)雜交條紋鱸進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果顯示，野生株以4×105cfu/mL劑量接種死亡率達(dá)100%，而突變株4×108cfu/mL的接種劑量死亡率僅2.5%。觀察發(fā)現(xiàn)，突變株的細(xì)胞莢膜厚度變薄，脆性降低，能被雜交條紋鱸全血細(xì)胞迅速清除掉，證實(shí)了pgmA基因是決定海豚鏈球菌致病性的毒力基因。

4.5 C5a肽酶和α-烯醇化酶

C5a肽酶是由scpⅠ基因編碼的123 ku的蛋白質(zhì)，通過水解補(bǔ)體C5a，阻止多核細(xì)胞靠近菌體，延緩免疫系統(tǒng)對(duì)鏈球菌的殺滅，從而損傷宿主的抗侵襲能力，是A群和B群鏈球菌的重要毒力因子[52]。而海豚鏈球菌可通過α-烯醇化酶激活纖溶酶原降解纖維層，逾越各種組織障礙侵襲動(dòng)物體，致宿主發(fā)病[53]。

5 海豚鏈球菌的檢測(cè)方法

張新艷等[54]報(bào)道顯示，廣東、福建、海南等省爆發(fā)的羅非魚無乳鏈球菌(S.agalactiae)病的主要癥狀和流行狀況與之前國內(nèi)已報(bào)道的羅非魚海豚鏈球菌病相似，但無乳鏈球菌被認(rèn)為是唯一擁有B群特異性抗原的鏈球菌[55]，而海豚鏈球菌不具有Lancefield B群鏈球菌特異性抗原。另外在生理生化特征(表2)和分子生物學(xué)方面，兩種細(xì)菌也有一定的差異。因此，可以結(jié)合多種方法來對(duì)海豚鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)，目前其檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法、免疫學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。

5.1 傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法

傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法包含選擇培養(yǎng)基篩選和生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

5.1.1 使用選擇培養(yǎng)基篩選

選擇培養(yǎng)基是根據(jù)海豚鏈球菌對(duì)不同抗菌物質(zhì)的耐受性，選擇合適的抗菌物質(zhì)來抑制其他菌的生長，進(jìn)而從養(yǎng)殖水體或病魚中檢出海豚鏈球菌。Nguyen等[12]設(shè)計(jì)了醋酸鉈—噁喹酸和硫酸黏桿菌素—噁喹酸兩種選擇性培養(yǎng)基，將其應(yīng)用于褐牙鲆海豚鏈球菌的分離。而后Nguyen 等[56]將培養(yǎng)基配方進(jìn)行了改良，以Todd-Hewitt肉湯代替腦心浸液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，硫酸黏桿菌素—噁喹酸培養(yǎng)基中加入醋酸鉈0.5 g/L，并將其用于日本褐牙鲆養(yǎng)殖場的海豚鏈球菌的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)醋酸鉈—硫酸黏桿菌—噁喹酸培養(yǎng)基比硫酸黏桿菌素—噁喹酸培養(yǎng)基對(duì)雜菌的抑制效果更好。

5.1.2 根據(jù)生理生化特征鑒定

海豚鏈球菌在10 ℃生長，45 ℃不生長；接觸酶陰性；可水解七葉靈和精氨酸，V-P試驗(yàn)和馬脲酸試驗(yàn)陰性；海豚鏈球菌發(fā)酵葡萄糖、水楊苷，不發(fā)酵阿拉伯糖、菊糖、乳糖、棉子糖和山梨醇等(表2)。微生物鑒定系統(tǒng)能夠自動(dòng)測(cè)定多種生化反應(yīng)，依據(jù)其自帶的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定后輸出結(jié)果。目前商品化的適合鏈球菌鑒定的微生物鑒定系統(tǒng)主要有Biolog Microlog System、API 20 Strep Rapid ID 32 Strep、BioMerieux Vitek、the ATB Expression System和the Microscan WalkAway System等[32]。

表2 海豚鏈球菌和無乳鏈球菌的生理生化特征

注：+表示為陽性；-表示為陰性；α表示α溶血；β表示β溶血.

5.2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

雖然無乳鏈球菌與海豚鏈球菌的16S rRNA基因的同源性較高(95.6%～96.8%)[59]，但也存在一定的差異。Zlotkin等[25]設(shè)計(jì)的一對(duì)16S引物可特異性擴(kuò)增海豚鏈球菌，產(chǎn)生約300 bp的清晰特異性條帶，而無乳鏈球菌無擴(kuò)增條帶。Berridge等[60]根據(jù)鏈球菌16S～23S rDNA間隔區(qū)序列設(shè)計(jì)引物對(duì)鏈球菌進(jìn)行了PCR鑒定。也有學(xué)者應(yīng)用伴侶蛋白60(cpn60) 基因[61]以及乳酸鹽氧化酶基因LctO[62]設(shè)計(jì)特異性引物建立了海豚鏈球菌檢測(cè)方法。Park等[63]針對(duì)gyrB、23S rRNA、16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物，使用多重PCR方法檢測(cè)了使褐牙鲆染病的遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda)、副乳鏈球菌(S.parauberis)和海豚鏈球菌。王瑞娜等[64]建立了一種可應(yīng)用于海豚鏈球菌快速檢測(cè)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)合橫向流動(dòng)試紙條的技術(shù)，能準(zhǔn)確高效的檢測(cè)出海豚鏈球菌。Cai等[39]利用Si、cfb、tuf基因序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行多重PCR，結(jié)合16S rRNA的BLAST結(jié)果，鑒定出廣西患病卵形鯧鲹的致病菌為海豚鏈球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)。

5.3 免疫學(xué)檢測(cè)方法

沈智華等[16]采用間接酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)海豚鏈球菌。Klesius 等[65]基于高度特異性單克隆的間接熒光抗體技術(shù)建立了快速檢測(cè)羅非魚海豚鏈球菌技術(shù)。張友平[66]采用海豚鏈球菌 SO3 為抗原，制備了兔抗高效免疫血清，基于生物素與親和素的高親和力及酶標(biāo)反應(yīng)的放大效應(yīng)，建立了海豚鏈球菌雙夾心BA-ELISA 的檢測(cè)方法。該方法對(duì)海豚鏈球菌的特異性強(qiáng)，最低檢測(cè)限度為4×104～16×104cfu/mL，該法與PCR法的一致性達(dá)91.3%。

6 海豚鏈球菌病的防治

魚類鏈球菌病的發(fā)生是由環(huán)境因素、魚體抵抗力和病原菌共同作用的結(jié)果，對(duì)于鏈球菌病的防治，主要使用改善水體養(yǎng)殖環(huán)境、免疫預(yù)防和藥物治療等方法。

6.1 疾病預(yù)防

Aruety 等[67]研究設(shè)計(jì)了零排放循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的污泥消化器，降低污泥中病原菌的含量。Iwashita等[68]通過在飼料中添加枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和米曲霉(Aspergillusoryzae)等微生態(tài)制劑增強(qiáng)羅非魚魚苗的免疫力，提高了羅非魚對(duì)海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的抵抗力，Shiau等[69]則通過在低魚粉和高豆粕的飼料中補(bǔ)充核苷酸，提高了羅非魚對(duì)海豚鏈球菌的免疫力。

接種疫苗是預(yù)防鏈球菌病的有效方法。目前關(guān)于海豚鏈球菌疫苗的研究主要有滅活疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗和DNA疫苗。Eldar等[70]利用福爾馬林滅活疫苗免疫虹鱒，使得由海豚鏈球菌引起的虹鱒的死亡率由50%降至5%。Klesius等[71]用異源海豚鏈球菌菌株(海水菌株與淡水菌株)，按一定比例混合制備成多價(jià)疫苗免疫羅非魚, 并利用制備疫苗的菌株進(jìn)行攻毒, 相對(duì)保護(hù)率分別達(dá)到63.1% (淡水菌株攻毒)和 87.3%(海水菌株攻毒)。張生等[72]利用自患病羅非魚分離到的海豚鏈球菌菌株制備的滅活疫苗，通過腹腔注射免疫尼羅羅非魚，使用8倍半數(shù)致死量的劑量攻毒獲得100%的相對(duì)保護(hù)率。Locke等[52]將編碼毒力因子M蛋白的simA基因敲除，構(gòu)建了一株simA突變菌株，使該菌株的毒力大大減弱，對(duì)條紋鱸和斑馬魚(Daniorerio)均顯示出較好的保護(hù)效應(yīng)。孫黎等[73]對(duì)褐牙鲆源海豚鏈球菌保護(hù)性抗原Sip11重組蛋白構(gòu)建了亞單位疫苗，免疫褐牙鲆的保護(hù)率達(dá)100%。也有一些研究人員研究出針對(duì)海豚鏈球菌的烯醇化酶亞單位疫苗，該疫苗免疫斑馬魚后對(duì)海豚鏈球菌的免疫保護(hù)率為100%[74]。Sun 等[75]構(gòu)建了一個(gè)針對(duì)海豚鏈球菌的 DNA 疫苗pSia10，用該 DNA 疫苗免疫大菱鲆(Scophthalmusmaximus)后，不僅魚體內(nèi)的特異性抗體水平顯著增高，而且非特異性的免疫因子IgM、C3、Mx、NKEF、TLR3和 TNF-α 在mRNA水平表達(dá)上調(diào)。

6.2 藥物治療

魚類海豚鏈球菌病的治療，目前主要使用抗菌藥物和中草藥。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，海豚鏈球菌對(duì)恩諾沙星、頭孢噻肟、頭孢拉定、頭孢唑啉、卡那霉素等藥物較為敏感，可用于海豚鏈球菌的治療[35-36]。吳穎瑞等[76]研究了153種中草藥對(duì)羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)博落回、紫草、田基黃、補(bǔ)骨脂、三顆針、田七須和五倍子對(duì)無乳鏈球菌和海豚鏈球菌均具有較好的抑菌效果。楊劍等[77]的研究發(fā)現(xiàn)，三黃連合劑(黃芩、黃連、黃藥子等)可以減輕因海豚鏈球菌感染造成的免疫抑制，從而保護(hù)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，提升免疫力。

7 展 望

海豚鏈球菌是一種世界性分布的魚類致病菌，感染宿主廣、傳染性強(qiáng)、死亡率高，危害嚴(yán)重。防止魚類海豚鏈球菌病的發(fā)生，首先要探明海豚鏈球菌的傳播途徑和致病機(jī)制，目前海豚鏈球菌的致病機(jī)理還僅限于對(duì)部分毒力因子的研究，有關(guān)致病機(jī)制還有待深入研究。海豚鏈球菌病的治療，目前主要使用抗菌藥物，而抗菌藥物的長期使用和濫用，使得海豚鏈球菌對(duì)很多藥物產(chǎn)生耐藥性。中草藥是否能替代抗生素用于鏈球菌病的治療，尚需體內(nèi)試驗(yàn)和綜合評(píng)價(jià)。鏈球菌疫苗的研究較多，但多數(shù)仍處于試驗(yàn)階段，臨床效果有待于進(jìn)一步檢驗(yàn)，研發(fā)安全高效的海豚鏈球菌疫苗，是防控魚類鏈球菌病的最有效手段。