姜黃油的抑菌活性及抑菌機理

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(河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050000)

隨著生活水平的不斷提高,人們對食品添加劑中的防腐劑提出了更高的要求,不僅希望其防腐效果明顯,同時希望其更加安全無毒害,因此使用天然防腐劑代替化學合成防腐劑已成為發(fā)展趨勢。研究發(fā)現(xiàn),精油是天然抗菌劑,具有廣譜的抑菌活性,對有細胞壁和無細胞壁的革蘭氏陽性、陰性菌均有抑制作用[1]。唐裕芳等[2]發(fā)現(xiàn),蒼術(shù)揮發(fā)油對3種細菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌)、4種真菌(酵母、青霉、黑曲霉、黃曲霉)均具有良好的抑制作用,且與濃度呈依賴關(guān)系;張有林等[3]發(fā)現(xiàn),百里香精油對細菌的抗菌性均表現(xiàn)為敏感型;干信等[4]也發(fā)現(xiàn),花椒揮發(fā)油也具有良好的抑菌效果,不僅能抑制革蘭氏陰性菌,也能抑制革蘭氏陽性菌。

姜黃油為姜科植物姜黃(CurcumalongaL.)的塊狀根莖經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油,所含成分極其復雜,一般有數(shù)十種至數(shù)百種組分[5]。主要為萜類化合物、芳香族化合物,如姜黃烯、倍半萜烯、姜黃酮等物質(zhì)[6]。姜黃油具有抑菌、抗氧化、抗癌、抗炎、止咳等功能[7-8]。研究表明,植物精油的抑菌機理是精油及成分作用到微生物的細胞膜,當微生物的膜結(jié)構(gòu)受損,微生物的膜透氣性增加,從而導致細胞內(nèi)部離子和內(nèi)含物發(fā)生外泄或微生物的酶系統(tǒng)受到損傷,從而導致細胞死亡[9-12]。Lv、Yang等[13-14]研究也證明了這一點。胡小軍、吳斌、Charoenkul等[15-17]對姜黃油的抑菌活性進行了研究,但并沒有對其抑菌機理進行進一步的分析。

本文主要研究了姜黃油對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、藤黃八疊球菌和沙門氏菌四種供試菌的抑菌活性,并對其抑菌機理進行了初步的探究,為開發(fā)姜黃油的生物學活性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

姜黃根莖 由河北澤華生物科技有限公司提供，自然晾曬干燥，至其中水分含量為10%后，用粉碎機打碎，過40目篩，得到姜黃粉，使用前放置在80 ℃左右干燥箱中烘干，至水分含量低于0.5%，放于干燥器中備用;革蘭氏陽性菌:枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、藤黃八疊球菌(Sarcineluted.),革蘭氏陰性菌:沙門氏菌(Salmonella) 均由河北科技大學食品科學系提供;姜黃 2014年產(chǎn)于印度卡納塔克邦;無水乙醇(分析純) 天津市光復精細化工研究所;叔丁醇、戊二醛 天津博迪化工股份有限公司;葡萄糖 天津百世化工有限公司;吐溫80 天津市永大試劑有限公司;考馬斯亮藍、DNS試劑 上海寶曼生物科技有限公司;磷酸緩沖溶液(PBS,pH=7.0) 石家莊茂財生物科技有限公司。

S-4800-1場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本HITACHI;Adventurer分析電子天平 美國奧豪斯儀器有限公司;EPOCH2全波長酶標儀 美國博騰儀器有限公司;D-1-70型自動控制壓力蒸汽滅菌鍋 北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司;打孔器、電導儀 上海雷磁新涇儀器有限公司;KQ5200DE數(shù)控超聲清洗器 昆山市起生儀器有限公司;7HZ-82A水浴恒溫振蕩器 常州榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜黃油及培養(yǎng)基的制備 姜黃油的制備:通過離子液體[BMIM]PF6酶法輔助提取姜黃油,其中離子液體添加量為18%,纖維素酶添加量為1.4%,液料比為10∶1,酶解溫度為50 ℃,酶解時間90 min。提取得到的姜黃油為橙黃色透明液體,具有典型的姜黃氣味[18]。

姜黃油儲備液的制備:配制質(zhì)量分數(shù)為0.002%的吐溫80溶液,稀釋姜黃精油至體積分數(shù)為50 μL/mL,4 ℃貯藏備用。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,定容到1000 mL,調(diào)節(jié)pH在7.4～7.6之間。其中固體培養(yǎng)基補加15～20 g的瓊脂。

1.2.2 抑菌圈(DIZ)的測定 參考Sharma等[19]的方法,采用打孔法測定DIZ大小。向培養(yǎng)皿(90 mm)中倒入20 mL已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,冷卻,待其凝固后,分別加入100 μL的枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、藤黃八疊球菌、沙門氏菌4種菌液(濃度調(diào)整為1×107cfu/mL),均勻涂布,靜置5 min。用打孔器在培養(yǎng)基等位置處,打成直徑5 mm的三個圓孔,其中兩個孔加入10 μL的姜黃油,另一個孔加入0.002%吐溫80作為陰性對照。靜置5 min,37 ℃培養(yǎng)12 h后,用游標卡尺測量抑菌圈大小。

抑菌圈(mm)=藥品組抑菌圈-陰性對照組抑菌圈

1.2.3 最低抑菌濃度(MIC)的測定 以0.002%的吐溫80生理鹽水為對照組溶劑,采用二倍稀釋法,將姜黃油按不同的濃度梯度稀釋,使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 μL/mL,以相同質(zhì)量濃度的吐溫80做陰性對照,分別將4種菌體溶度調(diào)整為1×107cfu/mL后,接種于培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)12 h,測定其OD600。當吸光度沒有明顯變化時對應的姜黃油濃度記為MIC。

1.2.4 生長曲線的測定 對照生長曲線:將枯草芽孢桿菌、和蠟樣芽胞桿菌、藤黃八疊球菌和沙門氏菌稀釋成1×107cfu/mL后，于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),培養(yǎng)期間每隔1 h取樣,用酶標儀在600 nm處測其OD值,記錄數(shù)據(jù)。

樣品組生長曲線:將1×107cfu/mL的4種供試菌菌液,加入到含0、0.5、0.75 MIC濃度的姜黃油培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)期間每隔1 h取樣,用酶標儀在600 nm處測光密度值(OD值),記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 菌體形態(tài)的測定 參考馮雅靜[20]的方法并進行修改。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌和沙門氏菌加入到含0、1 MIC姜黃油的培養(yǎng)基中,使菌種濃度為1×107cfu/mL,搖床培養(yǎng)(37 ℃,200 r/min),在4 h分別取樣5 mL,4500 r/min離心10 min,收集菌體沉淀,PBS洗滌3次。加入適量的戊二醛于4 ℃環(huán)境中放置4 h,然后采用30%、50%、70%、90%乙醇及無水乙醇(每次離心10 min)進行梯度洗脫,最后加入2.5%叔丁醇置換出乙醇,將處理好的樣品平鋪于滅菌的培養(yǎng)皿中,放于超凈臺上自然風干,后鍍膜進行電鏡觀察。

1.2.6 電導率的測定 參考Diao等[21]的方法。將4種供試菌接種于液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h,4000 r/min離心10 min,棄上清液,用5%葡萄糖溶液洗至菌液的相對電導率與5%葡萄糖溶液的相對電導率相當,此菌液作為等滲菌。向5%葡萄糖溶液中分別加入不同濃度的姜黃油(0、1 MIC),混勻,測其相對電導率記為L1。取等滲菌液分別加入不同濃度的姜黃油(0、1 MIC),37 ℃下培養(yǎng) 6 h,每1 h取出測定相對電導率,記為L2。將懸于5%葡萄糖溶液的菌液沸水浴5 min 冷卻后,測定相對電導率記為L0。菌種膜通透性的相對電導率根據(jù)如下公式計算。

相對電導率(%)=(L2-L1)/L0×100%

1.2.7 姜黃油對細胞內(nèi)容物滲漏的影響 菌體活化后用PBS清洗3次,重懸于PBS中,混勻。將混勻的菌懸液分成2等份,加入不同濃度的姜黃油,使姜黃油在菌懸液中的終濃度分別為0、1 MIC?；靹蚝?將菌懸液置于37 ℃,200 r/min培養(yǎng)3 h,5000 r/min離心 15 min。取離心后的上清液0.2 mL,用紫外可見分光光度計在260 nm下測定吸光值(用PBS作空白調(diào)零)。再取離心后的上清液0.5 mL,加入5 mL 的考馬斯亮藍試劑,5 min后,調(diào)分光光度計波長至595 nm處,以0.5 mL蒸餾水,5 mL的考馬斯亮藍試劑管為調(diào)零點,測樣品管的吸光值,通過標準曲線y=0.0054x+0.0034(R2=0.9993),計算待測樣品的蛋白質(zhì)含量[22]。最后取處理好的上清液 0.5 mL,加入1.5 mL的蒸餾水,再加入1.5 mL DNS,搖勻,在沸水浴中準確加熱10 min,取出,用冷水迅速冷卻至室溫,調(diào)分光光度計波長至540 nm,以2 mL蒸餾水+1.5 mL DNS管為調(diào)零點,測定OD值,通過標準曲線y=0.1461x+0.0624(R2=0.9995),計算待測樣品的還原糖含量。以上處理均重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本文中所有實驗均平行3次。所有數(shù)據(jù)均以平均值(mean)±標準差(SD)表示。用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析,組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),以p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃油抑菌性能的測定結(jié)果

通過測定4種菌的抑菌圈直徑的大小和最低抑菌濃度,判斷其對姜黃油的敏感程度。DIZ值越大,抑菌效果越好。最低抑菌濃度(MIC)值越小,抑菌效果越好,說明在較低的質(zhì)量濃度下,就可以抑制微生物的生長[23]。由表1可以看出,姜黃油對4種供試菌均有較好的抑菌效果,其中對沙門氏菌的抑菌效果最好,其抑菌圈為15.3 mm,MIC值為0.4 μL/mL,其次是枯草芽孢桿菌>蠟樣芽胞桿菌>藤黃八疊球菌。

表1 姜黃油對4種供試菌的抑菌性能Table 1 Antibacterial activity of turmeric oil to four tested strains

2.2 4種菌生長曲線的測定結(jié)果

菌液的OD600值可以用來衡量菌液中細菌數(shù)目的多少,因此,OD600值變化可以反映姜黃油對細菌的抑制和殺滅作用的大小[24]。圖1為4種細菌在不同濃度姜黃油作用下所表現(xiàn)的生長曲線圖。從圖1中可以看出,空白組呈現(xiàn)典型的S型,說明細菌正常生長狀況良好。當添加了不同濃度的姜黃油后生長曲線變化明顯,OD600值也隨時間的延長而升高,但是增加幅度相比空白組明顯減小。姜黃油對4種供試菌的生長均有很好的抑制作用,并且其抑制作用與劑量成依賴關(guān)系。姜黃油能夠抑制4種菌體的生長,12 h后生長處于穩(wěn)定期,細菌的活性完全被抑制。由此說明,姜黃油能減弱供試菌的生長速度,延緩其生長期,在穩(wěn)定期時能抑制多半的細菌生長。

圖1 不同濃度姜黃油對4種供試菌生長曲線的影響Fig.1 Effects of different concentration of turmeric oil on growth curve of four tested strains

2.3 姜黃油對兩種代表性菌體形態(tài)的影響

試驗選取了其中最具代表性且抑菌效果最好的兩株菌,一個為革蘭氏陽性菌即枯草芽孢桿菌,一個為革蘭氏陰性菌即沙門氏菌,觀察其在姜黃油處理前后的細胞形態(tài)變化,掃描電鏡微生物超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果見圖2。由圖2A、圖2C可知,當枯草芽孢桿菌和沙門氏菌沒有被姜黃油處理時,菌體形態(tài)兩端鈍圓,呈現(xiàn)典型的短桿狀,大小比較整齊[25]。菌體表面光潔平整,圓潤充盈飽滿,細胞表面沒有出現(xiàn)損壞也沒有發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)物質(zhì)流出。經(jīng)過精油處理4 h后,由圖2B、2D可明顯看出,菌體外部出現(xiàn)損傷,菌體不再充盈圓潤,表面不再平整,部分細胞形態(tài)破損嚴重,已經(jīng)不能呈現(xiàn)完整的菌體形態(tài),同時,能夠看到大量的破碎粘連或凹陷,這也是造成細胞內(nèi)容物泄露的出口。這些損傷性的變化，可能是由于姜黃油引起了胞膜組分的溶解和轉(zhuǎn)變,導致細胞出現(xiàn)形態(tài)學上的改變,進而容易導致細胞內(nèi)容物泄露、受損、發(fā)生代謝紊亂和死亡[26]。掃描電鏡圖從形態(tài)學方面表明了姜黃油的抑菌機理。

圖2 枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrographs of Bacillus subtilis and Salmonella注：A：未處理的枯草芽孢桿菌；B：1 MIC處理的枯草芽孢桿菌；C：未處理的沙門氏菌；D：1 MIC處理的沙門氏菌。

2.4 電導率的測定結(jié)果

細胞膜是細菌的一個屏障,既可以阻擋外源物質(zhì)的進入,也可以防止內(nèi)部物質(zhì)的流出[27]。當細胞膜受到損壞,胞內(nèi)物質(zhì)就會釋放出來,小分子如鉀離子、鈉離子、磷酸根離子等電解質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中,使培養(yǎng)液的電導率上升。菌液電導率的變化反映了細菌細胞膜通透性的變化[28]。由圖3可以看出,0 MIC姜黃油處理的4種菌的電導率變化不明顯,在開始的兩個小時電導率呈升高的趨勢,可能是由于正常菌體的細胞自身溶解和死亡所致[29]。當經(jīng)1 MIC姜黃油處理后,枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和沙門氏菌這3種供試菌的電導率明顯增長,且在前2 h內(nèi)電導率升高最大。這說明在前2 h內(nèi),姜黃油明顯破壞了供試菌的細胞壁,使其通透性增加,將細胞內(nèi)離子外泄到細胞外,致使菌懸液電導率明顯升高。2～10 h處于升高緩慢并逐漸趨于穩(wěn)定的狀態(tài),10 h后處于穩(wěn)定狀態(tài)。藤黃八疊球菌電導率的增長并不是很明顯,但也有一定的增長。姜黃油之所以能夠促使供試菌培養(yǎng)基的電導率升高,主要是由于姜黃油能夠作用于菌體的細胞壁,攻擊細胞膜,使其細胞受損,離子穩(wěn)態(tài)失衡,影響菌體的代謝,最終導致菌體死亡[30]。

圖3 不同濃度姜黃油對4種供試菌電導率的影響Fig.3 Effects of different concentration of turmeric oil on the conductivity of four tested strains

2.5 姜黃油對細胞內(nèi)容物滲漏的影響

核酸、蛋白質(zhì)類的大分子物質(zhì)貫穿于整個胞膜和胞質(zhì)當中,是重要的單位結(jié)構(gòu)物質(zhì)。菌體核酸、蛋白質(zhì)等內(nèi)容物質(zhì)的釋放,說明細胞膜完整性遭到了破壞,表明抑菌物質(zhì)對菌體膜完整性產(chǎn)生了影響,細胞膜的完整性是菌體正常生長代謝的一個主要影響因素。測定結(jié)果如表2所示,加入1 MIC的姜黃油后,4種供試菌的OD260(核酸)明顯升高,還原糖的含量也明顯升高,蛋白質(zhì)的含量呈倍增長。此內(nèi)容物釋放趨勢與Shen等[31]的結(jié)果相同。其中,姜黃油對沙門氏菌的破壞最嚴重,其內(nèi)容物質(zhì)泄露最為嚴重,與其抑菌效果的結(jié)果一致。表明姜黃油導致細胞內(nèi)容物的泄漏,影響細胞的正常生長,從而抑制了細菌的繁殖,是其抑制菌體生長的原因之一[31]。

表2 姜黃油對4種供試菌細胞內(nèi)容物的影響Table 2 Effects of turmeric oil on cell contents on four tested strains

3 結(jié)論

本文選擇姜黃油做抑菌物質(zhì),研究了姜黃油作用于4種供試菌的抑菌性,得出結(jié)果:姜黃油對沙門氏菌和枯草芽孢桿菌有很好的抑菌效果,其最低抑菌濃度分別為均為0.4、0.8 μL/mL,抑菌圈大小分別為15.3、12.2 mm。姜黃油對4種供試菌的生長均有明顯的抑制作用,培養(yǎng)基中電導率明顯增加。掃描電鏡圖顯示,姜黃油破壞了菌體細胞的形態(tài),細胞表面褶皺,胞體扭曲,凹陷;姜黃油影響了菌體胞膜的通透性,小分子物質(zhì)泄漏,離子穩(wěn)態(tài)瓦解;由于姜黃油的作用,細胞膜完整性遭到破壞,大量核酸、蛋白質(zhì)釋放,菌體生長繁殖受阻。本實驗為姜黃油作為高效、低成本的抑菌劑更好地應用于食品產(chǎn)業(yè)提供了理論依據(jù)。