復(fù)視明膠囊的抗炎和鎮(zhèn)痛作用

許 璐，何萌杉，張明科，王四旺*

(1．空軍軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所，西安 710032；2．西安樂健生物科技有限公司，西安 710032)

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見和嚴(yán)重的微血管慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致失明的常見原因之一[1]，其發(fā)病率隨糖尿病病程的發(fā)展而增高，影響患者的身體健康并增加醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。近年臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展過程中起重要作用，慢性炎癥不僅能夠加快視網(wǎng)膜病變，還能導(dǎo)致視網(wǎng)膜嚴(yán)重變性，甚至引起盲證[1-4]。檢測糖尿病視網(wǎng)膜病變治療藥物的抗炎作用是判斷試藥的重要指標(biāo)。復(fù)視明膠囊所含的主要成分為西洋參、黃芪、熟地黃、當(dāng)歸、決明子、紅花、珍珠、葛根、枸杞子、水蛭、絲瓜絡(luò)和桂枝等中藥；方中多味中藥具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用[5-11]，但作為整方的藥效學(xué)作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了耳腫脹的急性炎癥模型和棉球肉芽腫的慢性炎癥小鼠模型，以及經(jīng)典的扭體法和熱板法的疼痛模型，研究復(fù)視明膠囊的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，為復(fù)視明膠囊的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 BSA224S賽多利斯分析天平(德國賽多利斯公司)；微量加樣器(吉爾森公司)；RB-200智能熱板儀(成都泰盟科技有限公司)；手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械有限公司)等。

1.2試藥 復(fù)視明膠囊(西安樂健生物科技有限公司)；阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號BJ33006)；羥苯磺酸鈣膠囊(北京京豐制藥集團(tuán)有限公司，批號 151106)；布洛芬緩釋膠囊(中美天津史克制藥有限公司，批號16110685)；75%乙醇消毒液(寶雞市康利工貿(mào)有限公司，批號20170406)；碘伏消毒液(德州安捷高科消毒制品有限公司，批號20170402)；二甲苯(批號20140617)，冰醋酸(批號20160718，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.3動(dòng)物 昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄兼有，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK(軍)2012-0007。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食飲水，保持通風(fēng)，定時(shí)清潔。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1復(fù)視明膠囊對二甲苯所致小鼠耳腫脹的作用 將體質(zhì)量為18～22 g的健康雄性昆明種小鼠(雌激素有一定的抗炎作用，故選用雄性小鼠)隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為模型組(蒸餾水)、陽性對照組(阿司匹林300 mg·kg-1)、羥苯磺酸鈣組(250 mg·kg-1)及復(fù)視明膠囊低、中、高劑量組(400，800和1 600 mg·kg-1)。各組每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥30 min后，用微量移液器在小鼠右耳廓兩面均勻推注二甲苯0.02 mL致炎，左耳作空白對照。1 h后將小鼠脫頸處死，沿耳廓線剪下雙耳，用打孔器分別在同一部位打下圓耳片(8 mm)，精密稱定其質(zhì)量，以右耳片質(zhì)量減去左耳片的質(zhì)量差值作為腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率[12-14]。

抑制率=(模型組耳片腫脹度-給藥組耳片腫脹度)÷模型組耳片腫脹度×100%[14]

2.2復(fù)視明膠囊對小鼠棉球肉芽腫的影響 制備實(shí)驗(yàn)所需棉球，取脫脂棉制成10 mg直徑為6 mm的棉球，電子天平精密稱定質(zhì)量，高壓滅菌處理，置于烘箱內(nèi)干燥，備用。

將60只質(zhì)量為18～22 g的昆明種小鼠平均分為6組，每組10只，雌雄各半。分為模型組、陽性對照組、羥苯磺酸鈣組及復(fù)視明膠囊低、中、高劑量組，給藥劑量同2.1項(xiàng)下。用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的水合氯醛腹腔注射麻醉，涂抹脫毛膏脫去下腹部被毛，涂抹碘伏消毒，無菌條件下剪開下腹部正中皮膚，切口長1 cm，用鑷子小心擴(kuò)充皮下組織，向右側(cè)腹股溝皮下植入滅菌干燥棉球，用縫合線縫合切口，再涂抹碘伏消毒。手術(shù)后第2天開始，各組小鼠每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。術(shù)后第8天處死小鼠，手術(shù)分離取出棉球，剔干凈周圍脂肪組織，于60 ℃烘干24 h，稱定質(zhì)量，用該質(zhì)量減去棉球原質(zhì)量即得肉芽腫質(zhì)量[15-17]。

抑制率=(模型組肉芽腫質(zhì)量-給藥組肉芽腫質(zhì)量)÷模型組肉芽腫質(zhì)量×100%[17]

2.3復(fù)視明膠囊對醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)的作用 將60只體質(zhì)量為18～22 g的昆明種小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半。分為模型組、陽性對照組、羥苯磺酸鈣組及復(fù)視明膠囊低、中、高劑量組，依次給予蒸餾水、布洛芬(91 mg·kg-1)及羥苯磺酸鈣(250 mg·kg-1)及復(fù)視明膠囊高、中、低劑量組(400，800和1 600 mg·kg-1)。各組小鼠每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。第7天給藥前禁食12 h，不禁水。第7天給藥1 h后，以0.01 mL·g-1向小鼠腹腔注射6 mL·L-1的冰醋酸溶液(用微量移液器吸取0.15 mL冰醋酸移至25 mL量瓶中，加生理鹽水定容至刻度，搖勻)，記錄各組小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)后15 min內(nèi)的扭體次數(shù)，計(jì)算抑制率[17-19]。

抑制率=(模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))÷模型組扭體次數(shù)×100%[17-18]

2.4復(fù)視明膠囊對小鼠熱板實(shí)驗(yàn)的作用 使用智能熱板儀，調(diào)節(jié)溫度為55±5 ℃，本次實(shí)驗(yàn)選用雌性昆明種小鼠(雄性小鼠陰囊下垂，接觸到熱板較為敏感引起刺激反應(yīng)，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，故選用雌性小鼠)，記錄小鼠從接觸熱板儀底盤至出現(xiàn)舔后足的時(shí)間，作為其痛閾值。首先測定每只小鼠的基礎(chǔ)痛閾值，每次測定時(shí)間間隔至少5 min，共測2次，剔除喜跳躍者或痛覺表現(xiàn)不靈敏者，選擇平均痛閾值在5～30 s的小鼠進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。將符合要求的60只雌性小鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照組、羥苯磺酸鈣組及復(fù)視明膠囊低、中、高劑量組。給藥劑量同2.3項(xiàng)下。記錄末次給藥后小鼠在15，30，60和90 min時(shí)的痛閾值，若小鼠在熱板儀上超過60 s仍無舔足反應(yīng)，立即取出，按照60 s 計(jì)算，比較各組間差異[17-20]。

2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析對各組間進(jìn)行比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1復(fù)視明膠囊對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 實(shí)驗(yàn)觀察到，小鼠右耳片涂抹二甲苯后，與未涂抹二甲苯的左耳片比較，出現(xiàn)明顯的紅腫。見表1。由表1可知，與模型組比較，陽性對照組(阿司匹林)對二甲苯引起的耳腫脹抑制程度呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)，抑制率為38%。復(fù)視明膠囊低、中、高劑量組也對二甲苯所致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用(P<0.01)，抑制率分別為24%，31%和35%，復(fù)視明膠囊有較好的抗炎效果且對耳腫脹的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。羥苯磺酸鈣組對小鼠耳腫脹的抑制程度與復(fù)視明膠囊中劑量組效果近似，抑制率為30%。

3.2復(fù)視明膠囊對小鼠棉球肉芽腫的影響 見表2。由表2可知，模型組小鼠棉球肉芽腫質(zhì)量與原本棉球質(zhì)量比較顯著增加，與模型組比較，陽性對照組棉球肉芽腫質(zhì)量有極顯著性差異(P<0.01)，抑制率達(dá)41%。復(fù)視明膠囊低、中、高劑量組均對小鼠棉球肉芽腫有很好的抑制作用(P<0.01)，抑制率分別為23%，33%和37%，隨著給藥劑量的增加，復(fù)視明膠囊對小鼠棉球肉芽炎癥增生的抑制率也呈劑量依賴性。羥苯磺酸鈣組抑制率介于復(fù)視明膠囊低、中劑量組之間，抑制率為28%。

表1復(fù)視明膠囊對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

Tab.1 Effect of FSMC on swelling of mice ear caused by dimethyl xylene

(n=10)

注：與模型組比較**P<0.01。-表示用生理鹽水灌胃。

表2復(fù)視明膠囊對小鼠棉球肉芽腫的影響

Tab.2 Effect of FSMC on cotton pellet-induced granuloma in mice

組別劑量/g·kg-1動(dòng)物數(shù)量肉芽腫質(zhì)量/mg抑制率/%模型組—1033.68±5.45—陽性對照組0.301019.17±3.48**41羥苯磺酸鈣組0.25824.00±1.30**28復(fù)視明膠囊低劑量組0.40925.40±2.35**23復(fù)視明膠囊中劑量組0.801022.02±2.70**33復(fù)視明膠囊高劑量組1.601020.92±3.03**37

注：與模型組比較**P<0.01。-表示用生理鹽水灌胃。

3.3復(fù)視明膠囊對冰醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響 見表3。

由表3可知，與模型組比較，陽性對照組可明顯抑制小鼠因冰醋酸所致的扭體反應(yīng)次數(shù)，抑制率超過50%，鎮(zhèn)痛效果較好。復(fù)視明膠囊低、中、高劑量組小鼠的扭體次數(shù)明顯少于模型組，呈顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，抑制率分別為18%，22%和43%，其中復(fù)視明膠囊中、高劑量組對冰醋酸造成的小鼠扭體反應(yīng)的抑制作用具有極顯著性差異(P<0.01)，復(fù)視明膠囊低劑量組對冰醋酸造成的扭體反應(yīng)的抑制作用有顯著性差異(P<0.05)。復(fù)視明膠囊有鎮(zhèn)痛效果，對小鼠扭體反應(yīng)的抑制作用呈劑量依賴性增加。羥苯磺酸鈣組扭體反應(yīng)抑制作用與復(fù)視明膠囊高劑量組相當(dāng)，抑制率為48%。

表3復(fù)視明膠囊對冰醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響

Tab.3 Effect of FSMC on mice torsion reaction caused by acetic acid

(n=10)

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。-表示用生理鹽水灌胃。

3.4復(fù)視明膠囊對小鼠熱板法的結(jié)果分析 見表4。由表4可知，給藥后60 min，陽性對照組可明顯延長小鼠舔足時(shí)間，提高痛閾值(P<0.01)。給藥90 min后，觀察到復(fù)視明膠囊中、高劑量組以及阿司匹林組與模型組比較具有顯著差異(P<0.05)，復(fù)視明膠囊低劑量組與模型組比較對小鼠痛閾值有一定的提高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。羥苯磺酸鈣組對小鼠的熱板法造成的疼痛無抑制效果。復(fù)視明膠囊對中樞神經(jīng)痛的抑制作用效果不如外周神經(jīng)痛。

表4復(fù)視明膠囊對小鼠熱板法痛閾的影響

Tab.4 Effect of FSMC on the pain threshold of mice by hot-plate test (n=10)

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。-表示用生理鹽水灌胃。

4 討論

炎癥是機(jī)體應(yīng)對有害刺激而產(chǎn)生的一種防御機(jī)制，但也可能引起機(jī)體失調(diào)[12]。實(shí)驗(yàn)選用小鼠耳腫脹模型以及棉球肉芽腫模型模擬炎癥不同時(shí)期的表現(xiàn)，如二甲苯等致炎物質(zhì)引起的毛細(xì)血管通透性增加，炎癥細(xì)胞浸潤、急性滲出性水腫等為特征的急性炎癥模型，以及某些炎癥后期結(jié)締組織生長，生成肉芽組織的慢性炎癥模型[12，16]。實(shí)驗(yàn)可觀察到，復(fù)視明膠囊低、中、高劑量組對急性炎癥及慢性炎癥均有較好的抑制作用。復(fù)視明膠囊低、中、高劑量組均可減輕二甲苯所致的耳腫脹程度，且呈現(xiàn)量效關(guān)系，其中復(fù)視明膠囊高劑量組的效果最好。復(fù)視明膠囊對小鼠的棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)表明，其低、中、高劑量組均可抑制炎癥后期的肉芽組織增生、炎癥增殖，復(fù)視明膠囊低劑量組表現(xiàn)出與羥苯磺酸鈣組有相同的效果。

實(shí)驗(yàn)采用醋酸扭體法、熱板法觀察復(fù)視明膠囊的鎮(zhèn)痛作用[18]。醋酸扭體法作為一種經(jīng)典的鎮(zhèn)痛模型，可篩選出對外周神經(jīng)痛有較好抑制作用的藥物，醋酸是一種有強(qiáng)烈刺激性的化學(xué)物質(zhì)，注入腹腔內(nèi)可刺激腹膜，引起深部較大面積、較長時(shí)間的炎性疼痛，藥物若能對抗和清除體內(nèi)如組織胺、應(yīng)激肽等致痛物質(zhì)，則能抑制冰醋酸引起的扭體反應(yīng)[19]。實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)視明膠囊低、中、高劑量組均可抑制小鼠因化學(xué)刺激而引起的扭體反應(yīng)，減少小鼠扭體次數(shù)。熱板實(shí)驗(yàn)是一種常用的熱刺激模型，通過中樞神經(jīng)提高機(jī)體的痛閾而表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛作用。復(fù)視明膠囊中、高劑量組在90 min對小鼠熱刺激疼痛反應(yīng)表現(xiàn)出抑制作用，能夠延長小鼠舔足時(shí)間，提高小鼠痛閾值，提示復(fù)視明膠囊有一定的抑制中樞神經(jīng)疼痛的作用，但其對外周神經(jīng)痛的抑制效果更好。

綜上所述，復(fù)視明膠囊具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，為其臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其抗炎、止痛的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。