大鼠急性心肌梗死后NLRP3炎性體-IL-1β信號軸激活與End-MT的關(guān)系*

湯石林， 劉一劍， 彭良善， 趙正亮， 譚一清， 王橋生

(1南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 湖南 衡陽 421001； 2長沙市第三醫(yī)院心內(nèi)科， 湖南 長沙 410015)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是指在冠狀動脈發(fā)生病理性變化基礎(chǔ)上所引發(fā)的冠脈血流急劇減少，從而導(dǎo)致心肌局部持續(xù)性缺血壞死，作為心血管領(lǐng)域常見的危重急癥之一，嚴(yán)重威脅人類健康。目前，隨著冠脈介入、溶栓及搭橋等技術(shù)及藥物治療的不斷完善，AMI的猝死風(fēng)險顯著降低，但其引發(fā)的心力衰竭(heart failure，HF)仍無有效治療手段。心肌纖維化作為HF晚期病變的共同特征，對其發(fā)生機制的深入探討，將有效改善AMI后HF進程。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性體(inflammasome)作為細胞內(nèi)模式識別受體的重要組成部分，由NLRP3、接頭蛋白 ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain)和pro-caspase-1組成，可被多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)激活，包括微生物成分及晶體物質(zhì)如膽固醇晶體、單鈉尿酸鹽(monosodium urate,MSU)晶體、硅石等[1]，其激活后促進pro-caspase-1的自我剪切，形成具有活性的caspase-1，活化的caspase-1進一步促進白細胞介素1β前體(pro-interleukin-1β，pro-IL-1β)和白細胞介素18前體(pro-IL-18)水解為成熟的IL-1β和IL-18，從而發(fā)揮其對細胞功能的調(diào)控，在機體固有免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[2]。近來研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在AMI引發(fā)的心肌纖維化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3]，但其具體機制仍有待進一步研究。

內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，End-MT)是指內(nèi)皮細胞在受到多種因素的作用下逐步失去其形態(tài)和功能，并獲得間充質(zhì)細胞或肌成纖維細胞表型的生物學(xué)過程[4]。在AMI大鼠模型中，抑制End-MT過程，心肌纖維化程度得到明顯改善[5]，提示End-MT可調(diào)節(jié)AMI后心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)IL-1β作為機體內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的起始因子，在細胞水平促進成纖維細胞生長因子2的持續(xù)性產(chǎn)生與激活，后者通過觸發(fā)細胞內(nèi)的相關(guān)信號通路，促進End-MT[6-7]。然而，在AMI后心肌纖維化過程中，NLRP3炎性體作為IL-1β的主要來源，其持續(xù)性激活與End-MT的發(fā)生發(fā)展是否存在同一性尚未明確。本研究擬在動物水平探討AMI后心肌纖維化過程中NLRP3炎性體-IL-1β信號軸和End-MT之間的關(guān)系，為進一步改善 AMI后心肌纖維化及HF的發(fā)生發(fā)展提供新的研究思路及治療靶點。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

10～12周齡雄性SD大鼠購自南華大學(xué)醫(yī)用動物實驗中心；羊抗大鼠ASC多克隆抗體和大鼠IL-1β ELISA試劑盒購自Sigma；小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體、兔抗大鼠NLRP3多克隆抗體及兔抗大鼠caspase-1多克隆抗體購自Abcam；兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和成纖維細胞特異性蛋白1(fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP1)多克隆抗體購自北京博奧森公司；小鼠抗大鼠GAPDH 單克隆抗體購自愛必信(上海)生物科技有限公司；其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1動物模型的構(gòu)建 30只SD大鼠隨機分為假手術(shù)對照(sham)組及急性心肌梗死(AMI)組(n=15)。急性心肌梗死組大鼠空腹12 h，稱重，固定，備皮，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉。調(diào)整呼吸機參數(shù)(呼吸頻率45次/分，呼吸比1 ∶1)，測試大鼠疼痛反應(yīng)，深度麻醉后行氣管插管。插管成功后，切開大鼠腹部皮膚(劍突下至左側(cè)腋下)，鈍性分離肌肉及肋間肌，暴露心臟，可見心臟搏動，利用手術(shù)鑷緩慢分離心包膜，暴露心前壁，穿線結(jié)扎冠脈左前降支。結(jié)扎后肉眼可見心率減慢，結(jié)扎區(qū)域因缺血呈現(xiàn)蒼白色。假手術(shù)組按上述手術(shù)步驟進行至前降支穿線，不結(jié)扎。依次縫合肋間切口、肌肉及皮膚。術(shù)后3 d連續(xù)肌肉注射青霉素預(yù)防感染。

2.2動物取材 28 d后，大鼠空腹12 h，稱重，固定，備皮，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉。深度麻醉后，切開大鼠腹部皮膚，鈍性分離肌肉及肋間肌，暴露心臟，將心臟取出并用生理鹽水(4 ℃)反復(fù)沖洗，直至無積血流出，分離梗死區(qū)域，取出一部分進行蛋白提取，剩余部分固定于4%甲醛溶液，行石蠟包埋，切片。

2.3Masson染色 將心肌切片常規(guī)脫蠟至水，Weigert蘇木素染液染核10 min；蒸餾水充分水洗3次，每次5 min，鏡下觀察(如過染，用鹽酸乙醇分化)；麗春紅染液染色10 min；2%冰醋酸水溶液沖洗2 min；1%磷鉬酸水溶液分化2 min；苯胺藍染色液中染色3 min，2%冰醋酸水溶液沖洗2 min；脫水透明，中性樹膠封片，鏡下觀察，拍照。

2.4Western blot實驗 將收集好的組織裂解；用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量；加入SDS-PAGE(5×)蛋白上樣緩沖液，沸水煮5～8 min，冷卻， -20 ℃保存?zhèn)溆谩＿M行SDS-PAGE(80 V， 30 min； 120 V， 90 min)；轉(zhuǎn)膜(200 mA， 2 h)；TBST 封閉液(5%脫脂奶粉)封閉2 h；按比例用TBST配制抗NLRP3、ASC、caspase-1、α-SMA和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗3次，每次10 min；加入相對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗，室溫孵育2 h，TBST 洗3次，每次10 min；免疫印跡熒光檢測試劑盒顯影檢測，采用自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)拍攝分析。

2.5ELISA實驗 收集組織樣品，按試劑盒提供的方法，在含有IL-1β抗體的微孔板中加入100 μL待測樣品及標(biāo)準(zhǔn)品，室溫孵育2 h；傾除板孔內(nèi)液體，洗板3次；加入100 μL生物素標(biāo)記抗體，室溫孵育2 h；傾除板孔內(nèi)液體，洗板3次；加入HRP標(biāo)記的 II 抗，室溫孵育30 min，傾除板孔內(nèi)液體，洗板3次；加入顯色劑，室溫孵育15～20 min，終止反應(yīng)后，測定450 nm處的吸光度(A)值，計算IL-1β濃度。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

以GraphPad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AMI促進心肌纖維化

為進一步驗證AMI對心肌纖維化的影響，采用Masson染色檢測心肌纖維化水平。結(jié)果顯示，AMI組心肌纖維化水平明顯增加(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. AMI aggravated myocardial fibrosis. Myocardial fibrosis was detected by Masson staining. Mean±SD. n=15. *P<0.05 vs sham group.

2 AMI促進心肌End-MT

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AMI顯著下調(diào)內(nèi)皮細胞標(biāo)志物CD31和VE-Cadherin的表達，上調(diào)間充質(zhì)細胞標(biāo)志物α-SMA和FSP1的表達，見圖2。

3 AMI后，NLRP3炎性體-IL-1β信號通路激活與End-MT具有同一性

28 d后采用Western blot檢測受損心肌中NLRP3炎性體活性，ELISA檢測IL-1β的表達。發(fā)現(xiàn)AMI組的NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1及IL-1β的表達明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，提示在AMI大鼠心肌發(fā)生End-MT的同時，NLRP3炎性體-IL-1β信號途徑被顯著激活，兩者進程具有同一性，見圖3。

討 論

AMI作為冠心病的嚴(yán)重類型，常伴有心律失常、HF和心源性休克等一系列并發(fā)癥，具有較高的發(fā)生率及病死率，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[8]。AMI后，缺血壞死區(qū)域纖維化反應(yīng)明顯增加，并累及未受損區(qū)域，最終導(dǎo)致HF。我們研究發(fā)現(xiàn)，在AMI大鼠模型中，心肌纖維化程度明顯增加。因此，控制和改善心肌纖維化進程成為治療HF的關(guān)鍵靶點。

大量研究證實End-MT與心肌纖維化程度呈正相關(guān)，抑制End-MT可顯著改善心肌纖維化進程[9-10]。Western blot結(jié)果顯示，隨著AMI大鼠心肌纖維化水平的提高，其內(nèi)皮細胞正常表型逐漸丟失，并獲得間充質(zhì)細胞表型，End-MT進程加速，但在本研究中并未采用免疫組織化學(xué)染色的方法在組織中檢測End-MT的變化，存在一定局限性。同時，AMI可導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)增加，持續(xù)性的炎癥反應(yīng)又可進一步促進End-MT的發(fā)生發(fā)展，加速心肌纖維化及HF進程[11]。在AMI大鼠EndMT進展過程中，我們發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體及其下游產(chǎn)物caspase-1和IL-1β的表達也被顯著上調(diào)。NLRP3炎性體介導(dǎo)IL-1β的成熟與分泌作為啟動細胞內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)，在調(diào)節(jié)AMI后心肌纖維化及重塑過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。雖然在AMI 28 d后， NLRP3炎性體激活與EndMT進展具有同一性，其下游產(chǎn)物IL-1β又被證實參與了對End-MT調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，但兩者的相互作用方式仍有待進一步證實。

本實驗研究結(jié)果表明在AMI后心肌纖維化過程中，NLRP3炎性體-IL-1β信號軸激活與End-MT的上調(diào)同時發(fā)生，兩者之間的潛在作用將為AMI后HF的防治提供新靶點。

Figure 2.AMI promoted End-MT. The protein expression of CD31, VE-cadherin, α-SMA and FSP1 was determined by Western blot. Mean±SD. n=15. *P<0.05 vs sham group.

Figure 3.AMI activated NLRP3 inflammasome-IL-1β signaling axis. A: the results of Western blot for determining the protein expression of NLRP3, ASC, pro-caspase-1 and caspase-1; B: the level of IL-1β was measured by ELISA. Mean±SD. n=15. *P<0.05 vs sham group.