聯(lián)合靶向阻斷miR-29b/92b/106b抑制胃癌細胞生長及遷移*

施 莉， 胡麗瑜， 鐘定福， 郭存果， 施小英

(金華市人民醫(yī)院消化科， 浙江 金華 321000)

胃癌發(fā)病率和死亡率均居我國惡性腫瘤前列，是威脅人類生命健康的主要疾病之一，但其發(fā)病機制尚未明確[1]。因此，解析胃癌的發(fā)病機理、探索新的分子標志物并挖掘有效的分子治療靶點已成為臨床胃癌診治的迫切需求。

近年來，非編碼RNA(non-coding RNA)，尤其是微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在腫瘤發(fā)病機制的相關(guān)研究中引起了廣泛關(guān)注[2-4]。miRNA是一類長度為21～25個核糖核苷酸的非編碼內(nèi)源性小單鏈RNA 分子，通過與靶基因3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region,3’UTR)互補結(jié)合，可靶向調(diào)控約50%的編碼基因翻譯。因此，miRNA參與多種細胞生理和病理過程，如細胞周期、凋亡和分化等[5-6]。miRNA在不同腫瘤組織中存在特異性表達模式，提示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。盡管有研究報導若干miRNA在胃癌發(fā)生中扮演重要角色，但這些胃癌相關(guān)miRNA研究才剛剛開始，更多具有調(diào)節(jié)功能并具備臨床轉(zhuǎn)化價值的miRNA有待揭示。

本研究擬從發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者的腫瘤組織中尋找轉(zhuǎn)移相關(guān)候選miRNA，利用細胞功能學實驗明確候選miRNA是否具備促生長、抑凋亡及促轉(zhuǎn)移能力。最后，構(gòu)建聯(lián)合靶向候選miRNA的載體模型，觀察其體內(nèi)抑癌作用，明確其臨床應(yīng)用價值。

材 料 和 方 法

1 臨床資料及標本采集

臨床標本選取腸外科手術(shù)后的胃癌患者，選取淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及非轉(zhuǎn)移患者各3例，年齡50～60歲，患者手術(shù)前均未接受抗腫瘤治療等處理。依據(jù)WHO胃癌病理學判斷標準，對胃癌組織學病理類型分類。每例患者留取相應(yīng)的腫瘤組織，組織離體10 min內(nèi)被置于液氮中凍存以待后續(xù)分析。

2 實驗方法

2.1總RNA的抽提 提取凍存的胃癌組織以及癌旁正常的胃黏膜組織標本，并加入1 mL TRIzol，提取組織的總RNA，將之溶解于DEPC水中。用DNase進一步處理RNA，為了明確RNA的濃度和純度，對RNA樣本A260/A280的檢測選用NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific)，比值在1.8～2.0之間則用于后續(xù)實驗。

2.2候選miRNA的抑制和胃癌細胞活力的檢測 胃癌細胞BGC-823用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d視其生長狀況傳代 1 次。取生長狀態(tài)較好的腫瘤細胞以每孔1×105接種96孔板，按照Lipofectmaine 2000說明書對細胞進行miR-29b、miR-92b及miR-106b的鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)修飾的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)轉(zhuǎn)染。處理48 h后，加入CCK-8溶液(每孔10 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。通過酶標儀測量該樣品在450 nm處的吸光度(A)值。

2.3Transwell實驗檢測細胞遷移能力 用胰酶消化BGC-823胃癌細胞株并用無血清培養(yǎng)液洗滌2次，用細胞計數(shù)板計數(shù)。上室內(nèi)加入對照及處理細胞懸液，下室為600 μL含15% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。除去上室內(nèi)的液體，用棉棒擦拭出去上室底部表面覆蓋的細胞，將Transwell小室浸入固定液(50%甲醇液)固定15 min，PBS洗3遍。最后用結(jié)晶紫染色30 min，風干后每孔隨機選取6個視野計數(shù)并計算其平均數(shù)。

2.4劃痕實驗測定細胞遷移能力 用標記筆劃橫線以進行定位觀察，將胰酶消化BGC-823胃癌細胞株加入6孔板內(nèi)，過夜后細胞鋪滿培養(yǎng)孔。次日用槍頭垂直于背后的橫線劃痕。PBS洗細胞3次，去除劃下細胞，加入無血清培養(yǎng)基。加入37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱，48 h后取樣拍照，觀察細胞遷移能力。

2.5細胞凋亡測定 貼壁細胞加胰酶消化，收集離心，懸浮細胞直接收集離心。用冷的PBS洗細胞2遍，加入1×Binding Buffer 100 μL重懸細胞，細胞濃度為1×109/L，加入5 μL Annexin V和10 μL PI，混勻，室溫避光15 min染色。加入1×Binding Buffer 400 μL 置于冰上，上機檢測。

2.6多重靶向載體構(gòu)建 構(gòu)建去水四環(huán)素(tetracycline, Tet)誘導表達的多重靶向候選miRNA的慢病毒表達載體，首先體外合成miR-29b、miR-92b及miR-106b結(jié)合位點(microRNA binding sites, MBSs)克隆至Tet-On載體；此MBS克隆由miR-29b、miR-92b及miR-106b對應(yīng)的各10個重復反向互補序列單位串聯(lián)構(gòu)成，每個miRNA的MBS用ATCG序列隔開，在種子序列上游引入錯配序列GCTA[以防止多西環(huán)素(doxycycline，DOX)誘導的轉(zhuǎn)錄本被AGO2結(jié)合降解]，最后在兩邊加入內(nèi)切酶SanD I酶切位點。將此體外合成序列克隆至SanD I消化的Tet-On載體，完成載體構(gòu)建。將載體與包裝質(zhì)粒pVSV-G和pCMVΔR8.2共同轉(zhuǎn)染人胚腎293T細胞，收獲高滴度病毒體。

2.7動物實驗 構(gòu)建DOX誘導表達的多重靶向候選miRNA的抑制物并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細胞株，取生長狀態(tài)相似的健康BALB/c(nu/nu)裸小鼠共15只，將裸鼠隨機分成3組，每組5只，其中一組裸鼠接種正常的BGC-823胃癌細胞，另外兩組裸鼠接種構(gòu)建的BGC miRNATet-On細胞株(其中一組為DOX誘導，另一組無DOX誘導)。接種方法：在裸鼠右背部皮下接種細胞，濃度為2×1010/L， 共0.1 mL。從接種時間開始算起，第7天檢測腫瘤大小，第10天開始前兩組裸鼠腹腔注射1 g/L的DOX，并在水中加入DOX喂養(yǎng)。每3 d測 1 次腫瘤大小，用卡尺測量其長徑(a)和寬徑(b)，并計算體積V=ab2/2，在第32天取出腫瘤并稱重。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件比較不同組別間的差異，配對樣本間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗，2組獨立樣本間比較采用Mann-Whitney U檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 miR-29b、miR-92b及miR-106b與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)

采用小RNA測序分析有和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌標本(各3例)miRNA的差異表達。我們發(fā)現(xiàn)， miR-29b(上調(diào)4.43倍，P=0.002)、miR-92b(上調(diào)3.31倍，P=0.004)及miR-106b(上調(diào)5.03倍，P=0.012)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，從而將它們確定為候選miRNA。對miR-29b、miR-92b及miR-106b靶基因的GO和Pathway分析提示，候選miRNA功能主要涉及細胞黏附、細胞外基質(zhì)相互作用及PI3K信號通路等，進一步確定候選miRNA與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，見圖1。

Figure 1. The GO and Pathway analyses for target genes of candidate miRNAs.

2 miR-29b、miR-92b及miR-106b對胃癌細胞活力的影響

根據(jù)上述有/無轉(zhuǎn)移胃癌組織miRNA表達差異及生物信息學分析，我們推測miR-29b、miR-92b及miR-106b可能具有增強胃癌惡性行為的能力。因此，我們首先將LNA修飾的候選miRNA的ASO轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細胞株，封閉抑制候選miRNA，見圖2；并且通過CCK-8法監(jiān)測每日細胞活力的變化，確定候選miRNA對胃癌細胞增殖的抑制效應(yīng)，結(jié)果顯示，與對照組比較，各抑制組BGC-823胃癌細胞的活力明顯下降(P<0.01)，并且呈現(xiàn)時間依賴性方面，見圖3。

Figure 2.The inhibitory effect of ASO on candidate miRNAs. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC group.

Figure 3.The impact of miRNA ASO on the viability of gastric cancer cells detected by CCK-8 assay. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs NC group.

3 miR-29b、miR-92b及miR-106b對胃癌細胞凋亡的影響

為探究候選miRNA促胃癌細胞活力的功能是否涉及到細胞凋亡程度的變化，我們進一步用候選miRNA的ASO瞬時轉(zhuǎn)染48 h后，再用Annexin V/PI 染色和流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的程度。結(jié)果表明,抑制BGC-823胃癌細胞3種候選miRNA表達后，細胞總凋亡率顯著提高(P<0.01),見圖4。

Figure 4.The effect of miRNA ASO on the apoptosis of gastric cancer cells. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs NC group.

4 miR-29b、miR-92b及miR-106b對胃癌遷移能力的影響

細胞劃痕實驗檢測候選miRNA對胃癌細胞遷移的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，3個miRNA的ASO轉(zhuǎn)染后，細胞表現(xiàn)出較低程度的劃痕愈合能力(P<0.01)，見圖5。Transwell實驗進一步評估顯示，與對照組相比，經(jīng)ASO轉(zhuǎn)染的細胞遷移數(shù)量明顯減少(P<0.01)，見圖6。這些結(jié)果表明miR-29b、miR-92b和miR-106b促進了胃癌細胞遷移。將多條ASO聯(lián)合抑制miR-29b、miR-92b和miR-106b表達，則進一步抑制胃癌細胞遷移能力(P<0.01)，見圖6。

Figure 5.The effect of ASO of the candidate miRNAs on cell migration ability detected by wound healing assay (×40). Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs NC group.

Figure 6.The effect of miRNA ASO on the migration ability of BGC-823 cells detected by Transwell assay (×40). Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC group.

5 聯(lián)合靶向抑制miR-29b、miR-92b及miR-106b對體內(nèi)腫瘤生長的影響

構(gòu)建DOX誘導表達的多重靶向候選miRNA的抑制物并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細胞株，在DOX誘導下miR-29b、miR-92b及miR-106b的表達水平顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖7。同時，利用此胃癌細胞株成功構(gòu)建了裸鼠的荷瘤模型，并且發(fā)現(xiàn)在DOX的誘導下BGC miRNATet-On細胞株的移植瘤逐漸縮小，甚至在第31天，該組有2只裸鼠的腫瘤幾乎消失了，而對照組細胞移植瘤則沒有出現(xiàn)類似的現(xiàn)象，見圖8。

討 論

胃癌的發(fā)病率居我國惡性腫瘤的首位，手術(shù)為主的綜合治療仍是目前治療胃癌的首選方法，但進展期胃癌的治療效果并不理想，III期胃癌的5年生存率只有15%～30%，復發(fā)和轉(zhuǎn)移是導致胃癌死亡率居高不下的主要原因，盲目擴大手術(shù)根治范圍并不能改善患者的預(yù)后[1]，因此尋找干預(yù)胃癌轉(zhuǎn)移的有效途徑意義深遠。

Figure 7.The inhibitory effect of multiple miRNA inhibitor on expression levels of the candidate miRNAs. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs NC group.

miRNA是近年來在多種真核細胞和病毒中發(fā)現(xiàn)的一類非編碼短序列(21～23個核苷酸)RNA片段，其轉(zhuǎn)錄前體轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)在核內(nèi)被RNase III核酸酶Drosha加工成約70個核苷酸發(fā)夾狀的RNA(pre-miRNA)， 在exportin-5的幫助下從核內(nèi)進入胞質(zhì)，然后在Dicer酶的作用下，單鏈的miRNA進入一個核糖蛋白復合體miRNP。miRNA 通過與靶基因的3’UTR互補配對，指導miRNP復合體對靶基因mRNA進行切割或翻譯抑制，起著調(diào)控基因功能的作用，在腫瘤的發(fā)生過程中起到調(diào)控樞紐的作用，且序列具有相對的保守性，因此有專家預(yù)測，研究miRNA可能比研究編碼基因更加有效[1]。

Figure 8.The inhibitory effect of multiple miRNA inhibitor on tumor growth in the nude mice. A: the images of tumor size in BGC miRNATet-On DOX group; B: the tumor volume. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs BGC DOX group.

隨著高通量miRNA芯片平臺的建立和完善，常見腫瘤的miRNA表達譜檢測工作相繼完成，Coburn等[1]報道了胃癌的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-21、 miR-24、 miR-107、 miR-221和miR-223等在胃癌組織中顯著高表達，而miR-218-2、miR-206和miR-198等在胃癌組織中則顯著低表達。業(yè)已證明miRNA在腫瘤發(fā)生學方面發(fā)揮重要作用，而腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA的研究正處于起步階段。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移瘤中可以出現(xiàn)異常表達的miRNA。有研究就肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA做了篩選工作，他們發(fā)現(xiàn)miR-338、miR-219-1、 miR-206等20條miRNA在已發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌中異常表達。在乳腺癌轉(zhuǎn)移組織中出現(xiàn)miR-10b和miR-373表達上調(diào)，而miR-335和miR-126呈下調(diào)改變，其具體的調(diào)控機制仍在探索之中。本研究中，我們采用小RNA測序分析發(fā)現(xiàn)miR-29b、miR-92b及miR-106b與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較為相關(guān)，并將它們確定為候選miRNA。對miR-29b、miR-92b及miR-106b靶基因的GO和Pathway分析提示，候選miRNA功能主要涉及細胞黏附、細胞外基質(zhì)相互作用及PI3K信號通路等，進一步確定了候選miRNA與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。

近年來，相關(guān)miRNA生物功能學研究也不斷深入，通過干預(yù)癌基因或(和)抑癌基因的表達參與腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、遷移等生物程序的調(diào)控。已有研究發(fā)現(xiàn)，let-7可與其靶標致癌基因ras和myc互補配對從而下調(diào)ras和myc的表達，抑制其翻譯過程[3]。miR-21可能通過抑制抑癌基因原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPM1)促進癌細胞的增殖，同時還有多個參與細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的基因被證實是miR-21 的調(diào)控靶標，如miR-21 通過負調(diào)控抑癌基因第10號染色體缺失的磷酸酶-張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)的表達，促進肝癌細胞的增殖和侵襲能力；高表達miR-21可以促使胃癌抑制基因RECK的下調(diào)，從而促進胃癌的發(fā)生[7]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，抑制miR-29b、miR-92b及miR-106b后，BGC-823胃癌細胞增殖減弱，凋亡誘導增加，轉(zhuǎn)移能力顯著下降，提示候選miRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

由于動物miRNA作用的多靶性和聯(lián)合效應(yīng)的特征，一條miRNA可以作用于上百條目的基因，而多條miRNA同樣可以共同作用于一條靶基因[2]。miR-17-92 是由7條miRNA(miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20、miR-19b-1和miR-92-1)組成的表達簇，位于一個具有開放讀碼框的基因C13orf25內(nèi)，miR-17-92 家族與致癌基因myc協(xié)同作用，加速了腫瘤在B細胞淋巴瘤小鼠模型中的發(fā)展[8]。Bobbili等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-106b-25基因簇(miR-106b和miR-93)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子E2F1的轉(zhuǎn)錄，同時受E2F1的反饋調(diào)節(jié)，其高表達能夠下調(diào)TGF-β的腫瘤抑制作用，干擾CDKN1A和BCL2L11基因的表達，在胃癌的發(fā)生中起重要作用。所以有必要對多條miRNA同時進行干預(yù)。本研究中，我們成功構(gòu)建DOX誘導表達的多重靶向候選miRNA的抑制物，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細胞株，在DOX的誘導下BGC miRNATet-On細胞株的移植瘤逐漸減少，甚至在第31天，該組有2只裸鼠的腫瘤幾乎消失了，而對照組細胞移植瘤則沒有出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR-29b、miR-92b及miR-106b與胃癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，聯(lián)合阻斷上述miRNA可明顯抑制胃癌細胞體內(nèi)外生長，為今后開發(fā)靶向miRNA治療胃癌轉(zhuǎn)移的藥物提供依據(jù)。