1-磷酸鞘氨醇受體2介導(dǎo)PI3K/AKT/eNOS通路抑制甲型流感病毒誘導(dǎo)的病毒性肺炎*

尹香琳， 張婧瑤▲， 劉衛(wèi)東， 多久和陽(yáng)， 崔 弘△

(1延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 吉林 延吉 133002； 2金澤大學(xué)大學(xué)院醫(yī)學(xué)部循環(huán)醫(yī)科學(xué)血管分子生理學(xué)，日本 金澤 920-8640)

1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)作為細(xì)胞內(nèi)“第二信使”參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)作用，如血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、黏附和遷移等。S1P是一種存在于血漿中的多效信號(hào)脂質(zhì)分子[1]，在保護(hù)血管內(nèi)皮、誘導(dǎo)應(yīng)急纖維形成、抑制平滑肌細(xì)胞遷移、保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷及抑制黏附分子表達(dá)等方面的作用顯著，這些功能都是通過(guò)作用于G蛋白偶聯(lián)受體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。S1P受體(S1P receptor, S1PR)共有5種，分別為S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4和S1PR5，其中S1PR1通過(guò)與Gi偶聯(lián)并依賴Rac-GTP途徑加強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能， 抑制細(xì)胞的遷移，促進(jìn)纖維的形成[2]；然而，S1PR2是通過(guò)G12/13途徑，激活小GTP酶Rho進(jìn)而抑制Rac的活性，從而促進(jìn)纖維的形成，抑制細(xì)胞的遷移[3-4]。

甲型流感病毒是成年人和老人病毒性肺炎中最為常見(jiàn)的病原體，罹患流感時(shí)肺炎的發(fā)生率為5%～38%。在病毒性肺炎中，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞是各種致?lián)p傷因素的主要靶細(xì)胞，在炎性介質(zhì)作用下，血管壁通透性升高，血液成分滲出，造成水腫甚至出血；同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活，多種細(xì)胞黏附分子呈高表達(dá)，誘導(dǎo)大量單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的聚集和過(guò)度活化，過(guò)度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺組織嚴(yán)重的病理?yè)p傷[5-6]。因此，減少肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，降低血管通透性，減輕肺水腫，是流感病毒性肺炎治療中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。 在我們前期工作中發(fā)現(xiàn)S1PR2在肺血管內(nèi)皮中高表達(dá)，且可增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白的表達(dá)，從而抑制血管通透性。但是S1PR2在血管通透性以及肺炎中的作用機(jī)制尚未完全明了。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究S1PR2對(duì)甲型流感病毒誘導(dǎo)小鼠病毒性肺炎中的作用及作用機(jī)制，為臨床治療流感病毒性肺炎提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

8～10周齡C57BL/6J小鼠和同窩出生的S1pr2-/-小鼠，體重為22～25 g，雌雄各半，由日本金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1(A/FM/1/47，H1N1)購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)；S1PR2高效拮抗劑JTE-013(JTE)購(gòu)自Sigma；抗蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)抗體和抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology; 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自RB。

2 方法

2.1甲型流感病毒性肺炎動(dòng)物模型建立 實(shí)驗(yàn)分為3組：野生型(wild-type mice，WT)組、S1pr2-/ -組和WT+JTE組。流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1接種于9日齡雞胚尿囊腔，35 ℃培養(yǎng)2 d，收集尿囊液，測(cè)定其血凝滴度，以Reed-Muench法測(cè)定半數(shù)致死量(50% lethal dose, LD50)，稀釋至25 μL，野生小鼠和S1pr2-/-小鼠經(jīng)乙醚輕度麻醉后，滴鼻感染病毒液，制備甲型流感病毒性肺炎模型。JTE組為C57BL/6野生型小鼠， FM1滴鼻感染病毒性肺炎7 d前開(kāi)始給藥， 以30 mg/kg灌胃，每天1次，完全抑制動(dòng)物體內(nèi)的S1PR2活性。

2.2肺組織病理檢查 滴鼻感染FM1病毒液4 d和6 d時(shí)，將小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進(jìn)行麻醉，打開(kāi)腹腔，切斷腹主動(dòng)脈放血；暴露氣管和肺，用1根導(dǎo)管插入氣管，結(jié)扎固定后，以距水平20 cm高度注入4%多聚甲醛進(jìn)行內(nèi)固定。內(nèi)固定后拔出導(dǎo)管，結(jié)扎氣管，將全肺置于4%多聚甲醛中固定24 h，然后將肺組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，二甲苯透明，中性樹(shù)膠固定封片。光鏡下觀察肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫以及損傷情況。

2.3支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的收集 滴鼻感染FM1病毒液4 d和6 d時(shí)，將小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg，進(jìn)行安樂(lè)死后，暴露氣管，用一次性靜脈留置針進(jìn)行氣管插管，絲線結(jié)扎固定，然后取生理鹽水用1 mL注射器進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。每次取1 mL生理鹽水，經(jīng)氣管套管沖洗雙側(cè)支氣管肺泡，反復(fù)注入回收3次后收灌洗液，重復(fù)3次，回收率超過(guò)80%。將BALF以4 ℃、150×g離心10 min，取上清，保存于-80 ℃凍存，備測(cè)生化指標(biāo)，細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

2.4BALF的蛋白濃度測(cè)定和細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 取-80 ℃凍存的BALF上清液，室溫水浴快速化凍，BCA法測(cè)定蛋白含量。將BALF細(xì)胞沉淀以100 μL生理鹽水重懸，取10 μL懸液與臺(tái)盼藍(lán)混勻，于血球計(jì)數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.5BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6含量的測(cè)定 取-80 ℃凍存BALF上清液，室溫水浴快速化凍，按ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行TNF-α、IL-1β及IL-6含量的測(cè)定。

2.6肺組織總蛋白的抽提及指標(biāo)的檢測(cè) 稱取肺組織100 mg，并加入預(yù)冷的蛋白質(zhì)抽提試劑，以超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)低速粉碎細(xì)胞，低溫冷凍14 000 r/min 離心15 min 后，取上清液，按BCA法測(cè)定蛋白濃度。

2.7Western blot檢測(cè) p-AKT和p-eNOS 的蛋白水平 按每泳道加總蛋白20 μg進(jìn)行SDS-PAGE，半干式電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。37 ℃恒溫?fù)u床封閉3.5 h 后，加入抗p-AKT和p-eNOS多克隆抗體(1 ∶500)， 4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(1∶2 000)，ECL顯色，X線膠片曝光，經(jīng)顯影、定影、掃描后觀察結(jié)果。應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)掃描圖像的目的條帶進(jìn)行吸光度分析，各目的條帶與目的總蛋白條帶的吸光度比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析法，組間比較采用Bonferroni校正t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 S1PR2對(duì)甲型流感病毒誘導(dǎo)肺炎的作用

1.1肺組織病理變化 野生小鼠和S1pr2-/-小鼠經(jīng)滴鼻感染FM1病毒4 d和6 d時(shí)，病理切片檢查結(jié)果表明，F(xiàn)M1病毒感染的肺組織內(nèi)均可見(jiàn)以中性粒細(xì)胞為主的細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)肥厚和肺泡水腫等肺炎和肺損傷病理現(xiàn)象。與對(duì)照組比較，S1pr2-/-組及JTE處理組這些病理現(xiàn)象更加顯著，表明S1PR2基因缺陷加重病毒性肺炎，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effects of S1PR2 deficiency on influenza A virus-induced viral pneumonia. The representative images of HE-stained sections of the lung tissues were showed (×100). The scale bar=100 μm.

1.2BALF中蛋白含量和細(xì)胞數(shù)的測(cè)定 野生型和S1pr2-/-小鼠經(jīng)滴鼻感染FM1病毒4 d和6 d時(shí)，發(fā)現(xiàn)BALF中的總蛋白濃度和總細(xì)胞數(shù)均顯著增加。與對(duì)照組比較，S1pr2-/-組和JTE處理組中的總蛋白濃度和總細(xì)胞數(shù)的增加更加顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effects of S1PR2 deficiency on influenza A virus-induced increases in total protein concentration and total cell numbers in the BALF. A: total protein concentration in the BALF; B: total cell numbers in the BALF. BALF was prepared from the mice with or without influenza A virus challenge. Mean±SD. n=5.** P<0.01 vs WT group.

1.3BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的測(cè)定 甲型流感病毒感染使肺內(nèi)促炎性細(xì)胞因子過(guò)度激活與適應(yīng)性免疫相關(guān)的細(xì)胞因子被抑制，是H1N1流感病毒感染所致肺損傷的重要原因。野生型和S1pr2-/-小鼠經(jīng)滴鼻感染FM1病毒4 d和6 d時(shí)，發(fā)現(xiàn)BALF中的TNF-α、 IL-1β和IL-6含量顯著增高；與對(duì)照組比較，S1pr2-/-組和JTE處理組的增加更加顯著(P<0.01),見(jiàn)圖3。

Figure 3.The effects of S1PR2 deficiency on influenza A virus-induced changes of TNF-α (A), IL-1β (B) and IL-6 (C) concentrations in the BALF. Mean±SD. n=5. ** P<0.01 vs WT group.

2 S1PR2對(duì)甲型流感病毒誘導(dǎo)的肺炎中p-AKT和p-eNOS 蛋白水平的影響

2.1肺組織的AKT 磷酸化水平測(cè)定 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在甲型流感病毒感染4 d和6 d時(shí)， 模型組的小鼠肺組織中，PI3K下游靶點(diǎn)AKT磷酸化水平均增高。與對(duì)照組比較，S1pr2-/-組和JTE處理組的增高更加顯著(P<0.01),見(jiàn)圖4。

Figure 4.S1PR2 deficiency augmented influenza A virus-induced phosphorylation of AKT in the lung tissues. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs WT group.

2.2肺組織的eNOS 磷酸化水平的測(cè)定 Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在甲型流感病毒感染4 d和6 d時(shí)，野生型和S1pr2-/-小鼠肺組織的eNOS磷酸化水平均增高。與對(duì)照組比較，S1pr2-/-組和JTE處理組肺組織的eNOS磷酸化水平增高更加顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

討 論

S1P是一種具有多種生物活性的鞘脂類代謝產(chǎn)物，由鞘氨醇激酶1/2 (sphingosine kinase 1/2,SphK1/2)磷酸化鞘氨醇產(chǎn)生。S1PR在血管系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，是維持上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能重要的信號(hào)分子[7-8]。S1P信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)黏附連接和緊密連接組裝、細(xì)胞骨架重排、黏著斑形成，發(fā)揮對(duì)屏障功能的調(diào)控作用，因此S1P信號(hào)通路可能成為改善急性肺損傷、炎癥性腸病和敗血癥等疾病中屏障功能紊亂的新靶點(diǎn)[8]。Hunag等[9]的研究顯示在高果糖誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積中，激活SphK1/S1P信號(hào)通路，可升高SphK1、S1P和S1PR1蛋白水平，進(jìn)一步激活NF-κB，釋放出IL-1β、IL-6和TNF-α等，從而觸發(fā)炎癥反應(yīng)。并且SphK1/S1P 信號(hào)通路與腎臟炎癥有著密切的關(guān)系，在腎臟炎性反應(yīng)中可以刺激系膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)炎性介質(zhì)合成以及細(xì)胞外基質(zhì)積聚。S1P在炎癥疾病中起著很重要的作用。

Figure 5.S1PR2 deficiency augmented influenza A virus-induced phosphorylation of eNOS in the lung tissues. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs WT group.

甲型H1N1流感病毒感染后，中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)和循環(huán)血液中各種炎性刺激的作用下遷移到肺泡腔內(nèi)，釋放一系列損傷介質(zhì)(IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1等)，引起彌漫性肺泡損傷和血管內(nèi)皮損害，導(dǎo)致急性肺水腫或急性呼吸窘迫綜合征[10-12]。Teijaro等[5]研究發(fā)現(xiàn)，甲型流感病毒感染導(dǎo)致的致死性細(xì)胞因子風(fēng)暴中，內(nèi)皮細(xì)胞尤其是肺內(nèi)皮細(xì)胞起著主導(dǎo)作用，S1PR1激動(dòng)劑通過(guò)在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，抑制致死性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減少甲型流感病毒感染動(dòng)物的死亡率，表明S1P介導(dǎo)S1PR1抑制甲型流感病毒感染的肺部炎癥。而對(duì)肺內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的S1PR2對(duì)甲型流感病毒感染肺炎的作用尚不清楚。

本研究利用S1pr2-/-小鼠，主要觀察在肺內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的S1PR2對(duì)甲型流感病毒感染肺炎的作用及作用機(jī)制。與流感病毒性肺炎模型組的對(duì)照組相比，JTE處理組和S1pr2-/-組顯著惡化甲型流感病毒性肺炎。甲型流感病毒感染4 d和6 d時(shí)，模型組均呈現(xiàn)肺間質(zhì)肥厚，肺泡炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等肺炎病理變化，肺炎嚴(yán)重程度在JTE處理組和S1pr2-/-組中更加嚴(yán)重。并且，滴鼻感染FM1病毒4 d和6 d時(shí)，發(fā)現(xiàn)在野生型和S1pr2-/-小鼠BALF中的總蛋白濃度和總細(xì)胞數(shù)均顯著增加。與模型組中的對(duì)照組比較，JTE處理組和S1pr2-/-組的總蛋白質(zhì)濃度和總細(xì)胞數(shù)增加更加顯著。甲型流感病毒感染使肺內(nèi)促炎性細(xì)胞因子過(guò)度激活與適應(yīng)性免疫相關(guān)的細(xì)胞因子被抑制，是H1N1流感病毒感染所致肺損傷的重要原因。同樣，甲型流感病毒感染4 d和6 d時(shí)，與WT組比較，JTE處理組和S1pr2-/-組BALF中的TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子含量顯著增高。以上結(jié)果說(shuō)明，S1PR2基因缺乏或S1PR2活性抑制均惡化甲型流感病毒性肺炎的發(fā)生發(fā)展，S1PR2在甲型流感病毒性肺炎中起著重要的作用。

S1P/SphK是誘發(fā)FcεR1激活的信號(hào)通路之一，早在1996年Choi等[13]首先發(fā)現(xiàn)了在鼠肥大細(xì)胞中FcεR1刺激誘導(dǎo)SPHK活性增加，促使體內(nèi)S1P水平升高。此外，F(xiàn)cεR1還通過(guò)激發(fā)Ca2+動(dòng)員抑制產(chǎn)生SphK的抑制劑二氫鞘氨醇(DL-dihydrosphingosine)，使S1P合成增加。FcεR1/SphK通路是通過(guò)依賴網(wǎng)格蛋白活化的PI3K而參與信號(hào)傳遞。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)/PI3K/AKT信號(hào)通路是生物體內(nèi)一條非常重要的生存信號(hào)通路。EGFR通過(guò)二聚化后刺激Ras蛋白，導(dǎo)致磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生來(lái)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而引起炎癥的發(fā)生發(fā)展。Biswas等[14]報(bào)道了S1P通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，報(bào)道顯示，PI3K與流感病毒的感染過(guò)程有關(guān)。流感病毒可以激活細(xì)胞的PI3K通路，加快流感病毒的增殖。因此，本課題組通過(guò)Western blot檢測(cè)在病毒性肺炎中PI3K/AKT信號(hào)通路活性的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，模型組磷酸化的AKT蛋白水平升高。與對(duì)照組比較，JTE處理組和S1pr2-/-組的升高程度更顯著。PI3K/AKT信號(hào)通路下游分子eNOS是調(diào)控內(nèi)皮源性NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶?；罨腁KT主要通過(guò)磷酸化eNOS促進(jìn)內(nèi)源性NO生成，NO又進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放，參與各種肺臟的病理過(guò)程。Dimmeler等[15]研究發(fā)現(xiàn)激活的eNOS參與了VEGF引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。Bucci等[16]證實(shí)eNOS基因敲除的小鼠血管通透性明顯降低。Gonzalez等[17]報(bào)道NO能夠破壞體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的VE-cadherin黏附連接形成的屏障,使內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。我們的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染4 d和6 d時(shí)，與對(duì)照組的野生鼠比較，小鼠肺組織的eNOS磷酸化程度在流感病毒感染的JTE處理組和S1pr2-/-組顯著升高，說(shuō)明S1PR2在病毒性肺炎中通過(guò)AKT/eNOS信號(hào)途徑，抑制過(guò)多的NO生成而抑制血管通透性，進(jìn)而抑制流感病毒性肺炎的發(fā)展。

本研究證實(shí)了S1PR2在H1N1流感病毒性肺炎中的重要作用，S1PR2通過(guò)PI3K/AKT/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制NO的生成，又進(jìn)一步抑制血管通透性和炎性細(xì)胞因子釋放，抑制H1N1病毒性肺炎的發(fā)生發(fā)展。目前甲型流感的抗病毒治療藥物只有奧司他韋(達(dá)菲)、扎那米韋等神經(jīng)氨酸酶抑制劑。因此，研制多種有效治療甲型流感的治療藥物是一項(xiàng)非常重要的工作。S1PR2選擇性激動(dòng)劑有望成為治療流感病毒性肺炎新的治療藥物。