張 鑫,施歡賢,任映坤
(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,咸陽 712046;2.西北大學(xué)化工學(xué)院,西安 710069)
石墨烯是由碳原子以sp2雜化形成的六元環(huán)狀網(wǎng)型結(jié)構(gòu)的二維晶體[1]。石墨烯不溶于水且在常見有機溶劑中的分散性弱,因此限制了其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[2]。氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是石墨烯重要的衍生物之一,實驗室中一般通過強酸氧化石墨制備GO[3],GO是一個或幾個原子層厚度的石墨烯,其片層上下表面接有環(huán)氧基和羥基,邊緣為羥基、羰基及羧基[3-4],因此,GO除了保留石墨烯的一些優(yōu)異特性如6個碳原子的骨架以及巨大的比表面積之外,具有親水性的羥基和羧基,水溶性明顯優(yōu)于石墨烯[5],含氧活性基團的存在提高了GO的表面活性并易于修飾[6-7],使其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中有更廣泛的應(yīng)用[8-10]。其中石墨烯基材料的抗菌應(yīng)用也不斷被報道,如Au、Cu、Ag、Pt[11]、ZnO[12]、殼聚糖和抗生素等[13],以及以GO為基底的納米材料復(fù)合物(如GO-Ag[14]、GO-ZnO[12]、GO-聚賴氨酸[15]、GO-抗生素[16]等)也有報道,而單獨氧化石墨烯在抗菌方面的應(yīng)用也是非常值得研究的。氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)見圖1。
本文以膨脹石墨粉為原料,采用改進的Hummers多步法制備GO,并對其進行形貌和光譜學(xué)表征,然后以制備的GO為抗菌材料,選取大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌探討GO的抗菌性能,并結(jié)合掃描電鏡探討GO對2種細菌的抗菌機理,以期為研制新的、高效安全的GO復(fù)合型抗菌劑提供依據(jù)。
圖1氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)
Fig.1 The structure of GO
1.1儀器 BS224S分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]; DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);GL-20G-Ⅱ離心機,恒溫THZ-320振蕩器(上海安亭科學(xué)儀器廠);KQ-300E超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);Thermo Scientific Multiskan熱電FC酶標(biāo)儀(美國Multiskan FC公司)。
1.2試藥 膨脹石墨粉(graphite,Gt)、高錳酸鉀、氯化鋇、氫氧化鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);鹽酸(西隴化工股份有限公司);硫酸(西安化學(xué)試劑廠);氯化鈉(天津天力化學(xué)試劑有限公司)。以上化學(xué)試劑均為分析純及以上級別。生理鹽水(河北天成藥業(yè)股份有限公司);瓊脂粉、蛋白胨、酵母提取物(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司),均為分子生化級。
2.1GO的制備 采用改進的Hummers法、以Gt為原料多步制備GO[3-4]。具體過程:低溫階段,將含有100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的硫酸燒瓶置于冰浴中,在攪拌下向瓶中緩慢加入3 g Gt,之后加入高錳酸鉀12 g,攪拌并保持不高于4 ℃反應(yīng)20 min,直至溶液變?yōu)槟G色,用15 ℃水對反應(yīng)體系水浴2 h;中溫階段,反應(yīng)體系經(jīng)35 ℃水浴溫?zé)?0 min并不斷攪拌,得到墨綠色的懸浮液,同時瓶壁上有紫色沉淀;高溫階段,向反應(yīng)體系中緩慢加入高純水220 mL,期間溫度控制在80 ℃,并保持20 min;反應(yīng)結(jié)束后向體系中加入高純水至總體積600 mL,并控制溫度45 ℃,緩慢滴加體積分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫10 mL,混合液不斷有氣泡冒出,由褐色變?yōu)辄S色,反應(yīng)10 min后,混合液全部變?yōu)榻瘘S色絲光狀膠體,靜置24 h,抽濾,下層沉淀物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的鹽酸反復(fù)洗滌,至檢測無氯化鋇白色沉淀出現(xiàn)。所得沉淀用高純水洗滌,以8 000 r·min-1離心,重復(fù)洗滌、離心,至洗滌液pH值接近7,最后將沉淀置于真空干燥箱中,于60 ℃烘干,即得干燥的氧化石墨。
將一定量的氧化石墨加入到一定體積的超純水中,超聲使其溶解分散均勻,即得溶液及GO分散液。
2.2抗菌實驗 LB培養(yǎng)基的準(zhǔn)備:酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,蛋白胨10 g,蒸餾水1 000 mL(pH:7.0~7.2),121 ℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基:液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g。
抗菌實驗:采用大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,ATCC 25922)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC 25923)作為實驗菌種,根據(jù)國標(biāo)法使用平板計數(shù)方法計數(shù)和統(tǒng)計抗菌率[17],整個操作過程均在無菌條件下進行。取處于對數(shù)生長期的大腸埃希氏菌菌液(≈107cfu·mL-1)10 mL,置于離心機中以6 000 r·min-1離心5 min,棄上清液,下層菌種重懸于50 mL生理鹽水中,用酶標(biāo)儀測定其在600 nm處的吸光度值約0.2時方可進行后續(xù)實驗。取菌懸液0.5 mL,用生理鹽水逐次稀釋1 000倍,取稀釋液80 μL涂布,作為空白對照組。向剩余菌懸液中加入滅過菌的一定量的 GO分散液,于室溫下磁力攪拌,分別在抗菌實驗進行到不同時間各取反應(yīng)液0.5 mL,用生理鹽水逐次稀釋1 000倍,取稀釋液80 μL涂布。涂布后的培養(yǎng)皿放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)20 h,觀察每個培養(yǎng)皿中大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌菌落的分布,用平板計數(shù)法計數(shù),GO抗菌率的計算采用以下公式[17]。
R=(B-C)/C×100%
其中R為抗菌率(%),B為空白對照組在實驗結(jié)束后樣品中細菌的平均存活數(shù)(cfu·mL-1),C為實驗結(jié)束后樣品中細菌的平均存活數(shù)(cfu·mL-1)。
2.3分析方法 GO的形貌和結(jié)構(gòu)用Carl Zeiss SIGMA掃描電子顯微鏡SEM(德國Zeiss公司)和Rigaku D/MAX 3CX-射線粉末衍射儀XRD(日本理學(xué)X射線衍射儀)分析、表面官能團用PerkineElmer-650傅里葉紅外變換儀(美國PerkineElmer公司)分析;抗菌前后細菌形態(tài)的變化用掃描電子顯微鏡分析。
3.1GO的表征 膨脹石墨粉和氧化石墨烯的形貌見圖2。其中圖2A是Gt的SEM圖,可觀察到其表面平整、呈片層狀結(jié)構(gòu)、且層層堆積在一起;圖2B是GO的SEM圖,其表面不平整、褶皺較多、層與層之間明顯分開,說明環(huán)氧基和羥基等已成功插入到GO表面,增大了層間距,證明膨脹石墨基本轉(zhuǎn)化成氧化石墨烯。
圖2SEM照片
A.Gt;B.GO。
Fig.2 The SEM images
A.Gt;;B.GO.
圖3樣品的XRD和FTIR譜圖
A.XRD;B.FTIR。
Fig.3 The XRD and FTIR spectra of Gt and GO
A.XRD;B.FTIR.
Gt和GO的XRD譜圖見圖3A,從圖中可知Gt在2θ 26.5°的峰對應(yīng)石墨(002)晶面,是Gt的特征衍射峰[3];GO在10.8°處的衍射峰對應(yīng)石墨烯(001)晶面[4],是GO的特征衍射峰,由此可知,Gt被氧化后,26.5°處的衍射峰幾乎消失,說明Gt已基本轉(zhuǎn)化為GO。膨脹石墨粉和氧化石墨烯的FTIR光譜見圖3B,Gt在4 000~650 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)沒有明顯的吸收峰;對于GO,在3 500~3 000 cm-1出現(xiàn)的寬而強的吸收帶對應(yīng)的是-OH的氫氧伸縮振動峰,1 720 cm-1處的峰是C=C雙鍵的伸縮振動峰,1 624和1 030 cm-1處的吸收峰分別是由石墨粉氧化而來的羰基、烷氧基的伸縮振動峰[8],說明Gt已氧化成GO。
3.2GO的抗菌性能分析 將質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的GO分別加入到A600處濁度為0.2的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生理鹽水50 mL中,2種細菌在固體培養(yǎng)基上形成的菌落分布隨時間變化的照片見圖4。大腸埃希氏菌與GO混合后,細菌就開始失活,進行到30 min時,大腸埃希菌的菌落數(shù)明顯減少、存活率降低,進行到1 h GO的抗菌率可達99.8%以上;對于金黃色葡萄球菌,在2 h內(nèi)細菌的菌落數(shù)變化不大,進行到3 h能觀察到菌落數(shù)減小、細菌存活率下降,直至4 h菌落密度明顯減小,此時 GO對金黃色葡萄球菌的抗菌率達65%。對比上下2組圖表明,GO對大腸埃希氏菌的抗菌效果較好。
圖42種細菌的菌落及存活率隨時間的變化圖(E為大腸桿菌組,S為金黃色葡萄球菌組)
Fig.4 The changes of the colony formed and their survival rate with time(E and S are the groups ofEscherichiacoliandStaphylococcusaureusrespectively)
2種細菌形態(tài)變化的SEM圖見圖5。圖5A和5B分別是對照組和加入GO 1 h后的大腸桿菌圖片,可觀察到對照組大腸桿菌的形態(tài)飽滿、莢膜清晰可見,而實驗組圖5B明顯可見菌體表面粗糙、且邊界處有細胞內(nèi)容物泄漏;圖5C和5D是對照組和加入GO 4 h 后的金黃色葡萄球菌,對照組中細菌呈球狀、莢膜清晰,實驗組中的金黃色葡萄球菌則出現(xiàn)了萎縮,且部分細菌莢膜已被破壞,細菌失活。由于金黃色葡萄球菌細胞壁肽聚糖層厚于大腸埃希菌[18],即前者的細胞壁厚于后者,可有效抵御GO對細菌的破壞,這種破壞包括GO鋒利的邊緣對細胞膜的劃傷[18]、氧化應(yīng)激引起的生物膜破裂[19]以及GO對細胞膜中磷脂分子的抽提[20],均能引起細菌死亡,所以GO對大腸埃希菌的抗菌能力要優(yōu)于金黃色葡萄球菌。但以GO為基底的復(fù)合材料可能會改善GO在抗菌方面的不足,因此GO復(fù)合功能材料將會成為抗菌材料研制中的新希望。
圖5抗菌前后2種細菌的形態(tài)
A和B.對照組和抗菌1 h的大腸埃希氏菌;C和D.對照組和抗菌4 h的金黃色葡萄球菌。
Fig.5 The SEM images of the 2 bacteria
A and B.Escherichiacoli;C and D.Staphylococcusaureus.
以膨脹石墨粉為原料,采用改進的Hummers方法,通過多步制備了氧化石墨烯。SEM、XRD和FTIR表征結(jié)果證實了GO表面褶皺多、較薄,具有石墨烯(001)晶面的結(jié)構(gòu)組成,且表面有羥基、羧基、羰基和環(huán)氧基。評價了GO對大腸埃希氏菌(G+)和金黃色葡萄球菌(G-)的抗菌性能。結(jié)果表明,0.2 mg·mL-1GO分別與大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌菌液107cfu·mL-1作用1和4 h,其抗菌率分別可達到99%和65%,對大腸埃希氏菌的抗菌效果較好。