臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療子宮切口瘢痕缺陷大鼠的療效觀察*

羅惠娟， 王 寧， 周 娟， 湯小湄， 陳宇毅， 羅文斌， 肖小敏△

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科， 廣東 廣州 510632; 2深圳市第二人民醫(yī)院產(chǎn)科， 廣東 深圳 518035)

我國(guó)是全球剖宮產(chǎn)率最高的國(guó)家之一，剖宮產(chǎn)率從上世紀(jì)70年代的5%增長(zhǎng)到2007～2008年的46.2%，不少地區(qū)甚至超過(guò)60%[1]。2014年全國(guó)剖宮產(chǎn)率已高達(dá)54%[2]。剖宮產(chǎn)相關(guān)的并發(fā)癥也增加，其中子宮切口瘢痕缺陷(previous cesarean scar defect，PCSD)是剖宮產(chǎn)術(shù)后，子宮下段由于切口部位血腫或感染導(dǎo)致愈合不良，切口肌層薄弱而形成的凹陷，發(fā)病率為20%～60%[3]，宮腔鏡診斷的發(fā)生率可高達(dá)75%[4]。目前對(duì)于PCSD的治療主要為手術(shù)：包括宮腹腔鏡聯(lián)合手術(shù)、經(jīng)陰道手術(shù)和開腹手術(shù)，成功的概率約60%～87%[5-6]。雖然手術(shù)治療提高了再次妊娠的機(jī)會(huì)，并減少了妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，但需要2年的恢復(fù)期才能再次妊娠。隨著二胎政策的開放，許多高齡的PCSD婦女有盡早妊娠的強(qiáng)烈要求，也有許多PCSD患者不能接受有創(chuàng)修復(fù)手術(shù)。本研究利用干細(xì)胞的多向分化潛能嘗試修復(fù)PCSD模型大鼠，為PCSD患者尋找一種無(wú)創(chuàng)、高效的治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

SPF級(jí)SD雌性大鼠60只, 6～8周齡，體重(180±220) g，SD雄性大鼠15只, 8～10周齡，體重(230±260) g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為44005800003952。

臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞(Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells，WJMSCs)購(gòu)于Cyagen。收到細(xì)胞后立即復(fù)蘇，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱，以1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每3 d傳代 1次，使用當(dāng)天用生理鹽水稀釋至1×109/L待用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1PCSD大鼠制模方法 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定子宮肌壁注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS; 1 g/L，1 mL/kg)聯(lián)合電頻離子治療儀電凝子宮切口兩側(cè)(功率為10 W)，3-0可吸收線間斷縫合子宮切口，可以達(dá)到較高PCSD模型SD大鼠成功率(80%)。

2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組和處理 雌雄鼠2∶1同籠，陰道拭子見精子即標(biāo)記為妊娠第0天，1只未成功妊娠，余59只孕鼠隨機(jī)分3組，分別為正常手術(shù)(normal operation,N-O)組11只，模型組48只,所有孕鼠均在孕第19天進(jìn)行剖宮產(chǎn)。N-O組：子宮系膜對(duì)側(cè)緣從宮角至宮頸縱剖雙側(cè)子宮，取出鼠仔和胎盤，3-0可吸收線連續(xù)縫合子宮切口，逐層關(guān)腹。模型組：行剖宮產(chǎn)后切口兩側(cè)肌壁注射LPS，同時(shí)用電頻離子治療儀電凝子宮切口兩側(cè)，縫合及關(guān)腹同上。N-O組術(shù)后大鼠無(wú)死亡，模型組術(shù)后8 只大鼠24 h內(nèi)死亡，存活40只，考慮為L(zhǎng)PS導(dǎo)致敗血癥。隨機(jī)剔除N-O組1只，最終進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的N-O組10只，模型組隨機(jī)分模型對(duì)照(model control,M-C)組20只和模型治療(model treatment,M-T)組20只。其中M-T組又隨機(jī)分成A、B組(n=10)，建模后第4周開始移植WJMSCs。A組尾靜脈注射0.5 mL+宮腔插管灌注 0.5 mL的1×109/L WJMSCs，每周1次，共3次；B組為單純宮腔插管灌注1 mL的1×109/L WJMSCs懸液，每周1次，共3次。M-C組亦隨機(jī)分成A、B組(n=10)，術(shù)后第4周開始用生理鹽水替代WJMSCs進(jìn)行治療。A組予尾靜脈注射0.5 mL+宮腔插管灌注0.5 mL的生理鹽水，每周1次，共3次；B組宮腔插管灌注1 mL的生理鹽水，每周1次，共3次，取標(biāo)本同上。N-O組剖宮產(chǎn)后，常規(guī)飼養(yǎng)。于模型組相對(duì)應(yīng)的時(shí)間取材，即模型組治療結(jié)束后 1和4周，分別隨機(jī)處死6和4只大鼠，取雙側(cè)子宮標(biāo)本備檢。

2.3體視學(xué)分析 所有圖像采用Leica QWin Plus 3計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照和測(cè)試。每組10個(gè)雙角子宮，共20個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選子宮上、中和下段組織1塊進(jìn)行石蠟包埋，固定包埋方向，保證每個(gè)切面都包括完整的子宮橫斷面。標(biāo)本塊連續(xù)切片，再隨機(jī)選片染色備檢：(1)Masson染色：光鏡下可見藍(lán)色膠原纖維和紅色肌纖維，胞核黑藍(lán)色。找到瘢痕區(qū)域，放大100倍拍照，計(jì)算子宮肌層的膠原纖維體積密度(Vv)。(2)細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)免疫組化染色：可見子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞被染成棕黃色顆粒。100倍視野下拍照瘢痕區(qū)域，通過(guò)CK染色定位子宮內(nèi)膜腺上皮，計(jì)算其表面積密度(Sv)、子宮內(nèi)膜厚度(τ)和子宮內(nèi)膜缺陷率。(3)肌動(dòng)蛋白(actin)免疫組化染色：可見子宮肌層細(xì)胞被染成棕黃色顆粒。100倍視野下拍照，評(píng)估子宮肌層actin的Vv。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)推斷采用卡方檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組瘢痕區(qū)的HE染色觀察

治療后1周，N-O組可見子宮肌層稍薄，排列整齊，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。M-C組的A、B 2組相似，肌層變薄，嚴(yán)重者消失，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)增生、水腫，肉芽組織形成。M-T組的A組有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維排列整齊，較M-C組明顯增多；B組肌層較A組稍增厚，見較多的新生毛細(xì)血管。治療后第4周，N-O組肌層較治療后1周時(shí)稍增厚；M-C組和M-T組與治療后1周時(shí)相似，見圖1。

Figure 1.Observation of the scar regions in each group with HE staining (×100). ↑: the myometrium of the scar area.

2 瘢痕區(qū)的Masson染色觀察

治療后1周，N-O組的子宮肌層內(nèi)含少量藍(lán)色膠原纖維，大量的紅色肌纖維，膠原纖維與肌纖維相間排列整齊。M-C 2組的Masson染色相似，肌層內(nèi)含大量藍(lán)色膠原纖維，肌纖維少見甚至消失。M-T 2組均可見膠原纖維較模型對(duì)照組明顯減少，肌纖維增多，排列規(guī)則，且肌層恢復(fù)紅色。治療后4周，各組光鏡下的表現(xiàn)與治療后1周相似,見圖2。

3 瘢痕區(qū)actin的免疫組化染色觀察

治療后1周，N-O組的子宮肌層內(nèi)含有大量棕黃色顆粒的actin，呈條索狀，排列整齊，與內(nèi)膜分界清楚。M-C 2組的actin染色相似，肌動(dòng)蛋白片狀稀疏分布，排列不連續(xù)，與內(nèi)膜分界不清楚。M-T 2組鏡下與正常手術(shù)組相似。治療后4周，各組與治療后1周相似，見圖3。

Figure 2.Observation of the scar areas in each group with Masson staining (×100). ↑: the scar area.

Figure 3.Observation of actin in the scar area with immunohistochemical staining (×100). ↑: the scar area.

4 瘢痕區(qū)CK的免疫組化染色觀察

治療后1周，N-O組子宮內(nèi)膜呈單層柱狀上皮細(xì)胞，排列整齊，形成皺襞，間質(zhì)內(nèi)見單管狀腺體；M-C 2組CK染色相似，子宮內(nèi)膜單層柱狀上皮排列疏松，大片缺失，間質(zhì)內(nèi)含有單管狀腺體;M-T 2組與N-O組相似。治療后4周各組SD大鼠子宮CK免疫組化與治療結(jié)束后1周時(shí)相似，見圖4。

5 瘢痕區(qū)域的體視學(xué)比較

5.1N-O與M-C組子宮體視學(xué)比較 M-C組造模后 7和10周(相當(dāng)于治療結(jié)束后1和4周)的瘢痕區(qū)域肌層厚度和actin Vv較N-O組均顯著減少(P<0.05)，而M-C組的肌層膠原纖維Vv高于N-O組(P<0.05)；2組子宮內(nèi)膜厚度和內(nèi)膜細(xì)胞Sv的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，M-C組內(nèi)膜缺陷率第7和10周都顯著高于N-O組(P<0.05)。N-O組術(shù)后第7和10周的各個(gè)指標(biāo)同組自身比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；M-C組術(shù)后第10周的肌層膠原纖維Vv低于術(shù)后第7周(P<0.05)，顯示建模是成功的,見表1、2。

Figure 4.Observation of CK in the scar area with immunohistochemical staining (×100). ↑: the scar area.

5.2各組治療后1周子宮肌層的體視學(xué)比較 M-C組肌層厚度和actin Vv均顯著低于N-O和M-T各組(P<0.05)；而M-C肌層膠原纖維Vv顯著高于N-O組和M-T各組(P<0.05)；M-T 2組與N-O組比較，肌層厚度和肌層actin Vv的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；但M-T的B組肌層膠原纖維Vv低于N-O組(P<0.05)；M-T 2組間比較，各項(xiàng)指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見表1。

5.3各組治療后4周子宮肌層相關(guān)體視學(xué)比較 M-C組肌層厚度、肌層actin Vv均顯著低于N-O組和M-T各組(P<0.05)；而M-C肌層膠原纖維Vv仍顯著高于N-O組和M-T各組(P<0.05)；M-T各組與N-O組比較，肌層厚度、肌層actin Vv的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,但M-T B組的肌層膠原纖維Vv低于N-O組(P<0.05)。M-T 2組間比較，各指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表1。

5.4治療后1、4周子宮肌層相關(guān)指標(biāo)的體視學(xué)比較 M-C、N-O和M-T同組之間治療后1和4 周的肌層厚度、肌層actin Vv和肌層膠原纖維Vv的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。M-C組的肌層膠原纖維Vv，治療后4周低于1周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但它仍高于N-O組、M-T的A和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

5.5各組子宮內(nèi)膜相關(guān)指標(biāo)的體視學(xué)比較 無(wú)論治療后1還是4周，各組之間內(nèi)膜厚度無(wú)顯著差異，并且各組治療后1、4周自身比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。各組1周的內(nèi)膜細(xì)胞Sv比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；但是M-C組和M-T的B組治療后4周的內(nèi)膜細(xì)胞Sv高于A組(P<0.05)。M-C治療后1周的瘢痕區(qū)域內(nèi)膜缺陷率顯著高于N-O組(P<0.05)，但與M-T組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；治療4周后，M-C組的內(nèi)膜缺陷率顯著高于N-O組(P<0.05)，但與M-T組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；每組治療后1和4周的子宮內(nèi)膜缺陷率自身比較，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表2。

5.6非瘢痕區(qū)域各組各個(gè)指標(biāo)的體視學(xué)比較 無(wú)論是治療后1還是4周，各組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表3。

表1 治療后第1和4周子宮肌層相關(guān)指標(biāo)的體視學(xué)比較

*P<0.05vsN-O group;#P<0.05vs1 week.

表2 各組瘢痕區(qū)子宮內(nèi)膜相關(guān)指標(biāo)的體視學(xué)比較

*P<0.05vsM-C group at the same time;#P<0.05vsgroup A of M-T at the same time.

表3 非瘢痕區(qū)域各組各個(gè)指標(biāo)的體視學(xué)比較

討 論

近幾十年剖宮產(chǎn)率的增加，PCSD作為一種比較常見的剖宮產(chǎn)遠(yuǎn)期并發(fā)癥成為婦產(chǎn)科醫(yī)師關(guān)注的焦點(diǎn)。PCSD患者再次妊娠發(fā)生早產(chǎn)和子宮破裂的風(fēng)險(xiǎn)高，如能找到一種簡(jiǎn)單、有效的修復(fù)和預(yù)防辦法，無(wú)疑會(huì)降低再次妊娠的風(fēng)險(xiǎn)。

隨著干細(xì)胞研究的深入，WJMSCs已被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟疾病、心血管疾病、移植物抗宿主病和自身免疫性疾病等各個(gè)領(lǐng)域。許多研究已提示MSCs具有分化為血管平滑肌細(xì)胞和輸尿管平滑肌的潛力[7]。本課題組在既往的研究中發(fā)現(xiàn)，WJMSCs在輸卵管等生殖器官的炎性損傷中有良好的治療效果[8]，但干細(xì)胞對(duì)于瘢痕子宮的修復(fù)能力，尚未見報(bào)道。目前監(jiān)測(cè)瘢痕子宮愈合狀態(tài)的三維超聲方法存在形態(tài)和功能不符的明顯缺陷。本研究通過(guò)子宮肌壁注射LPS聯(lián)合電凝子宮切緣，建立了PCSD大鼠模型，可以達(dá)到高成功率的子宮肌層受損的目的，是一種有效的建模方法。通過(guò)觀察子宮平滑肌、膠原纖維形態(tài)和子宮內(nèi)膜缺損程度的改變，間接反映子宮肌層和內(nèi)膜的功能，初步探索WJMSCs是否對(duì)PCSD大鼠有修復(fù)和預(yù)防作用。通過(guò)2種不同的移植方式把WJMSCs移植到PCSD大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論在治療后1周還是4周，模型治療組的肌層厚度和肌層actin Vv均顯著高于模型對(duì)照組，可見，WJMSCs可以促進(jìn)瘢痕區(qū)域子宮肌層結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)，此修復(fù)作用可能與WJMSCs可向子宮平滑肌細(xì)胞分化有關(guān)。模型對(duì)照組肌層膠原纖維Vv高于正常手術(shù)組，治療A和B組的肌層膠原纖維Vv顯著低于模型對(duì)照組，可見PCSD大鼠經(jīng)過(guò)WJMSCs 治療，可以抑制瘢痕區(qū)域纖維化的發(fā)生。此結(jié)果與目前研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞可在許多疾病系統(tǒng)中發(fā)揮抗纖維化作用一致[9-11]。本研究結(jié)果也與文獻(xiàn)報(bào)道的使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可促進(jìn)大鼠子宮單純創(chuàng)傷后的再生修復(fù)作用相同[12-13]。2種不同的移植方式相比較，對(duì)PCSD大鼠的修復(fù)效果并無(wú)明顯差別，考慮與WJMSCs的歸巢作用有關(guān)[14]。這也為未來(lái)局部使用干細(xì)胞治療提供思路，避免了全身使用干細(xì)胞治療的一些風(fēng)險(xiǎn)。

細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，作為細(xì)胞骨架對(duì)維持細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)完整性發(fā)揮了重要的作用，在腺上皮內(nèi)也有強(qiáng)的表達(dá)[15]。林娜成等[16]報(bào)道，子宮內(nèi)膜損傷嚴(yán)重程度與子宮內(nèi)膜厚度呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜厚度和內(nèi)膜的Sv，無(wú)論是否治療，各組之間互相比較，還是同組不同時(shí)間的自身比較，均無(wú)顯著差異;但從CK免疫組化實(shí)驗(yàn)可見，模型對(duì)照組的內(nèi)膜的受損傷程度和內(nèi)膜缺陷率明顯較正常手術(shù)組和模型治療組嚴(yán)重，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，可見子宮內(nèi)膜一旦受到損傷，比子宮肌層更難以修復(fù)，原因可能是內(nèi)膜基底層血管受損，可能不利干細(xì)胞的定植和分化，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜重建需要時(shí)間較久甚至無(wú)法修復(fù)。文獻(xiàn)報(bào)道干細(xì)胞在宮腔粘連的治療中是一種非常有效的子宮內(nèi)膜替代再生劑[17]，結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符，增加療程和劑量對(duì)子宮內(nèi)膜的修復(fù)是否有效還待進(jìn)一步研究。

綜上所述，對(duì)PCSD大鼠移植WJMSCs后，子宮肌層變厚，肌纖維明顯增加，膠原纖維減少，內(nèi)膜缺損情況好轉(zhuǎn),可見WJMSCs可促進(jìn)PCSD大鼠子宮肌層結(jié)構(gòu)和功能性的修復(fù)。靜脈+局部聯(lián)合治療和單純陰道治療2種不同的移植方式，對(duì)子宮切口瘢痕缺陷大鼠的修復(fù)作用無(wú)明顯區(qū)別。