9型腺相關病毒介導RNA干擾抑制p65基因表達對血管緊張素Ⅱ誘導H9c2細胞凋亡的影響*

邢夢瑤， 馬小娟， 鞏雪俐， 買買提祖農·買蘇爾， 于文燕， 張雪梅， 孫 湛

(新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院， 新疆 烏魯木齊 830011)

心力衰竭(簡稱心衰; heart failure，HF)是一種嚴重的臨床綜合征，是各種嚴重心臟病的嚴重階段[1]，有著極高的死亡率，是當今最為重要的心血管病之一。 因此，尋求新的干預措施以改善心衰患者的預后及生存率是醫(yī)學界亟待解決的問題。眾多研究表明NF-κB信號通路參與了心衰、冠心病和高血壓等多類心血管疾病的病理生理過程。不少研究人員認為NF-κB中p65的激活很有可能是心血管炎性等疾病的共同發(fā)生發(fā)展環(huán)節(jié)，通常涉及到造成心臟損傷的不利影響[2]。 前期研究發(fā)現(xiàn)，下調p65后可提高心肌細胞抗氧化的能力[3]，抑制p65蛋白的表達可抑制NF-κB通路的激活。我們需尋找一種能有效抑制NF-κB通路中p65蛋白表達的方法來減輕心力衰竭等心血管疾病的病情。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠心室肌細胞H9c2由上海中科院細胞庫提供。rAAV9-eGFP-p65-siRNA(本實驗室設計構建，Virovek生產)。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS; Gibco)；DMEM高糖培養(yǎng)液(HyClone)；細胞質蛋白/核蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白定量分析試劑盒(Sigma)；Western blot試劑盒(Cell Signaling Technology)；凋亡試劑盒(BD Pharmingen)。Heracell二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)；DM4000B型倒置熒光顯微鏡(LEICA)；EPICS ALTRA流式細胞儀(Beckman Coulter)。Quantity One分析軟件(Bio-Rad)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) H9c2細胞用含有雙抗及10% FBS的 DMEM 高糖培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內。待細胞長到密度大概為培養(yǎng)瓶的80%～90%后用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液后進行傳代，每次傳代時細胞密度控制在1×108/L。傳3～5代。

2.2細胞分組 將H9c2細胞分為：(1)正常對照(blank control)組； (2)Ang II刺激(Ang II)組； (3)rAAV9-eGFP-p65-siRNA組；(4)rAAV9-eGFP+Ang II組；(5)rAAV9-eGFP組；(6)rAAV9-eGFP-p65-siRNA+Ang II組。

2.3病毒轉染 將處理好的第2代或第3代融合約80%～90%的 H9c2細胞消化、計數， 分別接種于25 mm2培養(yǎng)瓶中，濃度約為1×105。加入含有10% FBS的 DMEM進行細胞培養(yǎng)，幾乎所有細胞貼壁后取出培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，按不同的感染復數(multiplicity of infection，MOI)把細胞分為5組：MOI=0 vg/cell的細胞組(對照組)，即未轉染病毒組； MOI=1×106vg/cell的細胞組； MOI=2×106vg/cell的細胞組； MOI=4×106vg/cell的細胞組； MOI=5×106vg/cell的細胞組。按 MOI不同分別加入不同滴度的用 DMEM培養(yǎng)液稀釋的 rAAV9-eGFP-p65-siRNA或 rAAV9-eGFP病毒液約1 mL，每組細胞做3個復樣。將細胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，每30 min十字晃動幾下，3～4 h后，在原有液體的基礎上繼續(xù)加入適量 FBS及DMEM， 使 FBS終濃度達到10%。培養(yǎng)24 h后起，應用熒光倒置顯微鏡觀察，MOI=0 vg/cell作為對照組，于轉染后第1、2、3、4、5、6和7 d進行細胞形態(tài)和生長的觀察，以波長為490 nm的藍色光激發(fā)出綠色熒光的 H9c2細胞為陽性細胞，按一個隨機高倍視野下計數200個細胞中陽性細胞的個數計算出平均百分率(重復6次)，并照相記錄。

2.4流式細胞術檢測轉染效率 在eGFP表達高峰時間分別收集實驗組及對照組中H9c2細胞，離心，PBS洗滌2次后充分吹散細胞，200目濾網濾過，無需加抗體，直接用流式細胞術檢測rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP對H9c2細胞的轉染效率，上述實驗重復3次。

2.5CCK-8檢測病毒對細胞活力影響 向96孔板中加入100 μL的H9c2細胞懸液，密度大約為5×106/L，放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h(37 ℃、5% CO2)，分別加入rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP進行處理，120 h后每孔加入10 μL的CCK-8，孵育2～3 h后用酶標儀測定吸光度A(450 nm)值，上述實驗重復3次。

2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 收集實驗組及對照組中H9c2細胞，離心，PBS洗滌2次后加入400 μL PBS充分吹散細胞，200目濾網濾過，加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD)，室溫下避光孵育15 min，直接上流式細胞儀檢測，每組重復3次。

2.7Western blot檢測蛋白水平 每條電泳道取 30 μg 提取的細胞總蛋白，以SDS-PAGE分離，然后再將蛋白通過電泳，轉至PVDF膜上，之后用1% TBST洗膜，再用 10%封閉液將其封閉，加入 抗NF-κB 抗體(p65 抗體)，在4 ℃冰箱孵育過夜，次日，洗膜后加入適量的 II 抗工作液，顯色。采用化學發(fā)光法檢測、拍照，計算目的蛋白的積分光密度值，并與內參照GAPDH比較，計算并進行統(tǒng)計學分析。圖像上的每個條帶重復測量 3 次，結果以積分吸光度值表示并記錄。

3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0及GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 轉染后大鼠心肌細胞H9c2中eGFP表達情況及細胞生長形態(tài)的觀察

rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP轉染H9c2細胞后，在倒置熒光顯微鏡490 nm藍光激發(fā)下呈綠色。轉染后48 h，細胞中eGFP開始表達，表達強度隨時間的推移而增強，轉染后120 h達到高峰，之后開始逐漸減弱。整個觀察周期過程中細胞狀態(tài)良好，見圖1。

Figure 1.The expression of eGFP in H9c2 cells (120 h after transfection; ×200; MOI=4×106 vg/cell).

2 流式細胞術檢測H9c2細胞的轉染效率

轉染后分別收集對照組和實驗組細胞，流式細胞術結果表明，rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP轉染H9c2細胞120 h的轉染率最高，分別為(53.4±1.8)%和(52.7±1.9)%，見表1。

表1 細胞轉染效率

3 CCK-8法檢測細胞活力

對照組和實驗組結果比較，各時點轉染和未轉染rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP的細胞生長情況相似，差異無統(tǒng)計學顯著性，說明轉染rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP均對H9c2細胞生長均無明顯影響，無明顯細胞毒性，見圖2。

Figure 2.The viability of H9c2 cells measured by CCK-8 assay. Mean±SD. n=6.

4 流式細胞術檢測細胞凋亡

Ang II組和rAAV9-eGFP+Ang II組的細胞凋亡率分別為(20.3±1.4)%和(18.3±1.9)%，和對照組相比凋亡率明顯上升(P<0.05)；而rAAV9-eGFP-p65-siRNA和rAAV9-eGFP-p65-siRNA+Ang II組的凋亡率明顯下降，且和其它4組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

5 Western blot 檢測p65表達情況

正常對照組中，p65有一定的表達，當給予rAAV9-eGFP-p65-siRNA的干擾時，p65表達降低(P<0.05)。當給予Ang II刺激時，p65的表達較對照組增加(P<0.05)，但給予rAAV9-eGFP-p65-siRNA干擾后再給予Ang II刺激時，p65的表達不但不會增加，反而會降低。而rAAV9-eGFP對p65的表達無顯著影響，見圖4。

Figure 4.Western blot for determining the protein expression of p65 in the H9c2 cells. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs blank control group.

討 論

心力衰竭是心臟癥候群的終末期表現(xiàn)，其心臟不能為身體提供足夠的血液供應，通常是由于左心室功能障礙，是最終導致心血管疾病患者死亡的最主要原因之一[4]。越來越多的證據表明[1]，NF-κB信號通路的激活與心力衰竭等多種心血管疾病有著密切的聯(lián)系。而NF-κB是一種廣泛存在于細胞內的具有多向轉錄調節(jié)功能的關鍵因子，目前為止，已發(fā)現(xiàn)至少 5 個NF-κB家族成員，即c-Rel、p50、p52、p65 和RelB。細胞中發(fā)揮主要生理作用的是p65。NF-κB的過度活化可以引起多種疾病，若是能對其進行有效的拮抗，便可對心血管炎癥反應、惡性腫瘤等多種相關疾病的治療帶來突破性進展[5]。因此調節(jié)和控制NF-κB通路中 p65的活性是一個理想的治療靶向，將通過多重環(huán)節(jié)起效，達到治療NF-κB相關疾病的目的。已有研究證實重組9型腺相關病毒載體(rAAV9-eGFP)對心肌有極強的靶向親和力[6-7]，可長期穩(wěn)定地表達外源基因[8]。心力衰竭是一個慢性的過程，所以rAAV9-eGFP成為目前心臟疾病基因治療的最佳載體。

高效特異性的 RNAi 技術目前已被廣泛的應用于許多領域，比如基因功能研究、抗病毒感染和抗腫瘤等，具有高度特異性，高效性，快速性，長度、濃度依賴性及高穩(wěn)定性等優(yōu)勢。據此，本實驗通過將重組腺相關病毒 rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA轉染大鼠心肌H9c2細胞后，靶向抑制 NF-κB 通路活性，在細胞水平研究靶向抑制 NF-κB 信號通路中p65的活性對心肌細胞凋亡的作用及細胞學機制，為防治心力衰竭發(fā)生提出新方案。

此實驗證實rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA成功轉染細胞后，第2天開始熒光表達，第5天達到高峰，并且Western blot結果顯示p65蛋白表達量呈下降趨勢，說明腺相關病毒介導的siRNA技術能有效地抑制大鼠心肌H9c2細胞NF-κB通路中 p65的表達。

Ang II刺激心肌細胞可分泌多種細胞因子，這些因子以旁分泌或自分泌的方式調控心肌細胞自身和周圍的心肌細胞代謝結構功能而參與心肌重構。另據研究表明，NF-κB與血管緊張素II也存在密切的相關性[9]，可共同激活多種核轉錄因子。資料顯示，Ang II在刺激24 h、10-6mol/L 的濃度下時對細胞的刺激作用最強，因此本實驗用此時間和濃度下的Ang II作為刺激因子[10]。

細胞給予Ang II刺激，細胞p65的表達量較空白對照組增高。在給予rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA轉染的前提下，再使用Ang II刺激，p65蛋白表達量未見明顯升高，進一步說明腺相關病毒介導的RNA干擾技術能有效沉默p65。p65表達的有效沉默是本實驗的基礎，為后續(xù)實驗奠定了良好的基礎。

細胞凋亡是其自身進行的一種程序性的死亡方式。 在心肌梗死、缺血再灌注損傷等可發(fā)展為心力衰竭的多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中都伴有心肌細胞的凋亡[11]。在各種心血管疾病的發(fā)病機制和預后中發(fā)揮著重要的作用[12]。有研究表明[13]，Ang II刺激會誘導細胞凋亡，同時NF-κB也是參與細胞凋亡的關鍵因子[14]，其在炎癥、免疫反應、腫瘤發(fā)生和防止細胞凋亡中起著關鍵的作用[15-17]，因為它激活許多基因的轉錄，從而參與細胞凋亡[18]。NF-κB通路被激活后向核內轉移，p65表達量增加，抗凋亡作用減弱，同時激活各種炎性因子的產生，而這些炎性因子又不斷刺激NF-κB的活化，導致細胞凋亡增加[19]。因此下調NF-κB通路的活性，可減輕心肌細胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)重組腺相關病毒 rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA轉染大鼠心肌H9c2細胞后，p65表達降低，細胞的凋亡減少，可有效減少因細胞凋亡引起的細胞數量減少。

綜上所述，本研究利用RNA干擾技術，重組9型腺相關病毒作為載體可以成功、高效地沉默心肌細胞中的p65表達，并且證實利用rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA轉染大鼠心肌H9c2細胞可以明顯地降低細胞凋亡率，這為后期心力衰竭等心血管疾病的相關防治研究提供了有力的條件。