氟代檸檬酸抑制缺血后適應(yīng)對(duì)樹鼩腦缺血后海馬HIF-1α/iNOS信號(hào)通路調(diào)控的腦損傷機(jī)制*

何 亮， 譚樹芬, 張富榮， 李樹清

(1昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院麻醉科， 云南 昆明 650051； 2昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦瘤科， 云南 昆明 650018； 3昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 云南 昆明 650500)

中風(fēng)是導(dǎo)致成人殘疾的主要原因，是危害人類健康的主要疾病，也是國(guó)際腦保護(hù)研究關(guān)注的重點(diǎn)領(lǐng)域[1]。盡管中風(fēng)后的身體鍛煉和藥物治療被廣泛采用，但實(shí)際效果并不明顯[2]。近年的研究提示，非藥物干預(yù)是一種可以快速而簡(jiǎn)便地使大腦免受缺血損傷的新舉措，即缺血后適應(yīng)(postconditioning, PC)[3-5]。臨床實(shí)踐證明，缺血PC 技術(shù)簡(jiǎn)便,可通過(guò)將止血帶或膨脹的血壓計(jì)袖帶快速實(shí)施，其優(yōu)點(diǎn)還在于可使國(guó)內(nèi)外倡導(dǎo)腦缺血治療的6 h時(shí)間窗延至24 h。業(yè)已證明，星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes, AS)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種動(dòng)態(tài)細(xì)胞，其通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)，處理突觸信息、能量代謝、抗氧化和炎癥反應(yīng)來(lái)維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)[6]。AS的標(biāo)志蛋白——膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形狀、機(jī)械穩(wěn)定性以及突觸功能的維護(hù)[6-8]，其線粒體功能障礙可使氧化/氮化應(yīng)激增加，RNA氧化，超氧化物水平及誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表達(dá)增強(qiáng)[7,9]。本室前期研究提示，樹鼩缺血PC的腦保護(hù)與反復(fù)夾閉頸總動(dòng)脈介導(dǎo)的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]、Toll樣受體活化[10]、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt通路[11]和JAK-STAT(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription)通路[12]有關(guān)。資料顯示，低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的活化可促進(jìn)下游靶基因iNOS的表達(dá)，進(jìn)而影響缺血缺氧的病理進(jìn)程[13-14]。但有關(guān)HIF-1α/iNOS信號(hào)通路是否參與了樹鼩腦缺血PC的細(xì)胞保護(hù)，迄今未見報(bào)道，其信號(hào)通路在缺血PC中的分子機(jī)制也尚待闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)采用低等靈長(zhǎng)類動(dòng)物樹鼩為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在建立血栓性局灶腦缺血及缺血PC模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)側(cè)腦室注射AS代謝抑制劑——氟代檸檬酸鹽(fluorocitrate, FC)，觀察抑制AS代謝對(duì)缺血PC腦保護(hù)作用的影響，并探討缺血PC對(duì)樹鼩腦缺血海馬HIF-1α/iNOS信號(hào)通路調(diào)控的腦保護(hù)機(jī)制，為腦缺血的保護(hù)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康雄性成年樹鼩67只，體重(125±20) g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK(滇)2013-0002]。按照隨機(jī)數(shù)字法分為：假手術(shù)對(duì)照(control)組(n=9);缺血組(n=18),又分為缺血4 h(ischemia 4 h, Is 4 h)組(n=9)和缺血24 h(Is 24 h)組(n=9)；缺血PC(Is+PC)組，又分為Is+PC 4 h組(n=9)和Is+PC 24 h組(n=9)；FC預(yù)處理組，又分為FC+Is+PC 4 h組(n=11)和FC+Is+PC 24 h組(n=11)。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

1.2主要儀器設(shè)備及試劑 SQ-Ⅲ型血栓形成裝置(專利號(hào)：ZL201420068737.2)[7]由光源、散熱裝置以及光學(xué)系統(tǒng)(包括干涉濾鏡及聚光透鏡)組成,光源中心波長(zhǎng)(λ)560 nm, 帶寬(Δλ)60 nm，光強(qiáng)度1.0 W/cm2，用時(shí)間繼電器控制照射時(shí)間；AB204-S 臺(tái)秤(Mettler Toledo)；KW-Ⅱ型腦立體定位儀(西北光學(xué)儀器廠產(chǎn)品)；Multiskan GO酶標(biāo)儀(Thermo)；ImageJ圖像分析軟件(NIH)；Mini-Protein 3 裝置(Hercules)；CM1940UV冰凍切片機(jī)(Leica)。孟加拉紅(rose bengal)購(gòu)自Fluka； 抗iNOS抗體及2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)購(gòu)自Sigma；RIAP裂解液和BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；NO和NOS試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Ⅱ抗即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；HIF-1α ELISA試劑盒購(gòu)自R&D Systems；用于Western blot的輔助試劑均購(gòu)自Bio-Rad Laboratories。

2 主要方法

Figure 1. The schematic diagram of experimental design. FC： first clamping; SC: secondary clamping; TC: third clamping.

2.1樹鼩血栓性局灶性腦缺血及缺血PC模型的建立 按照既往實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)制缺血模型[7]：用3%硫噴妥鈉(0.30 g硫噴妥鈉加入滅菌雙蒸水共計(jì)10 mL)腹腔麻醉(50 mg/kg)樹鼩，麻醉起效后，仰臥固定動(dòng)物，消毒右顳部皮膚，在距離矢狀縫1.0 cm的直線與耳廓前緣所在的與矢狀縫垂直的直線上的交匯處向尾側(cè)切開右頂部皮膚約1 cm，暴露右側(cè)顱骨，精心分離軟組織以免損傷顱骨表面而影響透光性。于切口處嵌入一外徑為1 cm×2.5 cm的消毒銅片，其中心含一直徑為0.5 cm的窗孔，以便光束通過(guò)該窗孔直接照射于顱骨表面。銅片以外的組織用避光紙遮蓋。至此，于動(dòng)物舌下靜脈一次性緩慢注入濃度為1.5 %的孟加拉紅(用0.85%滅菌生理鹽水配制)20 mg/kg(1.3 mL/kg體重)，循環(huán)10 min后，將樹鼩置于實(shí)驗(yàn)裝置下，立體定位，使右側(cè)頂區(qū)顱骨(銅片中心區(qū))對(duì)準(zhǔn)光源，在光強(qiáng)度為1.0 W/cm2，顱骨表面溫度(36±1) ℃(與顱肌溫度接近)條件下垂直照射15 min(時(shí)間繼電器控制)。缺血PC模型：于光化學(xué)反應(yīng)4 h后再次麻醉動(dòng)物，仰臥固定，頸部正中作縱形切口，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈，以無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾在甲狀軟骨上緣平面夾閉頸總動(dòng)脈5 min后去除動(dòng)脈夾再灌5 min，重復(fù)3次以復(fù)制缺血PC模型，術(shù)后縫合動(dòng)物頸部創(chuàng)口，保暖入籠觀察。

2.2AS代謝抑制劑FC側(cè)腦室注射 FC應(yīng)用液(10 nmol/L)配制：稱取barium DL-fluorocitrate 8.0 mg溶解于1 mL 0.1 mol/L的HCl溶液中，充分?jǐn)嚢韬蠹尤?滴0.1 mol/L的Na2SO4沉淀出Ba2+，再加入2 mL 0.1 mol/L Na2HPO4，攪拌，188.8×g離心5 min，取上清，用0.15 mol/L的滅菌NaCl稀釋，調(diào)節(jié)pH值至7.4備用。將麻醉動(dòng)物固定在腦立體定位儀上，備皮，消毒頂部皮膚，沿頂部正中線切開皮膚，暴露顱骨。根據(jù)法蘭克福平面(Frankfurt plane)作為立體定位坐標(biāo)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，在右側(cè)(患側(cè))腦室以AP 0.0平面前9.5 mm(A9.5)、矢狀縫右側(cè)1.2 mm (R1.2)坐標(biāo)點(diǎn)作為進(jìn)針部位，在數(shù)字式微電極驅(qū)動(dòng)器控制下，將微灌流探針垂直進(jìn)入4.0～4.5 mm (H4.0～4.5)至側(cè)腦室；按5 μL/min的灌流速度分別對(duì)各組動(dòng)物行側(cè)腦室微灌注，10 μL注射完畢后消毒并縫合切口，保暖回籠，觀察并進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3TTC染色及梗死體積測(cè)定 光化學(xué)反應(yīng)后4 h及24 h，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉、迅速開顱取腦，肉眼直接觀察光化學(xué)反應(yīng)區(qū)腦皮層可見一直徑約0.5 cm的缺血水腫區(qū)；將樹鼩大腦于-20 ℃冰箱中速凍約20 min，自腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處為起點(diǎn)，將大腦切為2 mm厚的5～6片，置于37 ℃的1% TTC液中水浴30 min，不時(shí)翻動(dòng)腦片，使其均勻染色。正常腦組織TTC 染色呈紅色，而梗塞區(qū)則呈蒼白色，界限清楚。照相留底記錄，采用CAD 2007 版制圖軟件測(cè)定梗死面積×層厚為梗死體積[15]。

2.4HE染色及光鏡觀察 腦缺血后上述時(shí)點(diǎn)麻醉動(dòng)物，開胸并剪開心包，自心尖部插入一聚乙烯管使其進(jìn)入升主動(dòng)脈并結(jié)扎固定；剪開右心耳，在120 mmHg壓力下灌注10%甲醛200 mL行內(nèi)固定2 h。將內(nèi)固定的大腦開顱取出并用新配制的10%甲醛溶液再固定24 h，于視交叉后1.7～4.0 mm行冠狀切片，取中間切塊梯級(jí)脫水、透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋制成蠟塊標(biāo)本，進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察腦皮層組織結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化。

2.5局部腦血流測(cè)定 采用激光多普勒血流監(jiān)測(cè)儀(periflux system 5000, perimed, sweden)經(jīng)顱測(cè)量區(qū)域性腦血流(regional cerebral blood flow,rCBF)。將麻醉的樹鼩固定于立體定位儀上，以法蘭克福平面作為立體定位坐標(biāo)系統(tǒng)的基礎(chǔ)(如前所述)，于缺血后適應(yīng)4 h及24 h用Perimed提供的Perisoft配套軟件進(jìn)行曲線輸出記錄，血流儀將采集信號(hào)轉(zhuǎn)換成血流灌注單位(perfusion unit, PU)[=CMBC(一定體積內(nèi)細(xì)胞的分布率)×V(平均血細(xì)胞的移動(dòng)速率)]，選取穩(wěn)定記錄血流曲線300S，所有數(shù)據(jù)取平均值為rCBF。經(jīng)儀器對(duì)接收到的反射激光進(jìn)行分析處理后并顯示灌注量值即PU，其代表測(cè)量深度范圍的相對(duì)單位，可直接反映rCBF的改變[7]。

2.6免疫組化檢測(cè)iNOS表達(dá) 將圈定的樹鼩大腦冰凍切片的腦組織，PBS沖洗3次，每次3 min，加入Ⅰ 抗(iNOS，兔抗人，1∶200))并用PBS稀釋(加入5%馬血清)；3%的H2O2，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次,每次3 min；擦干圈外PBS水漬，置于濕盒上，逐片快速加入適量iNOSⅠ抗(兔抗人，1∶200)，室溫靜置60 min，PBS沖洗3次,每次3 min；除去PBS，加Max VisionTM試劑(山羊抗兔，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)室溫孵育15 min，PBS沖洗3次,每次3 min；除去PBS，加新鮮配制的DAB，顯微鏡下觀察3～5 min；沖洗，蘇木素復(fù)染，沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)用PBS代替I抗，其余步驟相同。各組用于此項(xiàng)觀察的腦組織一起切片，并同時(shí)進(jìn)行免疫組化染色，以保證免疫組化條件一致。在Olympus BX50光學(xué)顯微鏡下觀察各組樹鼩海馬區(qū)iNOS陽(yáng)性細(xì)胞的顯色程度。用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文采集分析系統(tǒng)拍攝切片進(jìn)行觀察分析。

2.7Western blot檢測(cè)海馬組織iNOS表達(dá) 于各時(shí)點(diǎn)深度麻醉動(dòng)物，迅速斷頭取海馬，蛋白裂解液RIAP裂解(10 μL/mg組織)，4 ℃、12 000×g離心10 min。BCA法測(cè)定蛋白濃度。分離膠10% SDS-PAGE電泳(初始電壓120 V，每30 min遞減10 V電壓，總時(shí)間為90 min)。PVDF轉(zhuǎn)膜(150 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)移2 h)，TBS-T洗膜3次，每次10 min，加入兔抗鼠iNOS抗體(1∶500)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。TBS-T洗膜3次,每次10 min；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgGⅡ抗(1∶10 000)封閉，室溫下振搖60 min，TBS-T洗膜3次，每次10 min；化學(xué)發(fā)光試劑暗室中曝光30 s，洗片，掃描成圖像，ImageJ圖像灰度分析[16]。

2.8NO產(chǎn)量檢測(cè) 分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白中NO含量，按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)要求進(jìn)行操作，取混合試劑、雙蒸水或樣品混勻，37 ℃準(zhǔn)確水浴60 min，加輔助試劑并充分漩渦混勻30 s，室溫靜置40 min，3 020×g離心10 min，取上清、混勻，室溫靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，550 nm波長(zhǎng)，0.5 cm光徑，測(cè)定各管吸光度(A)值。NO濃度(mmol/g protein)的計(jì)算公式如下：

NO含量(mmol/g protein)=

/待測(cè)樣本蛋白濃度 (g/L)。

2.9ELISA檢測(cè)海馬組織HIF-1α蛋白表達(dá) 按照試劑盒方法提取各時(shí)點(diǎn)各組海馬組織總蛋白，BCA法測(cè)定樣品濃度。HIF-1α標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液及樣品待測(cè)液室溫孵育2 h，洗板3次；室溫孵育HIF-1α稀釋抗體2 h，洗板3次；室溫孵育稀釋辣根過(guò)氧化物酶20 min，洗板3次；用反應(yīng)底物溶液室溫避光孵育20 min后加終止液，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)測(cè)量HIF-1α濃度。測(cè)定總HIF-1α的標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式參數(shù)如圖2所示。

Figure 2.The standard curve of total standard HIF-1α protein.

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(多重兩兩比較采用LSD-t法)，用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 缺血PC及FC對(duì)樹鼩腦梗死體積的影響

TTC染色顯示樹鼩腦缺血24 h腦皮層光照區(qū)梗死灶明顯，缺血區(qū)呈蒼白色，邊界清楚，缺血中心可見光照后的皮層血管阻塞，缺血PC處理后梗死灶明顯縮小，PC處理后梗死加重；肉眼觀察與TTC染色結(jié)果基本一致，見圖3。此時(shí)樹鼩腦皮層梗死體積為(1.26±0.14)%，缺血PC處理后腦梗死體積減小(0.96±0.10)%(P<0.05)；而FC預(yù)處理后24 h腦梗死體積顯著增大(1.67±0.31)%(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.The results of visual observation and TTC staining.

2 缺血 PC及FC對(duì)樹鼩腦缺血后海馬神經(jīng)元損傷的影響

光鏡下對(duì)照組海馬CA1區(qū)呈條索狀，神經(jīng)元排列整齊、形態(tài)正常；缺血后24 h神經(jīng)元大量壞死，排列明顯紊亂；缺血PC處理后24 h組神經(jīng)元的排列趨于整齊，細(xì)胞形態(tài)趨于恢復(fù)；而用FC預(yù)處理組海馬CA1區(qū)形態(tài)規(guī)整的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，排列極度紊亂，缺血PC對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)效果明顯減弱，見圖5。

Figure 5.Effects of FC and ischemic PC on morphological changes of hippocampal neurons after cerebral ischemia in tree shrews (HE staining, ×400).

3 缺血PC及FC 對(duì)樹鼩腦缺血后皮層rCBF的影響

對(duì)照組樹鼩皮層rCBF為(438.53±24.11) PU；腦缺血時(shí)皮層rCBF進(jìn)行性降低，4 h及24 h分別為(165.85±13.85) PU和(133.78±18.85) PU，以缺血24 h的改變?yōu)轱@著(P<0.05)；缺血PC組的rCBF呈恢復(fù)性增加，分別為(234.75±17.11) PU和(193.45 ±16.41) PU(P<0.05)；而FC預(yù)處理后4 h及24 h， rCBF均無(wú)恢復(fù)性改變，見圖6。

4 缺血PC及FC對(duì)樹鼩腦缺血后海馬神經(jīng)元iNOS表達(dá)的影響

免疫組化檢測(cè)顯示，iNOS主要表達(dá)于細(xì)胞漿。與對(duì)照組比較，海馬iNOS于缺血24 h表達(dá)增多，缺血PC處理后其表達(dá)明顯下降； FC預(yù)處理組24 h海馬iNOS幾乎無(wú)表達(dá)，見圖7。

Western blot檢測(cè)可見，缺血4 h 海馬iNOS略有表達(dá)；缺血PC處理后4 h其表達(dá)變化不明顯；FC預(yù)處理組4 h海馬iNOS表達(dá)顯著減弱(P<0.05)。與對(duì)照組比較，海馬iNOS于缺血24 h表達(dá)顯著升高(P<0.05)，而缺血PC處理后24 h則顯著降低(P<0.05)；但FC預(yù)處理組24 h海馬iNOS表達(dá)顯著減弱(P<0.05)，見圖8。

Figure 6.Effects of FC and ischemic PC on cortex rCBF after cerebral ischermia in tree shrews. Mean±SD.n=9.*P<0.05 vs control group；△P<0.05 vs Is group, #P<0.05 vs Is+PC group.

Figure 7.Effects of FC and ischemic PC on iNOS expression in hippocampal neurons after cerebral ischemia in tree shrews (×400).

Figure 8.Effects of FC and ischemic PC on the protein expression of iNOS in hippocampus after cerebral ischemia in tree shrews. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group；△P<0.05 vs Is group；#P<0.05 vs Is+PC group.

5 缺血PC及FC對(duì)樹鼩腦缺血后海馬NO產(chǎn)量的影響

與對(duì)照組比較，腦缺血4 h海馬NO升高(P<0.05)；缺血24 h進(jìn)一步升高(P<0.05)；缺血PC干預(yù)后24 h海馬NO顯著降低(P<0.05)；與Is+PC組相比，F(xiàn)C干預(yù)后24 h海馬NO又升高(P<0.05)，見圖9。

6 缺血PC及FC對(duì)樹鼩腦缺血后海馬HIF-1α表達(dá)的影響

ELISA結(jié)果顯示，樹鼩腦缺血后各組海馬HIF-1α表達(dá)較對(duì)照組升高(P<0.05)，其中缺血24 h的HIF-1α表達(dá)顯著高于缺血4 h組(P<0.05)；缺血PC干預(yù)后HIF-1α表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)(P<0.05)，以缺血24 h的改變?yōu)轱@著；FC預(yù)處理后4 h海馬HIF-1α表達(dá)即顯著升高(P<0.05)，見圖10。

Figure 9.Effects of FC and ischemic PC on the production of NO in hippocampus after cerebral ischemia. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group； △P<0.05 vs Is group； #P<0.05 vs Is+PC group.

Figure 10.Effects of FC and ischemic PC on HIF-1α expression after cerebral ischemia in tree shrews. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group； △P<0.05 vs Is group； #P<0.05 vs Is+PC group.

討 論

樹鼩(Tupaiabelangeri)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)比犬、兔、大鼠和小鼠更為高級(jí)，與人類更接近。因此，將樹鼩用作腦缺血發(fā)病機(jī)制及其防治的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，相對(duì)于大鼠和小鼠等嚙齒類動(dòng)物而言，其具有更好的神經(jīng)生物學(xué)與解剖學(xué)基礎(chǔ)。由于光化學(xué)誘導(dǎo)腦血栓形成無(wú)需開顱，操作簡(jiǎn)單，對(duì)動(dòng)物機(jī)體損傷小，動(dòng)物成模后的存活率較高，且腦梗塞面積和損傷程度易于調(diào)控[17]，符合國(guó)際腦缺血研究關(guān)于腦缺血模型需“創(chuàng)傷小、不改變顱內(nèi)壓、穩(wěn)定性好”的特點(diǎn)。

TTC結(jié)果分析顯示，樹鼩腦缺血24 h腦梗死灶明顯(P<0.05)；缺血區(qū)rCBF且隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)而進(jìn)行性降低，缺血后4 h及24 h的rCBF分別下降62.18%和69.49%(P<0.05)；同時(shí)觀察到樹鼩腦梗死體積隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增大(P<0.05)，神經(jīng)元損傷的程度與腦梗死體積增加的趨勢(shì)平行。已知NOS分為固有型和誘導(dǎo)型，前者包括nNOS和eNOS，具有神經(jīng)保護(hù)作用，后者即iNOS[6,18]。iNOS可加速NO生成并氧化生成硝酸鹽，此間產(chǎn)生的過(guò)氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)可能參與腦缺血所致血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)損傷引起的神經(jīng)元微環(huán)境的改變[19-20]。正常時(shí)CNS并不表達(dá)iNOS，只有在腦缺血、腦外傷、神經(jīng)毒性損傷及炎癥反應(yīng)等條件下才表達(dá)iNOS[21]。本研究證實(shí)，缺血后4 h海馬iNOS蛋白呈弱表達(dá)，但其催化活力卻顯明顯升高(P<0.05)，提示腦缺血4 h的超早期病理改變與iNOS的高活力有關(guān)；缺血24 h海馬iNOS蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，可能是腦缺血24 h神經(jīng)損傷加劇的主要原因[22]，缺血PC 處理后24 h時(shí)iNOS表達(dá)顯著減少(P<0.05)，提示缺血PC抑制iNOS的表達(dá)，對(duì)eNOS和nNOS的平衡具有調(diào)節(jié)作用，其結(jié)果既減少NO的生成，又降低BBB通透性而緩解血管源性腦水腫。研究發(fā)現(xiàn)缺血PC處理后AS的活化程度與rCBF增加的趨勢(shì)相平行[7]，提示AS在PC腦保護(hù)中具有著重要的調(diào)節(jié)作用。為揭示其可能機(jī)制，本研究通過(guò)側(cè)腦室注入AS代謝特異性抑制劑FC，經(jīng)確認(rèn)GFAP及GS表達(dá)下調(diào)的條件下，探討AS活化在PC大腦保護(hù)的病理生理機(jī)制，為臨床腦缺血性的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[23]。結(jié)果表明FC可使AS的GS活性顯著抑制，缺血PC的腦保護(hù)效應(yīng)也因FC的應(yīng)用而明顯減弱。主要變化為海馬神經(jīng)元損傷加劇和腦梗死體積顯著增大；其機(jī)制可能涉及以下幾方面：(1)FC抑制AS內(nèi)谷氨酸(aminoglutaric acid，AA)的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致缺血微環(huán)境AA堆積而削弱缺血PC的保護(hù)效應(yīng)；(2)FC干擾AS的三羧酸循環(huán)使線粒體能量生成不足，導(dǎo)致神神經(jīng)元損傷和腦梗死體積擴(kuò)大；(3)FC對(duì)缺血PC下調(diào)海馬iNOS表達(dá)和抑制NO生成的抗損傷作用具有逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合[24-26]。資料證實(shí)，全腦缺血?jiǎng)游飳?shí)施低氧后適應(yīng)(hypoxic postconditioning)后HIF-1可通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt和p38 MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及下調(diào)ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)而介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用[27]；但相反的研究結(jié)果顯示，HIF-1可促凋亡蛋白的反激活而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27-28]。事實(shí)上，HIF在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮雙重作用，既可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活,也可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。如何在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展尤其在缺血性腦血管病的治療中利用HIF的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)而避免其損傷作用，仍然是未來(lái)研究的熱點(diǎn)[29]。本研究結(jié)果表明，樹鼩腦缺血時(shí)rCBF降低導(dǎo)致細(xì)胞供氧匱乏，而HIF-1α表達(dá)明顯升高既是細(xì)胞缺血缺氧的一種代償反應(yīng)，又是激活其下游靶基因使iNOS上調(diào)的重要因素[22]；缺血PC干預(yù)后HIF-1α表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)可能是缺血PC腦保護(hù)的機(jī)制所在，與我們先前關(guān)于缺血PC促進(jìn)JAK2/STAT3活化以及Akt Ser473/Thr308位點(diǎn)磷酸化的結(jié)果一致[10,12]。應(yīng)用AS抑制劑后24 h樹鼩腦梗死范圍明顯擴(kuò)大，顯然與AS維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能受抑制有關(guān)[7]。而FC預(yù)處理后海馬HIF-1α表達(dá)仍上調(diào)而未受抑制，提示FC的作用環(huán)節(jié)可能在其靶基因下游而對(duì)其上游的HIF-1α則無(wú)直接影響[22]。但FC干擾AS代謝而降低AS的腦保護(hù)作用與HIF-1α上調(diào)之間是否具有因果關(guān)系尚待闡明。顯然，AS在“神經(jīng)-血管單元”中發(fā)揮的橋梁作用在缺血PC介導(dǎo)的“機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”以及“PI3K/Akt、JAK2/STAT3、HIF-1α/iNOS”等[7,10,12]生物信號(hào)通路的調(diào)控可能在增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)部抗損傷能力，抑制神經(jīng)元繼發(fā)性損傷中起著重要作用。盡管上述信號(hào)通路在缺血PC的保護(hù)中發(fā)揮著重要作用，但迄今對(duì)這些通路之間相互作用的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不明確，其基因差異表達(dá)的研究仍有待進(jìn)一步探索。