Cx43沉默對機械應(yīng)力作用下調(diào)控的軟骨細胞自噬介導(dǎo)軟骨基質(zhì)合成的影響*

張 兵， 劉 琮， 鮑 亮， 周 濤， 周鵬飛， 薛 欣， 趙 晨， 朱 鵬

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨外科， 陜西 西安 710038)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，在老年人中最為常見，其特點是關(guān)節(jié)軟骨受損和功能喪失[1-2]。近年來研究表明自噬在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用[3],自噬可抑制軟骨細胞凋亡[4]，調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因在人軟骨細胞中的表達[5]，還可以減少與軟骨細胞死亡相關(guān)蛋白表達[3]，因此，干預(yù)細胞自噬是防治骨關(guān)節(jié)炎的潛在治療靶點。

力學(xué)刺激可影響細胞生物學(xué)行為的改變，超過一定范圍的機械應(yīng)力抑制軟骨細胞蛋白多糖和II膠原的合成。機械性損傷導(dǎo)致軟骨細胞死亡，并引發(fā)重塑過程，最終可表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)炎。自噬是細胞內(nèi)細胞器和大分子在應(yīng)激反應(yīng)中保護細胞的過程。Caramés等[6]研究發(fā)現(xiàn)機械損傷導(dǎo)致軟骨細胞自噬抑制;自噬保護終板軟骨細胞免受周期性機械張力誘導(dǎo)的鈣化[7]；通過增強自噬保護軟骨細胞和基質(zhì)是一種新的軟骨保護方法[6]。

縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)在維持關(guān)節(jié)軟骨代謝平衡、結(jié)構(gòu)和功能等方面發(fā)揮著重要的作用[8]，與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[9]。骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨細胞中Cx43高表達[10-11]。在高強度的機械應(yīng)力下，Cx43在軟骨細胞中的表達增加[12]，且Cx43與前自噬體結(jié)構(gòu)相關(guān)，負調(diào)節(jié)自噬[13]。然而，Cx43是否影響機械應(yīng)力刺激下軟骨細胞自噬尚未見報道。因此，本文旨在探討Cx43沉默對機械應(yīng)力作用下軟骨細胞自噬的調(diào)控及其對軟骨細胞的基質(zhì)代謝的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠成軟骨細胞系A(chǔ)TDC5購自上海博全爾生物技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；qPCR試劑盒TaKaRa；CCK-8試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；1，9-二甲基亞甲藍(1,9-dimethylmethylene blue, DMMB)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購自Sigma；FlexCell FX-5000TM細胞應(yīng)變加載系統(tǒng)和FlexCell 6孔培養(yǎng)板購于FlexCell；TRIzol試劑盒和Lipofectamine 2000購自Invitrogen；兔抗小鼠Cx43和β-actin抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 II 抗均購于Santa Cruz；抗beclin 1和LC3B抗體購于Abcam。

2 主要方法

2.1細胞分組和處理 ATDC5細胞于DMEM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，將細胞接種于24孔板，待匯合約至85%時將細胞分為空白對照(control)組、機械應(yīng)力(mechanical stress)組(加載機械應(yīng)力)、Cx43 siRNA轉(zhuǎn)染(siCx43)組(轉(zhuǎn)染Cx43 siRNA)、scramble siRNA轉(zhuǎn)染(scramble)組(轉(zhuǎn)染scramble siRNA)、機械應(yīng)力+scramble siRNA轉(zhuǎn)染(mechanical stress+scramble)組(轉(zhuǎn)染scramble siRNA后給予機械應(yīng)力)、機械應(yīng)力+Cx43 siRNA轉(zhuǎn)染(mechanical stress+siCx43)組(轉(zhuǎn)染Cx43 siRNA后給予機械應(yīng)力)和機械應(yīng)力+Cx43 siRNA+3-MA (mechanical stress+siCX43+3-MA)組(5 mmol/L 3-MA處理細胞12 h后轉(zhuǎn)染Cx43 siRNA再加載機械應(yīng)力[14])，并分別進行相應(yīng)處理。

2.2機械應(yīng)力的加載 按2×105/cm2將ATDC5細胞接種于FlexCell FX-5000TM細胞應(yīng)力加載系統(tǒng)的細胞培養(yǎng)板FlexCell 6孔板上，待細胞生長匯合至約80%時，用FlexCell FX-5000TM給予力學(xué)刺激(20%間歇性循環(huán)牽張力，0.5 Hz，24 h)[15-16]。

2.3siRNA轉(zhuǎn)染 待接種于6孔板的細胞匯合率達約85%，將Cx43 siRNA和scramble siRNA分別用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入軟骨細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，qPCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。

2.4CCK-8法檢測細胞活力 將對數(shù)期的細胞接種于96孔板(1×107/L)，24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，2 h后用酶標儀檢測450 nm處吸光度(A)值。每個樣本3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

2.5細胞內(nèi)糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAG)含量檢測 用DMMB染色試劑盒檢測細胞內(nèi)GAG的含量，具體操作如下：接種細胞于24孔板中，棄去培養(yǎng)基，加入裂解液裂解后，加DMB顯色劑，混勻，反應(yīng)15 s后，525 nm處測定A值。取不同濃度的硫酸軟骨素標準液，DMB顯色后測525 nmA值，做標準曲線。根據(jù)各組測出A值和標準曲線的A值進行對比，計算GAG濃度。

2.6qPCR 用TRIzol充分裂解提取軟骨細胞總RNA，測定RNA濃度并鑒定純度，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA進行qPCR反應(yīng)，每個樣品3個復(fù)孔。反應(yīng)條件為 94 ℃預(yù)變性30 s;60 ℃變性1 min、70 ℃退火1 min、70℃延伸10 min，擴增40個循環(huán)。Cx43的上游引物序列為5’-TTGACTTCAGCCTCCAAG-3’，下游引物序列為5’-AATGAACAGCACCGACAGC-3’；II型膠原的上游引物序列為5’-AGGGCAACAGCAGGTTCACATAC-3’，下游引物序列為5’-TGTCCACACCAAATTCCTGTTCA-3’；內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’，下游引物序列為5’-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3’，計算2-ΔΔCt值。

2.7Western blot實驗 收集待測細胞，PBS清洗后，加入RIPA裂解液，提取細胞的總蛋白，BCA法進行蛋白濃度測定，然后行10% SDS-PAGE,電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉將膜于4 ℃封閉2 h后，加入I抗[Cx43(1∶1 500)、beclin 1(1∶2 000)、LC3B(1∶1 000)和內(nèi)參照β-actin(1∶2 000)]于4 ℃過夜孵育，PBS清洗3次，加入II抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，漂洗后于ECL成像系統(tǒng)中發(fā)光顯影。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用t檢驗或方差分析進行組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 機械應(yīng)力誘導(dǎo)Cx43在軟骨細胞中表達增加

小鼠ATDC5軟骨細胞受到機械應(yīng)力刺激后，細胞中Cx43的mRNA和蛋白表達水平與對照組相比均顯著增加(P<0.05),見圖1。

Figure 1.The expression of Cx43 of mRNA and protein levels in the ATDC5 cells under mechaical stress. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

2 轉(zhuǎn)染Cx43 siRNA降低Cx43的表達

qPCR和Western blot分析結(jié)果顯示，與對照組和scramble組相比，siCx43組細胞Cx43的mRNA和蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05),見圖2。

Figure 2.The effect of Cx43 siRNA transfectin on the expression of Cx43 in the ATDC5 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

3 沉默Cx43提高機械應(yīng)力下軟骨細胞的活力

CCK-8檢測結(jié)果顯示，和對照組相比，機械應(yīng)力刺激下，軟骨細胞的細胞活力明顯降低(P<0.05);沉默Cx43的表達后，軟骨細胞的活力和機械應(yīng)力組相比顯著升高(P<0.05),見圖3。

Figure 3.The effect of Cx43 silence on the viability in the ATDC5 cells in response to mechanical injury. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs mechanical stress group.

4 沉默Cx43提高機械應(yīng)力下II型膠原的表達

qPCR檢測細胞中II型膠原mRNA的表達，結(jié)果顯示機械應(yīng)力下軟骨細胞中II型膠原的mRNA表達較對照組明顯降低，而機械應(yīng)力+siCx43組細胞中II型膠原的mRNA表達和機械應(yīng)力組相比顯著增加(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.Cx43 silence upregulated the mRNA expression of collagen II in the ATDC5 cells in response to mechanical injury. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs mechanical stress group.

5 Cx43沉默增加機械應(yīng)力作用下軟骨細胞中GAG含量

機械應(yīng)力組的GAG含量與空白對照組比較顯著降低(P<0.05)，機械應(yīng)力+siCx43組的GAG含量與機械應(yīng)力組比較顯著增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.Cx43 silence increased the GAG production in the ATDC5 cells in response to mechanical injury. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs mechanical stress group.

6 Cx43沉默誘導(dǎo)機械應(yīng)力作用下軟骨細胞自噬

Western blot對自噬標志蛋白的檢測結(jié)果顯示，和對照組相比，機械應(yīng)力顯著減少beclin 1和LC3-II/LC3-I的蛋白表達(P<0.05)；與機械應(yīng)力組相比，Cx43沉默顯著促進機械應(yīng)力作用下beclin 1和LC3-II/LC3-I蛋白的表達(P<0.05),見圖6。

7 3-MA逆轉(zhuǎn)機械力作用下Cx43沉默對軟骨細胞的作用

和機械應(yīng)力+siCx43組比，機械應(yīng)力+siCx43+3-MA組的細胞活力降低，II型膠原的mRNA表達降低，GAG含量降低(P<0.05)。表明3-MA逆轉(zhuǎn)Cx43沉默對機械力作用下軟骨細胞的作用,見圖7。

討 論

骨關(guān)節(jié)炎是一種由遺傳、機械和環(huán)境因素引起的復(fù)雜的多因素疾病[17],其關(guān)節(jié)變性以關(guān)節(jié)軟骨損傷和功能喪失為特征[18]，因此，對于軟骨細胞功能的調(diào)節(jié)，對于骨關(guān)節(jié)炎的防治至關(guān)重要。

關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細胞和軟骨基質(zhì)組成，其中膠原蛋白、蛋白多糖及相關(guān)蛋白構(gòu)成軟骨基質(zhì)。軟骨基質(zhì)的減少會導(dǎo)致軟骨組織破壞、軟骨細胞減少，最終導(dǎo)致功能喪失。II型膠原是關(guān)節(jié)軟骨的一種特異性膠原，關(guān)節(jié)軟骨膠原中90%以上都是II型膠原。關(guān)節(jié)軟骨中II型膠原含量在關(guān)節(jié)軟骨病變和修復(fù)時都

Figure 7.3-MA reversed the effect Cx43 silence on ATDC5 cells in response to mechanical injury. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs mechanical stress group; &P<0.05 vs mechanical stress+siCx43 group.

會發(fā)生變化[19]。軟骨基質(zhì)中含大量蛋白多糖，GAG是由重復(fù)二糖單位所組成的一類雜多糖，是蛋白聚糖的主要成分之一，也是軟骨細胞細胞外基質(zhì)的典型成分，其含量代表軟骨基質(zhì)中特異性大分子聚糖體的含量[20]。力學(xué)刺激使軟骨細胞基質(zhì)成分失衡，影響軟骨細胞活性[21]。因此，細胞外基質(zhì)II型膠原的表達和GAG的含量是評價軟骨細胞功能的主要指標。FlexCell是一種新型的體外培養(yǎng)細胞的力學(xué)加載裝置，可簡化模擬復(fù)雜的體內(nèi)力學(xué)刺激，提供包括周期性應(yīng)力等多種力學(xué)刺激加載方式，但是由于細胞不同以及加力參數(shù)設(shè)定不同，細胞生物學(xué)行為改變結(jié)果也不同[22]。本實驗中，用FlexCell FX-5000TM細胞應(yīng)變加載系統(tǒng)給軟骨細胞加載周期性機械應(yīng)力，發(fā)現(xiàn)20%間歇性循環(huán)牽張力，0.5 Hz作用24 h，軟骨細胞活性降低，細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原的表達和GAG的含量均降低，軟骨細胞功能受到損害。

Cx43是構(gòu)成縫隙連接通道的小分子蛋白，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[8]。Cx43在骨細胞和軟骨細胞中廣泛表達，參與調(diào)控骨細胞功能[23]。Zhang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，機械刺激下，Cx43在大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨中的表達增加。本實驗中，20%間歇性循環(huán)牽張力，0.5 Hz作用24 h，Cx43高表達，下調(diào)Cx43的表達提高軟骨細胞活性，導(dǎo)致軟骨細胞分泌的II型膠原表達增多，GAG含量增加。表明機械應(yīng)力破壞了細胞外基質(zhì)蛋白聚糖和II型膠原代謝的平衡，Cx43沉默能夠調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)代謝和功能，保護軟骨細胞。

自噬是清除功能失調(diào)的細胞器和降解大分子的一種重要的細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制，是保護軟骨細胞免受不良外界刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，隨著軟骨的逐漸退化，自噬減少與細胞死亡有關(guān)[3]。自噬能夠調(diào)節(jié)人軟骨細胞骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因表達[5]，激活自噬提示是骨關(guān)節(jié)炎有效的治療方法[3]。研究發(fā)現(xiàn)，機械損傷導(dǎo)致細胞自噬受到抑制，而通過增強自噬，能夠防止機械應(yīng)力作用下軟骨細胞和基質(zhì)損傷[6]。Cx43與前自噬體結(jié)構(gòu)相關(guān)，能夠負調(diào)節(jié)細胞自噬[13]。本文結(jié)果表明，機械應(yīng)力作用下，軟骨細胞自噬相關(guān)蛋白beclin 1和LC3-II/LC3-I表達降低，而Cx43沉默促進軟骨細胞自噬。為了進一步證明自噬對軟骨細胞功能的調(diào)控，用自噬抑制劑3-MA處理細胞，發(fā)現(xiàn)3-MA可部分逆轉(zhuǎn)Cx43沉默對機械力作用下軟骨細胞基質(zhì)代謝的保護作用，表明Cx43沉默通過調(diào)控軟骨細胞自噬促進軟骨基質(zhì)合成。