黃芪甲苷對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠細(xì)胞自噬的影響*

李 媛， 靳曉飛， 周曉紅， 高維娟△

(1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 河北 承德 067000； 2河北中醫(yī)學(xué)院， 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北 石家莊 050200)

缺血性腦血管病可導(dǎo)致嚴(yán)重的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)退行性疾病甚至急性死亡[1]。組織纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)是目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的治療急性腦缺血的唯一療法，然而，tPA治療嚴(yán)格的3 h時(shí)間窗是急性靜脈溶栓的主要障礙[2]。因此，識(shí)別并探索新的治療靶點(diǎn)成為該領(lǐng)域的主要任務(wù)和挑戰(zhàn)。細(xì)胞自噬廣泛存在于真核生物中，是決定細(xì)胞命運(yùn)的主要機(jī)制。自噬不僅在許多生理過(guò)程如細(xì)胞增殖、分化與衰老中扮演著重要角色，在病理?xiàng)l件下也發(fā)揮著重要的作用，其中包括神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腫瘤和腦血管疾病等[3]。雖然自噬參與腦缺血這一過(guò)程是無(wú)可爭(zhēng)議的，但關(guān)于自噬在腦缺血疾病中確切的功能和影響尚未達(dá)成共識(shí)。本課題組一直致力于中醫(yī)藥對(duì)腦血管疾病的防治，傳統(tǒng)中藥黃芪具有抗炎、抗纖維化和抗氧化應(yīng)激等功效，黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ, AS-Ⅳ)為其主要的活性成分之一。在缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞的離體實(shí)驗(yàn)研究中，我們觀察到黃芪甲苷可通過(guò)激活自噬抑制細(xì)胞凋亡[4]，在腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷動(dòng)物模型中，黃芪甲苷是否也能通過(guò)對(duì)自噬的調(diào)節(jié)達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用？這將為我們研究治療腦血管病提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠70只，體重250～280 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0011。

1.2主要試劑和儀器 氯化2,3,5-三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC; Sigma， T8877)；兔抗大鼠beclin-1單克隆抗體(Abcam, ab207612)；兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)多克隆抗體(賽維爾生物科技有限公司， GB11124)；甲苯胺藍(lán)溶液和水合氯醛(北京索萊寶生物科技有限公司)；大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)線栓(北京西濃生物科技有限公司)；黃芪甲苷(南京森貝伽生物科技有限公司，每瓶100 mg，純度≥98%，生產(chǎn)批號(hào) 170302)；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA; Sigma， 124M4071V)；雷帕霉素(rapamycin，Rapa; 北京索萊寶生物科技有限公司， 104C0311)；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。EG11508型組織包埋機(jī)、RM2255型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)和DMI3000B型光學(xué)顯微鏡(Leica)；H-7650型透射電子顯微鏡(Hitachi)。

2 方法

2.1動(dòng)物分組與造模 SD大鼠隨機(jī)分為7組：假手術(shù)(sham)組、腦缺血/再灌注(I/R)組、溶劑對(duì)照(solvent)組、黃芪甲苷(AS-IV)組、黃芪甲苷+自噬抑制劑(AS-IV+3-MA)組、自噬抑制劑(3-MA)組和自噬激活劑(Rapa)組。采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型：SD大鼠于造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，手術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。大鼠腹腔注射麻醉劑10%水合氯醛(3.5 mL/kg)后，仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上。頸部備皮、消毒，采用正中切口并逐層分離頸部左側(cè)肌肉組織，充分暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)。結(jié)扎并離斷ECA，選取合適的線栓由ECA殘端進(jìn)入，經(jīng)ICA到達(dá)大腦中動(dòng)脈，并阻塞大腦中動(dòng)脈血流，造成大腦局灶性缺血[5]。缺血2 h后緩慢地拔出線栓至ECA殘端，使血流通暢，實(shí)現(xiàn)再灌注。Sham組線栓由ECA殘端進(jìn)入ICA，但不阻塞大腦中動(dòng)脈。AS-IV組與AS-IV+3-MA組于再灌注的同時(shí)給予黃芪甲苷20 mg/kg，黃芪甲苷粉末由二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解后，加生理鹽水稀釋配成終濃度為1 g/L溶液[6]; solvent組給予相同配比的DMSO生理鹽水稀釋液；AS-IV+3-MA組與3-MA組于術(shù)前30 min給予自噬抑制劑3-MA (2 mg/kg)，3-MA粉末由生理鹽水水浴70 ℃加熱溶解為終濃度0.3 g/L溶液；Rapa組于術(shù)前30 min給予自噬激活劑Rapa (5 mg/kg)，Rapa粉末由生理鹽水超聲振蕩溶解為終濃度1 g/L溶液。各組分別于再灌注24 h后處死取材。

2.2神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 取材前根據(jù)Zea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分： 無(wú)神經(jīng)缺損癥狀為0分；不能完全伸展右側(cè)前爪為1分；行走向右側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走向右側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失為4分。將0分、4分和死亡者剔除，1～3分者列為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.3TTC染色測(cè)定大鼠腦梗死體積 處死大鼠后，迅速取出完整的腦組織置于-20 ℃冰箱中冰凍15 min，隨之行冠狀位切片，每片厚度約為2 mm。將腦片置于配好的2 % TTC染液中，37 ℃恒溫箱避光孵育30 min，PBS終止染色，4%多聚甲醛固定液中固定，相機(jī)拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算腦梗死體積。

2.4尼氏染色觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài) 將新鮮腦組織置于4%多聚甲醛固定液中固定，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯溶液透明，石蠟包埋、切片。選取合適的位置切片，依次經(jīng)二甲苯溶液、梯度乙醇脫蠟至水，浸入1%甲苯胺藍(lán)水溶液中50 ℃恒溫孵育40 min。蒸餾水沖洗，95%乙醇分色，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

2.5透射電子顯微鏡觀察自噬體 取缺血側(cè)體積大小為1 mm×1 mm×1 mm腦組織數(shù)塊，迅速置于預(yù)冷的4%戊二醛溶液中固定4 h，PBS清洗后轉(zhuǎn)入1%鋨酸中固定2 h。依次浸入梯度丙酮溶液中脫水，純丙酮與包埋劑1∶1混合液中浸透1 h、純丙酮與包埋劑1∶3混合液中浸透3 h、純包埋劑浸透5 h，37 ℃溫箱聚合12 h，60 ℃溫箱聚合48 h。經(jīng)半薄切片選區(qū)后行超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色，在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬體的形成。

2.6Western bolt檢測(cè)beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平 取缺血側(cè)腦組織50 mg剪碎，加入1 mL細(xì)胞裂解液勻漿30 min，12 000×g離心5 min取上清獲得總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度后加上樣緩沖液，煮沸變性5 min。采用SDS-PAGE分離蛋白，半干電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Ⅰ 抗beclin-1(1∶2 000)、LC3(1∶2 000)和β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜液洗滌，加入Ⅱ抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，ImageJ軟件分析測(cè)量灰度值，以beclin-1與β-actin的比值和LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組腦梗死體積的變化

Sham組未見(jiàn)梗死灶，其它各組均有不同程度的梗死灶形成。與I/R組相比，AS-IV組和Rapa組腦梗死體積減小(P<0.05)，3-MA組梗死體積略有增大(P<0.05)，solvent組則無(wú)明顯變化。與AS-IV組相比，AS-IV+3-MA組和3-MA組梗死體積有所增大(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The changes of infarct volume with different treatments examined by TTC staining. A: the photographs of brain sections with TTC staining; B: the percentage of infarct volume. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs I/R group; △ P<0.05 vs AS-IV group.

2 各組缺血側(cè)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

Sham組的神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，核膜、核仁清晰，胞質(zhì)內(nèi)布滿藍(lán)色顆粒狀的尼氏體，無(wú)明顯神經(jīng)細(xì)胞壞死。與sham組相比，I/R組的神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，核膜、核仁模糊不清，尼氏體數(shù)量減少(P<0.05)，染色較淺。與I/R組比較，AS-IV組和Rapa組的神經(jīng)細(xì)胞狀態(tài)有所改善，核膜、核仁較清晰，尼氏體數(shù)量增多(P<0.05)；3-MA組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，尼氏體數(shù)量減少(P<0.05)；solvent組則無(wú)明顯變化。與AS-IV組相比，AS-IV+3-MA組和3-MA組的神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)量增多，尼氏體數(shù)量減少、著色較淺(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The morphological changes of nerve cells in each group (Nissl staining, ×400). A: the photographs of brain sections with Nissl staining; B: the average numbers of Nissl-stained cells across 5 random visual fields per section were used for the statistical analysis. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs I/R group; △P<0.05 vs AS-IV group.

3 透射電子顯微鏡下觀察自噬體

Sham組偶見(jiàn)自噬體。I/R組可見(jiàn)典型雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體增多(P<0.05)。與I/R組比較，AS-IV組和Rapa組典型自噬體數(shù)量增多(P<0.05)，可見(jiàn)自噬形成至降解過(guò)程中每個(gè)階段的形態(tài)；3-MA組典型自噬體數(shù)量減少(P<0.05)； solvent組則無(wú)明顯變化。與AS-IV組相比，AS-IV+3-MA組和3-MA組自噬體數(shù)量均減少(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Observation of autophagosomes in all groups by TEM (×200 000). A: the photographs of autophagosomes; B: the quantity of autophagosomes in each square micron. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs I/R group; △ P<0.05 vs AS-IV group.

4 各組缺血側(cè)腦組織中beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量的變化

與sham組相比，I/R組的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05)。與I/R組比較，AS-IV組和Rapa組的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量增多(P<0.05)，而3-MA組的表達(dá)量減少(P<0.05)， solvent組則無(wú)明顯變化。與AS-IV組比較，AS-IV+3-MA組和3-MA組的蛋白表達(dá)量減少(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Western blot was used to detect the protein expression of beclin-1 and LC3-II in all groups. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs I/R group; △P<0.05 vs AS-IV group.

討 論

細(xì)胞自噬是目前生物醫(yī)學(xué)廣泛研究的熱點(diǎn)之一，它是由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)成分自我降解的過(guò)程。當(dāng)病原體入侵、細(xì)胞內(nèi)受損衰老的細(xì)胞器增多、蛋白質(zhì)異常聚集等現(xiàn)象發(fā)生時(shí)，在自噬相關(guān)基因(autophagy-associated gene，ATG)的調(diào)控下，細(xì)胞內(nèi)囊泡樣膜結(jié)構(gòu)延伸包裹細(xì)胞內(nèi)容物，形成自噬體，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體。自噬溶酶體可釋放蛋白水解酶，將內(nèi)容物消化降解為小分子物質(zhì)，為細(xì)胞有氧呼吸提供原材料，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[7]。一般情況下，細(xì)胞自噬處于一個(gè)較低的水平，起到持家的作用。當(dāng)機(jī)體處于饑餓、激素失衡和氧化應(yīng)激等情況時(shí)，細(xì)胞自噬水平升高，在一定范圍內(nèi)，可通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)成分為機(jī)體提供能量。Beclin-1是酵母菌ATG6/VSP30在哺乳動(dòng)物的同源基因，亦是最早被發(fā)現(xiàn)的參與自噬調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，可誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位到自噬體膜上，調(diào)控自噬體的形成與成熟。LC3是酵母菌ATG8在哺乳動(dòng)物的同源基因，在自噬相關(guān)蛋白ATG4的作用下脫去羥基生成LC3-Ⅰ，游離于胞質(zhì)中的LC3-Ⅰ隨后在ATG7及ATG3共同作用下與磷脂酰乙醇胺結(jié)合酯化形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ可定位到自噬體膜上，是自噬體形成的生物學(xué)標(biāo)志[8]。

1995年 Nitatori等[9]采用透射電子顯微鏡首次證實(shí)了腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞中自噬現(xiàn)象的發(fā)生。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，腦缺血與細(xì)胞自噬密切相關(guān)10。研究證明，缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞在應(yīng)用自噬抑制劑后，細(xì)胞凋亡程度升高，相反，應(yīng)用自噬激活劑激活自噬，細(xì)胞凋亡程度顯著降低[11]。高壓氧預(yù)處理對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用部分是通過(guò)自噬的激活來(lái)完成的，應(yīng)用自噬抑制劑雷帕霉素可使自噬相關(guān)蛋白beclin1和LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào)，腦梗死體積減小[12]。新生大鼠在缺血缺氧后，應(yīng)用雷帕霉素亦可減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷[13]。Sheng等[14]研究證實(shí)，自噬抑制劑3-MA可有效阻斷自噬的活性，使LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量減少，神經(jīng)細(xì)胞壞死增多，降低了缺血預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷腦組織的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型。腦缺血/再灌注發(fā)生后，大量活性氧釋放，體內(nèi)自由基增多，引起氧化應(yīng)激損傷，通過(guò)上調(diào)自噬相關(guān)蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積，成為自噬的誘導(dǎo)物，促進(jìn)自噬現(xiàn)象的發(fā)生[15]。在此模型的基礎(chǔ)上應(yīng)用自噬激活劑雷帕霉素后，大鼠行為學(xué)表現(xiàn)有所改善，腦梗死體積減小，而應(yīng)用自噬抑制劑3-MA抑制細(xì)胞自噬后，大鼠神經(jīng)功能障礙嚴(yán)重，腦梗死體積增大，神經(jīng)細(xì)胞壞死增多。研究結(jié)果證實(shí)自噬在大鼠腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

傳統(tǒng)中藥黃芪的應(yīng)用已有兩千多年的歷史。黃芪味甘、性溫，具有益氣固表、斂瘡生肌、利水消腫等功效，可應(yīng)用于全身多個(gè)系統(tǒng)疾病的治療，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。迄今為止，已從黃芪中提取出幾十種活性成分，其中主要化學(xué)成分為黃芪皂苷、黃芪多糖及黃芪黃酮。黃芪皂苷大多屬于四環(huán)三萜類，其中活性最好的為黃芪甲苷。黃芪甲苷具有清除氧自由基、抗炎、抗病毒、提高機(jī)體免疫力和改善心血管功能等多方面功效[16]。黃芪甲苷可降低腦缺血再灌注大鼠髓過(guò)氧化物酶活性，減輕炎癥反應(yīng)[17]。缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞在應(yīng)用黃芪甲苷后，其凋亡率、凋亡指數(shù)顯著降低[18]，本實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用黃芪甲苷后，大鼠無(wú)明顯的神經(jīng)功能障礙，腦梗死體積顯著減小，在光學(xué)顯微鏡下觀察到神經(jīng)細(xì)胞整體狀態(tài)有所改善。且應(yīng)用黃芪甲苷后，自噬體明顯增多，自噬標(biāo)志蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯升高。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，黃芪甲苷對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，并且在一定程度上是通過(guò)自噬的激活來(lái)完成的，自噬的藥理激活劑雷帕霉素可以模仿黃芪甲苷的神經(jīng)保護(hù)作用。

自噬參與了腦血管疾病的發(fā)生過(guò)程這一點(diǎn)毋庸置疑，但自噬在腦血管疾病中發(fā)揮的作用仍存在爭(zhēng)議。自噬本身具有兩面性，持續(xù)的應(yīng)激或自噬相關(guān)基因過(guò)表達(dá)則有可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Yang等[19]在應(yīng)用參麥注射液治療腦缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，一定程度上抑制細(xì)胞自噬可以緩解神經(jīng)細(xì)胞損傷；電針可通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬達(dá)到治療腦缺血再灌注損傷的作用[20]。關(guān)于自噬在腦缺血再灌注損傷中呈現(xiàn)完全不同的作用，猜測(cè)其可能原因與缺血再灌注時(shí)間、藥物等外界刺激相關(guān)。若能正確引導(dǎo)自噬使其在疾病中發(fā)揮積極作用，這將為腦血管疾病的治療開(kāi)啟新紀(jì)元。