桑葉提取物、茶多酚及其復(fù)配物的抗氧化和降血糖活性

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(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

桑葉(MorusalbaL.),是我國著名的藥食兩用草本植物,富含多種生物活性物質(zhì),如多酚、生物堿、多糖、維生素等?！侗静菥V目》曾記載,桑葉“汁煎代茗,能止消渴”。據(jù)報(bào)道,桑葉及其提取物具有降血糖[1]、降血脂[2]、抗糖尿病[3]、抗氧化[4]和抗腫瘤[5]等藥理作用。茶多酚(Tea polyphenloys)是茶葉中一類多羥基酚類化合物的總稱,主要成分包括兒茶素類、黃酮類、黃酮醇類、酚酸類、縮酚酸類及聚合酚類等。大量研究表明,茶多酚具有抗氧化[6]、降血糖[7]、降血脂[8]和調(diào)節(jié)免疫[9]等生理活性,在功能食品方面具重要的應(yīng)用前景。

相對(duì)于單一的活性物質(zhì),復(fù)配兩種或多種活性物質(zhì)具有多靶點(diǎn)、多種作用機(jī)制的優(yōu)勢(shì)。同時(shí),復(fù)配聯(lián)合產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)可以增強(qiáng)功能活性、減少劑量、延緩耐藥性發(fā)展和降低毒性。李玲[10]發(fā)現(xiàn)桑葉和苦瓜提取物的復(fù)配物抗氧化效果顯著,具有協(xié)同作用;Kan等[11]發(fā)現(xiàn)桑葉提取物在與葫蘆巴籽、西洋參復(fù)配使用時(shí),可以有效預(yù)防胰島素抵抗、糖耐量受損;馬燕妮[12]發(fā)現(xiàn)桑葉提取物與其它草本復(fù)配物具有協(xié)同抗氧化作用。此外,作為天然、高效、安全的抗氧化劑,茶多酚已得到廣泛應(yīng)用。有研究表明,茶多酚對(duì)糖尿病小鼠的高血糖、高血脂具有一定的改善作用[13]。綜合桑葉提取物與茶多酚的優(yōu)勢(shì),研究其復(fù)配物協(xié)同抗氧化兼聯(lián)合降糖的效果,不僅可進(jìn)一步提高因自由基作用引起的疾病和糖尿病的治療效果,還能節(jié)省能源、降低成本。為此,本文將桑葉提取物與茶多酚進(jìn)行復(fù)配,制備出二者復(fù)配物,研究該復(fù)配物對(duì)ABTS+、DPPH自由基清除能力,以及對(duì)糖尿病關(guān)鍵酶(α-淀粉酶、蔗糖酶和麥芽糖酶)體外抑制活性,為開發(fā)抗氧化、降血糖多功能復(fù)合劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉提取物和茶多酚 分別購自西安圣青生物科技有限公司和成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司,其主要活性成分及含量如表1所示。

表1 原料的主要活性成分及含量Table 1 The bioactive constituents and content of raw materials

維生素C、豬胰腺α-淀粉酶(Type VI-B，50 U/mg)、ABTS(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))、DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl) Sigma-Aldrich公司;阿卡波糖片(批號(hào):19990205,規(guī)格:50 mg/片) 拜耳醫(yī)藥保健有限公司;Glucose C-Ⅱ Test Wako kit(葡萄糖檢測(cè)試劑盒) Wako Pure公司;健康SD大鼠(體質(zhì)量180～200 g) 廣州中藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;其他試劑 均為分析純。

FSH-2A高速勻漿機(jī) 常州市偉嘉儀器制造有限公司;TGL16M/MR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南邁達(dá)儀器有限公司;Scinentz-z18NZ冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;SpectraMax? i3多功能酶標(biāo)儀 Molecular Devices公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MLE和TP單獨(dú)作用溶液的配制 分別稱取50 mg的MLE和TP,加入10 mL的去離子水配制成5 mg/mL的樣品溶液。將MLE和TP樣品溶液稀釋成合適的濃度進(jìn)行ABTS+自由基和DPPH自由基清除能力和糖尿病關(guān)鍵酶(豬胰腺α-淀粉酶、鼠小腸蔗糖酶和麥芽糖酶)活性抑制的測(cè)定。具體如下:

DPPH自由基清除能力測(cè)定:取MLE和TP樣品稀釋液0.0001、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1 mg/mL的濃度進(jìn)行測(cè)定。

ABTS+自由基清除能力測(cè)定:由于低濃度的MLE清除ABTS+自由基效果較弱,取0.005、0.01、0.05、0.1、0.4、0.7、1 mg/mL的MLE進(jìn)行,TP所取的濃度與上述DPPH自由基清除能力測(cè)定的濃度相同。

α-淀粉酶活性抑制的測(cè)定:取MLE和TP稀釋液0.01、0.1、0.5、1、3、5 mg/mL的濃度進(jìn)行測(cè)定。

蔗糖酶活性抑制的測(cè)定:取0.001、0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5 mg/mL的MLE和TP溶液進(jìn)行測(cè)定。

麥芽糖酶活性抑制的測(cè)定:取0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 mg/mL的MLE和TP溶液進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 MLE和TP復(fù)配物的配制 以MLE和TP質(zhì)量比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3制取二者的復(fù)配物,MLE與TP復(fù)配物的組成見表2。根據(jù)MLE和TP單獨(dú)作用時(shí)的抗氧化活性和糖尿病關(guān)鍵酶活性抑制測(cè)定的結(jié)果,配制適當(dāng)?shù)目傎|(zhì)量濃度為0.001 mg/mL和1 mg/mL的復(fù)配液。取濃度為0.001 mg/mL的復(fù)配液進(jìn)行DPPH和ABTS+自由基清除能力測(cè)定,并與MLE和TP單獨(dú)作用的結(jié)果相比較,然后選取自由基清除能力最佳的復(fù)配物進(jìn)行其他濃度的活性追蹤;取1 mg/mL的復(fù)配液對(duì)三種糖尿病關(guān)鍵酶抑制活性的測(cè)定,與MLE和TP單獨(dú)作用的效果相比較,選取其中酶抑制效果最好的復(fù)配物進(jìn)行其他濃度的活性追蹤。

表2 桑葉提取物與茶多酚復(fù)配物的組成Table 2 Composition of the compounds of MLE and TP

1.2.3 抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 DPPH自由基清除能力測(cè)定參考Brand-Williams等[14]的方法并加以改進(jìn)。精確稱取19.70 mg DPPH試劑,用無水乙醇溶解于250 mL容量瓶中,定容,配制200 μmol/L DPPH工作液。移取1 mL樣品溶液和3 mL DPPH無水乙醇溶液于l0 mL試管中,混勻,室溫下避光放置30 min后,在517 nm處測(cè)定樣品吸光值A(chǔ)i。樣品對(duì)照組用相同體積的無水乙醇代替DPPH,吸光值用Aj表示;空白組以無水乙醇代替樣品溶液,用A0表示,同時(shí)以相同濃度的VC作為控制對(duì)照組。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式(1)

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定 ABTS+自由基清除能力測(cè)定參考Roberta Re[15]方法并加以改進(jìn)。ABTS+使用液配制方法:將5 mL ABTS溶液(7 μmol/L)和5 mL K2S2O8溶液(2.45 μmol/L)避光反應(yīng)12 h后生成,該使用液提前1 d配制,并且必須當(dāng)天使用。使用前用水稀釋到吸光值在732 nm處為0.70±0.02。移取0.4 mL不同濃度的樣品溶液和3 mL ABTS+使用液于l0 mL試管中,室溫下避光反應(yīng)30 min,于732 nm波長下檢測(cè)樣品吸光值A(chǔ)1,用相同體積的樣品溶劑代替樣品溶液作為對(duì)照,吸光值為A0,以相同濃度的VC作為控制對(duì)照組。計(jì)算公式為:

ABTS+自由基清除率(%)=[1-(A1-A0)/A0]×100

式(2)

1.2.4 降血糖活性測(cè)定

1.2.4.1α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定參考Chen[16]方法稍作修改。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.9)配制1%(w/v)馬鈴薯淀粉并煮沸15 min作為底物。淀粉酶溶液用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.9)配制成所需濃度。取0.5 mLα-淀粉酶溶液(1 U/mL)于試管中,加入0.5 mL樣品溶液,在37 ℃水浴中孵化10 min后,添加底物0.5 mL可溶性淀粉溶液,在25 ℃室溫下反應(yīng)10 min。最后,加入1 mL DNS試劑[20 mL 96 μmol/L 3,5-二硝基水楊酸(用水配制)與8 mL 5.315 mol/L酒石酸鉀鈉(用2 mol/L NaOH配制),再用12 mL去離子水稀釋]。將試管放入沸水浴中,滅酶5 min,冷卻后加入5 mL去離子水稀釋,在520 nm波長下檢測(cè)樣品吸光值為A1。以相同濃度的阿卡波糖為陽性對(duì)照,同時(shí)設(shè)定樣品對(duì)照組(樣品+緩沖液+底物),吸光值為A2;空白組(緩沖液+酶液+底物)及空白對(duì)照組(緩沖液+緩沖液+底物),吸光值分別為A3、A4。抑制劑對(duì)α-淀粉酶抑制率的計(jì)算公式為:

α-淀粉酶抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100

式(3)

1.2.4.2 蔗糖酶和麥芽糖酶的制備 蔗糖酶和麥芽糖酶的制取方法參考GU Shu-Jing[17]的方法并稍作修改。將健康大鼠禁食12 h后,放血處死,取其小腸置于含pH6.9,0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液的培養(yǎng)皿漂洗,反轉(zhuǎn)小腸內(nèi)腔,剝離小腸刷狀緣膜,拭干,按W∶V=1∶5加入磷酸鹽緩沖溶液后勻漿,以上操作在冰浴下完成。將收集到的液體在4 ℃條件下離心(11000 r/min,30 min),取上清液加入固體硫酸銨使溶液達(dá)到飽和,靜置過夜,將其在4 ℃條件下離心(11000 r/min,30 min),棄上清液,取沉淀用緩沖液溶解,置于同樣的緩沖液中透析,最終所得溶液為酶液,放置-80 ℃冰箱備用。二糖酶活力單位的定義:在37 ℃、pH6.0的條件下,每毫克蛋白內(nèi)容物每分鐘水解1 nmol相應(yīng)底物作為1個(gè)酶活力單位(U)。蛋白定量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.2.4.3 蔗糖酶和麥芽糖酶抑制活性的測(cè)定 蔗糖酶和麥芽糖酶抑制活性的測(cè)定參考文獻(xiàn)[18]的方法稍作修改。蔗糖、麥芽糖和樣品均用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液配成所需濃度。吸取0.5 mL樣品溶液于試管中,加入底物(0.2 mL的3.5 mmol/L麥芽糖溶液,或0.5 mL的56 mmol/L蔗糖溶液),搖勻,在37 ℃條件下水浴孵化5 min。然后加入0.5 mL的酶溶液,37 ℃條件下繼續(xù)反應(yīng)20 min。最后,將試管放入沸水中滅酶5 min。冷卻后用葡萄糖檢測(cè)試劑盒在505 nm處檢測(cè)樣品吸光值為A1。以相同濃度的阿卡波糖為陽性對(duì)照,同時(shí)設(shè)定樣品對(duì)照組(樣品+緩沖液+底物),吸光值為A2;空白組(緩沖液+酶液+底物)及空白對(duì)照組(緩沖液+緩沖液+底物),吸光值分別為A3、A4。樣品抑制劑對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶抑制率計(jì)算公式為:

蔗糖酶/麥芽糖酶抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100

式(4)

1.2.5 聯(lián)合指數(shù)(Combination Index,CI) 為了判斷MLE與TP的復(fù)配物是否具有協(xié)同作用,根據(jù)Chou Ting-Chao[19]藥物聯(lián)合作用原理,用聯(lián)合指數(shù)(CI)判定藥物1和藥物2聯(lián)合作用效果,CI<1為協(xié)同作用;CI=1為疊加作用;CI>1為拮抗作用。

聯(lián)合指數(shù)(CI)=D1/Dx1+D2/Dx2

式(5)

注：式中D1、D2分別是藥物1和藥物2聯(lián)合作用抑制率為50%時(shí)的作用濃度;Dx1、Dx2是藥物1和藥物2單獨(dú)作用時(shí)的作用抑制率為50%時(shí)的作用濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有的數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次,各組數(shù)據(jù)均以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示,用Excel 2010、Origin 8.0和SPSS 20.0等軟件處理,Duncan’s multiple range test分析差異顯著性(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性分析

2.1.1 DPPH自由基的清除作用

2.1.1.1 MLE和TP對(duì)DPPH自由基的清除作用 由圖1可知,TP和MLE都具有一定的清除DPPH自由基效果,且在0～0.05 mg/mL的濃度范圍內(nèi),二者清除自由基的能力隨著濃度的增加而顯著上升。在濃度為0.05 mg/mL時(shí),TP、MLE及VC對(duì)DPPH自由基清除率分別為88.86%、36.01%及80.48%。在0.05～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加,TP和MLE對(duì)DPPH自由基的清除能力緩慢增加,且在1.0 mg/mL時(shí),TP、MLE及VC對(duì)DPPH自由基清除率分別為93.96%、68.16%和95.12%?？傮w而言,TP和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力相當(dāng),MLE較弱。

圖1 MLE及TP清除DPPH自由基能力Fig.1 DPPH radical scavenging activities of MLE and TP

2.1.1.2 復(fù)配物對(duì)DPPH自由基的清除作用 總質(zhì)量濃度為0.001 mg/mL的MLE和TP及其復(fù)配物對(duì)DPPH自由基的清除效果如圖2所示。由圖2可知,復(fù)配物MLE∶TP=1∶1和MLE∶TP=1∶3對(duì)DPPH自由基的清除率顯著高于MLE(p<0.05);與TP組比較,復(fù)配物MLE∶TP=1∶3對(duì)DPPH自由基清除率與TP組差異不顯著(p>0.05),其它均顯著較低(p<0.05)。選取抗氧化效果較好的兩組復(fù)配物(MLE∶TP=1∶1和MLE∶TP=1∶3)進(jìn)行其它濃度的抗氧化活力追蹤。

圖2 MLE-TP復(fù)配物清除DPPH自由基能力Fig.2 DPPH radical scavenging activities of MLE-TP compounds

如圖3所示,兩組復(fù)配物對(duì)DPPH自由基清除能力均呈劑量依賴性,且MLE∶TP=1∶1和MLE∶TP=1∶3對(duì)DPPH自由基的半最大效應(yīng)濃度(EC50)分別為0.010 mg/mL和0.008 mg/mL,大于TP(0.004 mg/mL),小于MLE(0.088 mg/mL)。根據(jù)藥物聯(lián)合作用理論計(jì)算聯(lián)合作用指數(shù)CI,復(fù)配物MLE∶TP=1∶1和MLE∶TP=1∶3對(duì)DPPH自由基的CI分別為1.307、1.523 mg/mL。由于CI>1 時(shí),表明MLE和TP復(fù)配的兩組復(fù)配物MLE∶TP=1∶1和MLE∶TP=1∶3對(duì)DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)為拮抗作用。

圖3 MLE和TP及其復(fù)配物清除DPPH自由基能力曲線Fig.3 DPPH radical scavenging activities of MLE,TP and their compounds

2.1.2 ABTS+自由基的清除作用

2.1.2.1 MLE和TP對(duì)ABTS+自由基的清除作用 由圖4可知,TP和MLE具有一定的清除ABTS+自由基效果。在0～0.05 mg/mL的濃度范圍內(nèi),TP對(duì)ABTS+自由基的清除能力隨著濃度的增加而顯著上升,在0.05 mg/mL時(shí),TP和VC對(duì)ABTS+自由基的清除率分別為99.82%和95.76%。與TP相比,在0.05～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi),MLE對(duì)ABTS+自由基的清除能力隨著濃度的增加而緩慢增加,在1.0 mg/mL時(shí),其對(duì)ABTS+自由基的清除率為99.94%。

圖4 MLE及TP清除ABTS+自由基能力Fig.4 ABTS+radical scavenging activities of MLE and TP

2.1.2.2 復(fù)配物對(duì)ABTS+自由基的清除作用 圖5為總濃度0.001 mg/mL 時(shí),MLE和TP及其復(fù)配物對(duì)ABTS+自由基的清除效果。如5圖所示,TP對(duì)ABTS+自由基的清除效果均顯著優(yōu)于五組復(fù)配物(p<0.05),且復(fù)配物均顯著優(yōu)于MLE(p<0.05)。在五組復(fù)配物中,MLE∶TP=1∶1和MLE∶TP=1∶3對(duì)ABTS+自由基的清除率最高,且相當(dāng)。故選取此二組進(jìn)行其它濃度的抗氧化活力追蹤。

圖5 MLE-TP復(fù)配物清除ABTS+自由基能力Fig.5 ABTS+ radical scavenging activities of MLE-TP compounds

如圖6所示,在0～0.1 mg/mL的濃度范圍內(nèi),兩組復(fù)配液對(duì)ABTS+自由基清除能力均高于MLE組,低于TP組。且MLE∶TP=1∶1和MLE∶TP=1∶3對(duì)ABTS+自由基的EC50分別為0.010和0.003 mg/mL,大于TP(0.002 mg/mL),小于MLE(0.120 mg/mL)。經(jīng)計(jì)算,MLE∶TP=1∶1和MLE∶TP=1∶3兩組復(fù)配物對(duì)ABTS+自由基的CI分別為1.525、1.131 mg/mL,表明MLE∶TP=1∶1和MLE∶TP=1∶3對(duì)ABTS+自由基的清除能力表現(xiàn)為拮抗作用。

圖6 MLE和TP及其復(fù)配物清除ABTS+自由基能力Fig.6 ABTS+ radical scavenging activities of MLE,TP and their compounds

2.2 降血糖活性分析

2.2.1α-淀粉酶抑制作用

2.2.1.1 MLE和TP對(duì)α-淀粉酶抑制作用 人體胰臟中的α-淀粉酶是水解淀粉最主要的酶。機(jī)體攝入的淀粉由α-淀粉酶進(jìn)行初步水解生成葡萄糖和低聚糖,為淀粉的完全水解增加血糖做出重要的第一步。因此,通過抑制α-淀粉酶的活性可以對(duì)糖尿病的治療產(chǎn)生有效的作用[20]。圖7為MLE和TP對(duì)α-淀粉酶的抑制率曲線圖,以阿卡波糖為陽性對(duì)照。由圖可知,MLE及TP對(duì)α-淀粉酶具有一定的抑制效果,在研究的濃度范圍內(nèi),酶活的抑制率隨著樣品濃度的增加而增大。當(dāng)濃度增加至5 mg/mL時(shí),MLE、TP及阿卡波糖的抑制率分別為50.39%、89.63%及94.47%。

圖7 MLE及TP對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.7 Inhibition effects of MLE and TP on α-amylase

2.2.1.2 復(fù)配物對(duì)α-淀粉酶抑制作用 圖8是總濃度為1 mg/mL 的不同配比復(fù)配物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用。在總濃度為1 mg/mL的條件下,五組復(fù)配物對(duì)α-淀粉酶抑制作用都顯著強(qiáng)于MLE(p<0.05);其中,只有復(fù)配物MLE∶TP=2∶1對(duì)α-淀粉酶抑制作用顯著強(qiáng)于TP(p<0.05)。因此,選取復(fù)配物MLE∶TP=2∶1進(jìn)行活性追蹤。

圖8 MLE-TP復(fù)配物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.8 Inhibition effects of MLE-TP compounds on α-amylase

如圖9所示,在濃度0～3 mg/mL范圍內(nèi),各組樣品對(duì)α-淀粉酶抑制作用隨著濃度的增加而增加,且MLE∶TP=2∶1對(duì)α-淀粉酶抑制作用明顯高于任一單一組分。當(dāng)濃度為3 mg/mL時(shí),MLE∶TP=2∶1、MLE及TP組對(duì)α-淀粉酶的抑制率分別為70.87%,37.98%及60.52%。此外,MLE∶TP=2∶1對(duì)α-淀粉酶的IC50為1.707 mg/mL,小于MLE(5.102 mg/mL)及TP組(1.847 mg/mL)。經(jīng)計(jì)算,復(fù)配物MLE∶TP=2∶1對(duì)α-淀粉酶的CI為0.531,小于1,表明在該配比之下MLE和TP復(fù)配使用對(duì)α-淀粉酶具有協(xié)同抑制作用。

圖9 MLE、TP及其復(fù)配物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.9 Inhibition effects of MLE,TP and their compounds on α-amylase

2.2.2 蔗糖酶抑制作用

2.2.2.1 MLE和TP對(duì)蔗糖酶抑制作用 二糖酶如蔗糖酶和麥芽糖酶主要存在于小腸細(xì)胞刷狀緣膜上,是參與碳水化合物代謝的關(guān)鍵酶。碳水化合物水解過程中產(chǎn)生的二糖通過二糖酶的作用水解為單糖被機(jī)體吸收,從而導(dǎo)致餐后血糖水平的升高。有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病病理狀態(tài)下腸道中二糖酶的活性較于正常狀態(tài)下明顯增強(qiáng)[21-22],加速葡萄糖的生成和吸收,進(jìn)而致使血糖急劇升高。因此,通過抑制腸道中二糖酶的活性,有助于延緩碳水化合物的水解和吸收的過程,控制餐后血糖水平,這對(duì)糖尿病患者的治療具有著重要意義。圖10為MLE及TP對(duì)蔗糖酶的抑制率曲線圖,MLE及TP對(duì)蔗糖酶活性表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在0～1 mg/mL濃度范圍,二者對(duì)蔗糖酶的抑制率隨著濃度的增加顯著增加,且MLE對(duì)蔗糖酶的抑制率要強(qiáng)于TP。當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí),MLE和TP對(duì)蔗糖酶的抑制率分別為92.47%和89.07%。在1～3 mg/mL濃度范圍,二者對(duì)蔗糖酶的抑制作用相當(dāng),且無明顯變化。

圖10 MLE及TP對(duì)蔗糖酶的抑制作用Fig.10 Inhibition effects of MLE and TP on sucrase

2.2.2.2 復(fù)配物對(duì)蔗糖酶抑制作用 總濃度為1 mg/mL的不同配比的復(fù)配物對(duì)蔗糖酶抑制作用如圖11所示,五組復(fù)配物對(duì)蔗糖酶抑制作用都顯著強(qiáng)于TP(p<0.05),其中,MLE∶TP=3∶1、MLE∶TP=2∶1、MLE∶TP=1∶1及MLE∶TP=1∶3這四組對(duì)蔗糖酶抑制率略微高于MLE,選取其中對(duì)蔗糖酶抑制效果最強(qiáng)的復(fù)配物MLE∶TP=1∶1進(jìn)行活性追蹤。

圖11 MLE-TP復(fù)配物對(duì)蔗糖酶的抑制作用Fig.11 Inhibition effects of MLE-TP compounds on sucrase

由圖12可知,MLE∶TP=1∶1對(duì)蔗糖酶抑制作用強(qiáng)于任一單組分,且在0～0.4 mg/mL濃度范圍,復(fù)配組對(duì)蔗糖酶抑制作用隨著濃度的增加顯著增強(qiáng);在0.4～2 mg/mL范圍,緩慢增加。在0.4 mg/mL時(shí),MLE∶TP=1∶1、MLE及TP對(duì)蔗糖酶的抑制率為91.63%、87.8%及62.63%。此外,MLE∶TP=1∶1的蔗糖酶的IC50為0.026 mg/mL,均小于阿卡波糖、MLE及TP(0.035 mg/mL、0.034 mg/mL及0.276 mg/mL)。MLE∶TP=1∶1的聯(lián)合指數(shù)CI為0.429,小于1,表明MLE與TP的復(fù)配物MLE∶TP=1∶1對(duì)蔗糖酶具有協(xié)同抑制作用。

圖12 MLE、TP及其復(fù)配物對(duì)蔗糖酶的抑制作用Fig.12 Inhibition effects of MLE,TP and their compounds on sucrase

2.2.3 麥芽糖酶抑制作用

2.2.3.1 MLE和TP對(duì)麥芽糖酶抑制作用 圖13為MLE及TP對(duì)麥芽糖酶的抑制率曲線圖,由圖可知MLE及TP對(duì)蔗糖酶表現(xiàn)出顯著的抑制效果。當(dāng)MLE及TP從0增加到1 mg/mL時(shí),二者對(duì)蔗糖酶活的抑制作用顯著增強(qiáng),隨后無明顯變化。在1 mg/mL時(shí),MLE對(duì)麥芽糖酶抑制率分為95.35%,高于阿卡波糖(92.30%),TP為85.84%。

圖13 MLE及TP對(duì)麥芽糖酶的抑制作用Fig.13 Inhibition effects of MLE and TP on maltase

2.2.3.2 復(fù)配物對(duì)麥芽糖酶抑制作用 圖14是總濃度為1 mg/mL 的不同配比的復(fù)配物對(duì)麥芽糖酶抑制率,五組復(fù)配物對(duì)麥芽糖酶抑制作用都顯著強(qiáng)于TP(p<0.05)。其中,有三組復(fù)配物顯著強(qiáng)于MLE(p<0.05),即MLE∶TP=3∶1、MLE∶TP=2∶1和MLE∶TP=1∶1。選取其中對(duì)麥芽糖酶抑制效果最強(qiáng)的復(fù)配物MLE∶TP=1∶1進(jìn)行活性追蹤。

圖14 MLE-TP復(fù)配物對(duì)麥芽糖酶的抑制作用Fig.14 Inhibition effects of MLE-TP compounds on maltase

由圖15可知,MLE∶TP=1∶1對(duì)麥芽糖酶抑制作用強(qiáng)于MLE及TP,且MLE∶TP=1∶1對(duì)麥芽糖酶的IC50為0.023 mg/mL,均小于阿卡波糖、MLE及TP(0.051 mg/mL、0.036 mg/mL及0.087 mg/mL)。MLE∶TP=1∶1的聯(lián)合指數(shù)CI為0.452,小于1,表明MLE與TP的復(fù)配物MLE∶TP=1∶1對(duì)蔗糖酶具有協(xié)同抑制作用。

圖15 MLE、TP及其復(fù)配物對(duì)麥芽糖酶的抑制作用Fig.15 Inhibition effects of MLE,TP and their compounds on maltase

3 結(jié)論

MLE、TP及其復(fù)配物都具有一定的清除ABTS+和DPPH自由基效果,TP效果最佳。MLE-TP復(fù)配物對(duì)ABTS+和DPPH自由基的清除能力大于MLE,但其對(duì)清除ABTS+和DPPH自由基的聯(lián)合指數(shù)CI均大于1,MLE-TP聯(lián)合抗氧化具有拮抗作用。

MLE、TP及其復(fù)配物均表現(xiàn)出顯著的糖尿病關(guān)鍵酶抑制作用,且MLE-TP復(fù)配物對(duì)糖尿病關(guān)鍵酶的抑制效果優(yōu)于單樣品。MLE∶TP=2∶1對(duì)a-淀粉酶的抑制效果最佳,其聯(lián)合指數(shù)為0.531;MLE∶TP=1∶1對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制作用最強(qiáng),其聯(lián)合指數(shù)CI分別為0.429和0.452。這表明MLE-TP復(fù)配物可以提高糖尿病關(guān)鍵酶的抑制效果,具有協(xié)同降血糖的作用。MLE和TP的協(xié)同降糖功效,為開發(fā)安全和高效的天然降血糖功能食品和相關(guān)藥物提供理論依據(jù)。