高壓氧預(yù)處理通過HIF-1α/VEGF通路減輕大腦缺血再灌注損傷

張愛民， 蔣宗濱

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院疼痛科， 廣西 南寧 530007)

缺血性腦卒中具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點(diǎn)[1]。臨床上常在血管梗塞后黃金6 h內(nèi)進(jìn)行藥物靜脈溶栓[2]和外科取栓[3]，均可以出現(xiàn)缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷[4]。這種損傷機(jī)制可能與下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-indu-cible factor-1α，HIF-1α)從而抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[5]并進(jìn)一步啟動(dòng)凋亡途徑有關(guān)[6]。因此，調(diào)控HIF-1α/VEGF通路可促進(jìn)大腦缺血再灌注損傷后的康復(fù)[7]。已有研究報(bào)道高壓氧(hyperbaric oxygen，HO)預(yù)處理治療大腦缺血再灌注損傷可以有效減少梗塞血管支配區(qū)的神經(jīng)元凋亡[8]，并調(diào)控神經(jīng)元修復(fù)[9]。但這種神經(jīng)保護(hù)作用是否與高壓氧通過上調(diào)HIF-1α/VEGF通路表達(dá)有關(guān)，尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，本研究擬對(duì)HIF-1α/VEGF通路在高壓氧預(yù)處理減輕大腦缺血再灌注損傷模型大鼠中的作用進(jìn)行探討，豐富高壓氧治療腦缺血損傷的治療機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠32只，體重150～200 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為SCXK(桂) 2009-0001。動(dòng)物每日自由作息與飲食，晝夜各半。

2 試劑與主要儀器

YC-1及抗HIF-1α、VEGF、Bcl-2和Bax 抗體均購(gòu)自Abcam；PDTC購(gòu)自BioVision。酶標(biāo)儀(Berthold)；Image Lab成像儀及系統(tǒng)(Bio-Rad ChemiDoc MP)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1動(dòng)物分組與模型制作 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.倫理-2016-KY-JK-036)，所有的操作均執(zhí)行國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則[許可證號(hào)SCXK(桂)～2014-0002]。使用隨機(jī)數(shù)字軟件將動(dòng)物分為對(duì)照組(control組)、缺血再灌注組(IR組)、高壓氧預(yù)處理-缺血再灌注組(HO-IR組)和高壓氧預(yù)處理-缺血再灌注-HIF-1α抑制劑(inhibitor，I)組(HO-IR-I組)。IR模型通過大腦中動(dòng)脈栓塞法制作[10]，尾動(dòng)脈有創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)下，在頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉1 cm處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，剪斷遠(yuǎn)端頸外動(dòng)脈，剪口處插入線栓直至大腦前動(dòng)脈末端；90 min后拆開縫線，拔出線栓，開始進(jìn)入再灌注時(shí)期。對(duì)照組僅分離暴露相應(yīng)血管。HO-IR組和HO-IR-I組均在制模前在動(dòng)物高壓艙內(nèi)進(jìn)行高壓氧治療4周(每天1次)。HO-IR-I組每天在高壓氧預(yù)處理前，經(jīng)腹腔注射4 mg/kg的HIF-1α抑制劑YC-1[3-(5’-hydroxymethyl-2’-furyl)-1-benzylindazol]。

3.2神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 在制作模型第1天和第7天行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估。神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估使用18分評(píng)分法則[10]。神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為細(xì)則中6項(xiàng)獨(dú)立試驗(yàn)評(píng)分的總和，得分區(qū)間為3～18分，正常大鼠為18分，神經(jīng)損傷程度與評(píng)分相反。

3.3梗死體積測(cè)定 在再灌注損傷第7天，麻醉后處死各組大鼠，取大鼠腦組織，經(jīng)-20 ℃冰箱冷藏20 min后，行連續(xù)的冠狀薄片切片，厚度為2 mm。腦組織薄片放入2% TTC溶液中，室溫下避光染色30 min。使用Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)腦梗死體積百分比，大鼠腦梗死百分率(%)=(正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球的體積)/正常側(cè)大腦半球體積×100%。

3.4Western bot檢測(cè)蛋白水平 大腦組織裂解后超聲勻漿，提取總蛋白，采用BCA法檢測(cè)其濃度。煮沸5 min后，經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。使用5%的脫脂牛奶封閉1 h，分別加入抗HIF-1α、VEGF、Bcl-2和Bax蛋白的 I 抗，稀釋度分別為1 ∶1 000、1 ∶800、1 ∶1 000和1 ∶1 500，4 ℃過夜后復(fù)溫30 min。加入酶標(biāo)II 抗(中杉金橋提供，稀釋度1 ∶1 000)，ECL法顯色，在Bio-Rad成像儀中獲取蛋白條帶，用的Image Lab軟件進(jìn)行條帶灰度值測(cè)量，目的蛋白條帶與對(duì)應(yīng)的內(nèi)參照GAPDH灰度值比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3.5TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞 麻醉處死各組大鼠，斷頭取腦組織行石蠟包埋、切片。Proteinase K工作液浸泡組織、PBS漂洗；配制含有熒光素標(biāo)記的dUTP的TUNEL反應(yīng)液，陰性對(duì)照組不添加TdT。分別在切片上滴加TUNEL反應(yīng)混合液，然后加封口膜在濕盒中反應(yīng)，PBS漂洗后滴加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，激發(fā)光波長(zhǎng)450～500 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)515～565 nm。載玻片干處理后拍照，甲基綠復(fù)染，沖洗。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，單因素和重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)采用單因素方差分析，兩兩比較用 SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 行為學(xué)評(píng)分與梗死體積比較

與control組比較，IR組、HO-IR組和HO-IR-I組的神經(jīng)功能18法評(píng)分累計(jì)得分降低、腦梗死體積比例增加(P<0.05)；與IR組比較，HO-IR組和HO-IR-I組的神經(jīng)功能18法評(píng)分累計(jì)得分升高，腦梗死體積比例降低(P<0.05)；與HO-IR組比較，HO-IR-I組的神經(jīng)功能18法評(píng)分累計(jì)得分降低，腦梗死體積比例升高(P<0.05)。TTC染色大體標(biāo)本見圖1(藍(lán)色箭頭所指的白色區(qū)域?yàn)槟X梗死區(qū))，行為學(xué)評(píng)分與梗死體積百分比的比較見表1。

Figure 1.TTC staining of rat brain slices on the 7th day after treatment.

表1 行為學(xué)評(píng)分與梗死體積百分比的比較

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsHO-IR group.

2 Western bot檢測(cè) HIF-1α、VEGF和凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)結(jié)果

與control組比較，IR組、HO-IR組和HO-IR-I組的HIF-1α、VEGF及凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)；與IR組比較，HO-IR組和HO-IR-I組的HIF-1α、VEGF及抑凋亡蛋白Bcl-2上調(diào)，促凋亡蛋白Bax下調(diào)(P<0.05)；與HO-IR組比較，HO-IR-I組的HIF-1α、VEGF和抑凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)，促凋亡蛋白Bax上調(diào)(P<0.05)，見圖2。

3 TUNEL觀察各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況

與control組比較，IR組、HO-IR組和HO-IR-I組的凋亡細(xì)胞數(shù)均增加(P<0.05)；與IR組比較，HO-IR組和HO-IR-I組的凋亡細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)；與HO-IR組比較，HO-IR-I組的凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，見圖3(藍(lán)色箭頭所指的棕色細(xì)胞為凋亡細(xì)胞)。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷可導(dǎo)致大鼠神經(jīng)行為學(xué)與認(rèn)知功能下降，激活體內(nèi)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路，誘導(dǎo)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，腦組織的凋亡細(xì)胞數(shù)增加。高壓氧預(yù)處理進(jìn)一步增加HIF-1α/VEGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白在腦組織中的表達(dá)，激活Bcl-2的抗凋亡效能，抑制了Bax表達(dá)，減少了凋亡細(xì)胞數(shù)量，提高了大鼠的行為學(xué)與認(rèn)知功能。通過使用HIF-1α抑制劑YC-1后，VEGF表達(dá)減弱，高壓氧預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷的抗凋亡作用下降，神經(jīng)損傷加重。因此，本研究結(jié)果可能提示，高壓氧預(yù)處理提高缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用可能與進(jìn)一步激活HIF-1α/VEGF信號(hào)通路、上調(diào)Bcl-2、抑制Bax有關(guān)。

大腦缺血再灌注損傷中，梗死區(qū)再灌注后功能神經(jīng)元凋亡是主要的損傷機(jī)制[11]。梗死后再灌注誘導(dǎo)了神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的線粒體損傷，增強(qiáng)氧化應(yīng)激[12]，進(jìn)一步導(dǎo)致Bcl-2/Bax比例失調(diào)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[13]。

Figure 2.Comparison of the relative expression of HIF-1α， VEGF, Bax and Bcl-2 proteins in the brain tissue of rats. Mean±SD. n=8. * P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs I/R group; △ P<0.05 vs HO-IR group.

Bcl-2 在線粒體內(nèi)外膜、細(xì)胞膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上阻止細(xì)胞色素C向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移[14]。Bax在凋亡因素刺激后，其產(chǎn)物會(huì)在細(xì)胞質(zhì)和線粒體外膜之間移動(dòng)，結(jié)合并激活線粒體上電壓依賴性離子通道，促進(jìn)細(xì)胞色素從線粒體釋放入胞質(zhì)，Bcl-2通過與Bax形成異源性二聚體來防止細(xì)胞色素C的大量釋放[15]。當(dāng)大腦缺血再灌注損傷后，電針、褪黑素等通過調(diào)控Bcl-2/Bax進(jìn)程實(shí)現(xiàn)了對(duì)此損傷的神經(jīng)保護(hù)[16-17]。

研究發(fā)現(xiàn)，低氧預(yù)處理可以誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，減少大腦缺血再灌注損傷[18]。彭洪軍等[19]提出，HIF-1α可能是作為腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制存在。而HIF-1α與P53等協(xié)同抑制mTOR信號(hào)通路而抑制細(xì)胞凋亡[20]。VEGF為HIF-1α的下游基因，在局灶性大腦缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)血管發(fā)生、進(jìn)行血供重建而提高神經(jīng)保護(hù)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)適應(yīng)后局灶性腦缺血再灌注大鼠梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路激活[22]，這與本研究中大腦缺血再灌注損傷大鼠模型觀察結(jié)果一致。

高壓氧是腦卒中患者康復(fù)期常用的治療措施。在既往研究提出，高壓氧治療降低了腦缺血再灌注時(shí)增高的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1蛋白和MMP-9的表達(dá)，調(diào)控對(duì)腦缺血再灌注時(shí)血腦屏障通透性起保護(hù)作用的機(jī)制[23]。使用2.0ATA和2.5ATA壓力的高壓氧預(yù)處理更能有效提高缺血再灌注損傷的抗自由基損傷能力[24]。更重要的是高壓氧處理降低了海馬神經(jīng)元凋亡，提高認(rèn)知功能[25]。彭爭(zhēng)榮等[26]認(rèn)為，高壓氧能增加腦出血大鼠腦內(nèi)HIF-1α和VEGF的蛋白和mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)新生血管形成，加快血腫吸收，改善腦出血大鼠受損的神經(jīng)功能，促進(jìn)其康復(fù)。張茜等[27]也發(fā)現(xiàn)了高壓氧預(yù)處理可上調(diào)HIF-1α及EPO表達(dá)，從而減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷。因此，除低氧預(yù)處理可以誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)、減輕大腦缺血再灌注損傷外[18]，在大腦缺血再灌注損傷中，高壓氧預(yù)處理也可促進(jìn)HIF-1α/VEGF通路的激活，這種激活對(duì)大腦缺血再灌注的康復(fù)帶來了益處[23-27]。在本研究中，使用特異性抑制劑YC-1抑制HIF-1α后，高壓氧預(yù)處理降低缺血再灌注損傷大腦組織神經(jīng)元凋亡的能力下降，大鼠的行為學(xué)與認(rèn)知能力也降低。上述結(jié)果提示，高壓氧預(yù)處理激活了HIF-1α/VEGF通路，從而減少腦神經(jīng)元凋亡，這可能是高壓氧預(yù)處理保護(hù)大腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。

Figure 3.Comparison of the number of apoptotic cells in rat brain of each group. Mean±SD. n=8. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs I/R group; △ P<0.05 vs HO-IR group.

綜上所述，高壓氧預(yù)處理可減輕大腦缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制可能與上調(diào)HIF-1α/VEGF通路進(jìn)而抑制凋亡有關(guān)。