氧化石墨烯的制備、表征及其抗菌性能研究

張 鑫，施歡賢，任映坤

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽 712046；2.西北大學(xué)化工學(xué)院，西安 710069)

石墨烯是由碳原子以sp2雜化形成的六元環(huán)狀網(wǎng)型結(jié)構(gòu)的二維晶體[1]。石墨烯不溶于水且在常見有機(jī)溶劑中的分散性弱，因此限制了其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[2]。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯重要的衍生物之一，實(shí)驗(yàn)室中一般通過強(qiáng)酸氧化石墨制備GO[3]，GO是一個或幾個原子層厚度的石墨烯，其片層上下表面接有環(huán)氧基和羥基，邊緣為羥基、羰基及羧基[3-4]，因此，GO除了保留石墨烯的一些優(yōu)異特性如6個碳原子的骨架以及巨大的比表面積之外，具有親水性的羥基和羧基，水溶性明顯優(yōu)于石墨烯[5]，含氧活性基團(tuán)的存在提高了GO的表面活性并易于修飾[6-7]，使其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中有更廣泛的應(yīng)用[8-10]。其中石墨烯基材料的抗菌應(yīng)用也不斷被報道，如Au、Cu、Ag、Pt[11]、ZnO[12]、殼聚糖和抗生素等[13]，以及以GO為基底的納米材料復(fù)合物(如GO-Ag[14]、GO-ZnO[12]、GO-聚賴氨酸[15]、GO-抗生素[16]等)也有報道，而單獨(dú)氧化石墨烯在抗菌方面的應(yīng)用也是非常值得研究的。氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)見圖1。

本文以膨脹石墨粉為原料，采用改進(jìn)的Hummers多步法制備GO，并對其進(jìn)行形貌和光譜學(xué)表征，然后以制備的GO為抗菌材料，選取大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌探討GO的抗菌性能，并結(jié)合掃描電鏡探討GO對2種細(xì)菌的抗菌機(jī)理，以期為研制新的、高效安全的GO復(fù)合型抗菌劑提供依據(jù)。

圖1氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)

Fig.1 The structure of GO

1 儀器與試藥

1.1儀器 BS224S分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]； DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；GL-20G-Ⅱ離心機(jī)，恒溫THZ-320振蕩器(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KQ-300E超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Thermo Scientific Multiskan熱電FC酶標(biāo)儀(美國Multiskan FC公司)。

1.2試藥 膨脹石墨粉(graphite，Gt)、高錳酸鉀、氯化鋇、氫氧化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸(西隴化工股份有限公司)；硫酸(西安化學(xué)試劑廠)；氯化鈉(天津天力化學(xué)試劑有限公司)。以上化學(xué)試劑均為分析純及以上級別。生理鹽水(河北天成藥業(yè)股份有限公司)；瓊脂粉、蛋白胨、酵母提取物(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，均為分子生化級。

2 方法

2.1GO的制備 采用改進(jìn)的Hummers法、以Gt為原料多步制備GO[3-4]。具體過程：低溫階段，將含有100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的硫酸燒瓶置于冰浴中，在攪拌下向瓶中緩慢加入3 g Gt，之后加入高錳酸鉀12 g，攪拌并保持不高于4 ℃反應(yīng)20 min，直至溶液變?yōu)槟G色，用15 ℃水對反應(yīng)體系水浴2 h；中溫階段，反應(yīng)體系經(jīng)35 ℃水浴溫?zé)?0 min并不斷攪拌，得到墨綠色的懸浮液，同時瓶壁上有紫色沉淀；高溫階段，向反應(yīng)體系中緩慢加入高純水220 mL，期間溫度控制在80 ℃，并保持20 min；反應(yīng)結(jié)束后向體系中加入高純水至總體積600 mL，并控制溫度45 ℃，緩慢滴加體積分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫10 mL，混合液不斷有氣泡冒出，由褐色變?yōu)辄S色，反應(yīng)10 min后，混合液全部變?yōu)榻瘘S色絲光狀膠體，靜置24 h，抽濾，下層沉淀物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的鹽酸反復(fù)洗滌，至檢測無氯化鋇白色沉淀出現(xiàn)。所得沉淀用高純水洗滌，以8 000 r·min-1離心，重復(fù)洗滌、離心，至洗滌液pH值接近7，最后將沉淀置于真空干燥箱中，于60 ℃烘干，即得干燥的氧化石墨。

將一定量的氧化石墨加入到一定體積的超純水中，超聲使其溶解分散均勻，即得溶液及GO分散液。

2.2抗菌實(shí)驗(yàn) LB培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL(pH:7.0～7.2)，121 ℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g。

抗菌實(shí)驗(yàn)：采用大腸埃希氏菌(Escherichiacoli，ATCC 25922)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC 25923)作為實(shí)驗(yàn)菌種，根據(jù)國標(biāo)法使用平板計數(shù)方法計數(shù)和統(tǒng)計抗菌率[17]，整個操作過程均在無菌條件下進(jìn)行。取處于對數(shù)生長期的大腸埃希氏菌菌液(≈107cfu·mL-1)10 mL，置于離心機(jī)中以6 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，下層菌種重懸于50 mL生理鹽水中，用酶標(biāo)儀測定其在600 nm處的吸光度值約0.2時方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取菌懸液0.5 mL，用生理鹽水逐次稀釋1 000倍，取稀釋液80 μL涂布，作為空白對照組。向剩余菌懸液中加入滅過菌的一定量的 GO分散液，于室溫下磁力攪拌，分別在抗菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到不同時間各取反應(yīng)液0.5 mL，用生理鹽水逐次稀釋1 000倍，取稀釋液80 μL涂布。涂布后的培養(yǎng)皿放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)20 h，觀察每個培養(yǎng)皿中大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌菌落的分布，用平板計數(shù)法計數(shù)，GO抗菌率的計算采用以下公式[17]。

R=(B-C)/C×100%

其中R為抗菌率(%)，B為空白對照組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后樣品中細(xì)菌的平均存活數(shù)(cfu·mL-1)，C為實(shí)驗(yàn)結(jié)束后樣品中細(xì)菌的平均存活數(shù)(cfu·mL-1)。

2.3分析方法 GO的形貌和結(jié)構(gòu)用Carl Zeiss SIGMA掃描電子顯微鏡SEM(德國Zeiss公司)和Rigaku D/MAX 3CX-射線粉末衍射儀XRD(日本理學(xué)X射線衍射儀)分析、表面官能團(tuán)用PerkineElmer-650傅里葉紅外變換儀(美國PerkineElmer公司)分析；抗菌前后細(xì)菌形態(tài)的變化用掃描電子顯微鏡分析。

3 結(jié)果與討論

3.1GO的表征 膨脹石墨粉和氧化石墨烯的形貌見圖2。其中圖2A是Gt的SEM圖，可觀察到其表面平整、呈片層狀結(jié)構(gòu)、且層層堆積在一起；圖2B是GO的SEM圖，其表面不平整、褶皺較多、層與層之間明顯分開，說明環(huán)氧基和羥基等已成功插入到GO表面，增大了層間距，證明膨脹石墨基本轉(zhuǎn)化成氧化石墨烯。

圖2SEM照片

A.Gt；B.GO。

Fig.2 The SEM images

A．Gt;；B.GO.

圖3樣品的XRD和FTIR譜圖

A．XRD；B.FTIR。

Fig.3 The XRD and FTIR spectra of Gt and GO

A．XRD；B.FTIR.

Gt和GO的XRD譜圖見圖3A，從圖中可知Gt在2θ 26.5°的峰對應(yīng)石墨(002)晶面，是Gt的特征衍射峰[3]；GO在10.8°處的衍射峰對應(yīng)石墨烯(001)晶面[4]，是GO的特征衍射峰，由此可知，Gt被氧化后，26.5°處的衍射峰幾乎消失，說明Gt已基本轉(zhuǎn)化為GO。膨脹石墨粉和氧化石墨烯的FTIR光譜見圖3B，Gt在4 000～650 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)沒有明顯的吸收峰；對于GO，在3 500～3 000 cm-1出現(xiàn)的寬而強(qiáng)的吸收帶對應(yīng)的是-OH的氫氧伸縮振動峰，1 720 cm-1處的峰是C=C雙鍵的伸縮振動峰，1 624和1 030 cm-1處的吸收峰分別是由石墨粉氧化而來的羰基、烷氧基的伸縮振動峰[8]，說明Gt已氧化成GO。

3.2GO的抗菌性能分析 將質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的GO分別加入到A600處濁度為0.2的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生理鹽水50 mL中，2種細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上形成的菌落分布隨時間變化的照片見圖4。大腸埃希氏菌與GO混合后，細(xì)菌就開始失活，進(jìn)行到30 min時，大腸埃希菌的菌落數(shù)明顯減少、存活率降低，進(jìn)行到1 h GO的抗菌率可達(dá)99.8%以上；對于金黃色葡萄球菌，在2 h內(nèi)細(xì)菌的菌落數(shù)變化不大，進(jìn)行到3 h能觀察到菌落數(shù)減小、細(xì)菌存活率下降，直至4 h菌落密度明顯減小，此時 GO對金黃色葡萄球菌的抗菌率達(dá)65%。對比上下2組圖表明，GO對大腸埃希氏菌的抗菌效果較好。

圖42種細(xì)菌的菌落及存活率隨時間的變化圖(E為大腸桿菌組，S為金黃色葡萄球菌組)

Fig.4 The changes of the colony formed and their survival rate with time(E and S are the groups ofEscherichiacoliandStaphylococcusaureusrespectively)

2種細(xì)菌形態(tài)變化的SEM圖見圖5。圖5A和5B分別是對照組和加入GO 1 h后的大腸桿菌圖片，可觀察到對照組大腸桿菌的形態(tài)飽滿、莢膜清晰可見，而實(shí)驗(yàn)組圖5B明顯可見菌體表面粗糙、且邊界處有細(xì)胞內(nèi)容物泄漏；圖5C和5D是對照組和加入GO 4 h 后的金黃色葡萄球菌，對照組中細(xì)菌呈球狀、莢膜清晰，實(shí)驗(yàn)組中的金黃色葡萄球菌則出現(xiàn)了萎縮，且部分細(xì)菌莢膜已被破壞，細(xì)菌失活。由于金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁肽聚糖層厚于大腸埃希菌[18]，即前者的細(xì)胞壁厚于后者，可有效抵御GO對細(xì)菌的破壞，這種破壞包括GO鋒利的邊緣對細(xì)胞膜的劃傷[18]、氧化應(yīng)激引起的生物膜破裂[19]以及GO對細(xì)胞膜中磷脂分子的抽提[20]，均能引起細(xì)菌死亡，所以GO對大腸埃希菌的抗菌能力要優(yōu)于金黃色葡萄球菌。但以GO為基底的復(fù)合材料可能會改善GO在抗菌方面的不足，因此GO復(fù)合功能材料將會成為抗菌材料研制中的新希望。

圖5抗菌前后2種細(xì)菌的形態(tài)

A和B.對照組和抗菌1 h的大腸埃希氏菌；C和D.對照組和抗菌4 h的金黃色葡萄球菌。

Fig.5 The SEM images of the 2 bacteria

A and B.Escherichiacoli；C and D.Staphylococcusaureus.

4 結(jié)論

以膨脹石墨粉為原料，采用改進(jìn)的Hummers方法，通過多步制備了氧化石墨烯。SEM、XRD和FTIR表征結(jié)果證實(shí)了GO表面褶皺多、較薄，具有石墨烯(001)晶面的結(jié)構(gòu)組成，且表面有羥基、羧基、羰基和環(huán)氧基。評價了GO對大腸埃希氏菌(G+)和金黃色葡萄球菌(G-)的抗菌性能。結(jié)果表明，0.2 mg·mL-1GO分別與大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌菌液107cfu·mL-1作用1和4 h，其抗菌率分別可達(dá)到99%和65%，對大腸埃希氏菌的抗菌效果較好。