土地海苓煎顆粒質量標準研究

白 妮，張紅梅，劉 杰

(1.延安市中醫(yī)醫(yī)院，延安 716000；2.延安市疾病預防控制中心，延安 716000)

土地海苓煎顆粒為延安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室按照經(jīng)驗方獨家生產(chǎn)品種，批準文號為陜藥管制字[2001]第3694號。原方由黃芩、知母、豬苓及枳實等12味中藥組成；臨床主治濕熱下注所致之小便淋漓、灼熱、澀痛或尿頻尿急、小腹脹滿、腰困腰痛等癥。

土地海苓煎顆粒現(xiàn)行質量標準鑒別項僅有黃芩苷的TLC鑒別，專屬性不強，為完善該制劑的質量控制標準、提高患者用藥安全性，筆者對方中主要藥效成分進行了TLC鑒別，最終選取了3種分離度較好、斑點清晰、重復性好的成分列入質量標準。參考有關文獻[1-18]，在大量實驗的基礎上，首次采用雙波長法同時測定土地海苓煎顆粒中芒果苷和辛弗林的含量，作為本制劑的定量指標。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-20AT島津高效液相色譜儀(日本島津公司)；超聲波清洗器(上海安寧科學儀器公司)；TG328B分析天平(上海精科天平有限公司，精密度0.1 mg)。

1.2試藥 芒果苷對照品(批號131507-201402，質量分數(shù)99.6%)，辛弗林對照品(批號140716-201306，質量分數(shù)99.7%,中國食品藥品檢定研究院)；土地海苓煎顆粒(延安市中醫(yī)醫(yī)院，批號分別為：20161107，20161212，20170224，20170319，20170424，20170513，20170606，20170711，20170810和20170903，規(guī)格：12 g·袋-1)。

2 方法與結果

2.1TLC鑒別

2.1.1知母 取土地海苓煎顆粒48 g，研成細粉，加稀乙醇100 mL，超聲處理30 min，取濾液，蒸干，加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。稱取芒果苷對照品，用稀乙醇制成質量濃度為0.5 mg·mL-1的對照品溶液；取缺知母的樣品顆粒，按照供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。吸取上述3種溶液各15 μL，點于同一硅膠薄層板上，以甲苯-正丁醇-甲酸(3.5∶4∶5)為展開劑，展開，晾干，置于紫外光燈365 nm處檢視[9]。供試品色譜中，在與對照色譜相應位置上，顯相同的藍色斑點。陰性樣品無斑點。結果見圖1A。

2.1.2豬苓 取土地海苓煎顆粒48 g，研成細粉，加甲醇80 mL，超聲處理30 min，將濾液蒸干，用1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。稱取麥角甾醇對照品，用甲醇制成質量濃度為1.0 mg·mL-1的對照品溶液。取缺豬苓的樣品顆粒，按照供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。吸取上述3種溶液各20 μL，分別點于同一硅膠薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯(13∶1)為展開劑，展開，晾干，噴20 mL·L-1香草醛硫酸溶液，顯色，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫色斑點。陰性樣品無此斑點。結果見圖1B。

2.1.3枳實 取土地海苓煎顆粒48 g，研成細粉，加甲醇80 mL，超聲處理30 min，將濾液蒸干，用1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。稱取辛弗林對照品，用甲醇制成質量濃度為2 mg·mL-1的對照品溶液。取缺枳實的樣品顆粒，按照供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液。吸取上述3種溶液各20 μL，分別點于同一硅膠薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)的上層溶液為展開劑，展開，以質量濃度為5 g·L-1的茚三酮乙醇液為顯色劑，加熱至斑點顯色清晰。在供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同紫紅色的斑點。陰性樣品無此斑點。結果見圖1C。

圖1TLC圖

A:1.陰性樣品；2～4.供試品；5.芒果苷對照品。B:1.陰性樣品；2～4.供試品；5.麥角甾醇對照品。C:1.陰性樣品；2～4.供試品；5.辛弗林對照品。

Fig.1 TLC chromatograms

A:1.negative sample；2-4.sample；5.mangiferin.B:1.negative sample;2-4.sample;5.ergosterol.C:1.negative sample;2-4.sample;5.synephrine.

2.2含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：島津Shim-pack VP-ODS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(B)-水(A∶1 000 mL水中加入磷酸二氫鉀0.6 g、十二烷基磺酸鈉1.0 g和冰醋酸1.0 mL)，作梯度洗脫，0→30 min，50%B→80%B；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：258和285 nm；柱溫：30 ℃；在上述色譜條件下，2種待測組分均達到了基線分離。理論塔板數(shù)以芒果苷和辛弗林計均≥6 000；分離度>1.5；進樣量：10 μL。

2.2.2溶液的制備 對照品溶液：精密稱取芒果苷和辛弗林對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成質量濃度分別為150和750 mg·L-1的對照品溶液。

混合對照品溶液：精密稱取芒果苷和辛弗林對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成芒果苷和辛弗林質量濃度分別為150和750 mg·L-1的混合對照品溶液。

供試品溶液：精密稱取土地海苓煎顆粒10.0 g，研細，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，再加甲醇定容至刻度，過濾，即得。

陰性樣品溶液：按照處方比例及制備工藝，分別制備缺知母和枳實的陰性樣品，按照上述供試品溶液制備方法制得陰性樣品。

2.2.3專屬性實驗 取2.2.2項下制備的對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜測定儀，記錄色譜圖，結果顯示，陰性樣品對測定無干擾。見圖2。

圖2HPLC圖

A.芒果苷對照品(258 nm)；B.辛弗林對照品(285 nm)；C.供試品(258 nm)；D.供試品(285 nm)；E.缺知母陰性樣品(258 nm)；F.缺枳實陰性樣品(285 nm)；1.芒果苷；2.辛弗林。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mangiferin control (258 nm)；B.synephrine control (285 nm)；C.test sample (258 nm)；D.test sample (285 nm)；E.negative sample of missingAnemarrhenae(258 nm)；F.negative sample of missingFructusaurantiiimmaturus(285 nm)；1.mangiferin；2.synephrine.

2.2.4線性關系考察 分別精密吸取對照品溶液，用甲醇倍比稀釋，配制芒果苷質量濃度分別為150.0，75.0，37.5，18.8，9.4和4.7 mg·L-1的系列對照品溶液；辛弗林配成質量濃度分別為750.0，375.0，187.5，93.8和46.9 mg·L-1的系列對照品溶液，進樣測定，記錄色譜峰。以芒果苷、辛弗林的質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)，進行回歸分析，得芒果苷和辛弗林的線性方程分別為：y1=2.274 6x1-11.654(r1=0.999 9)和y2=0.443 2x2-3.109 7(r2=0.999 9)；芒果苷和辛弗林的線性范圍分別為4.7～150.0和46.9～750.0 mg·L-1，與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5精密度實驗 精密吸取芒果苷和辛弗林混合對照品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，芒果苷和辛弗林的峰面積RSD值分別為1.34%和1.14%。結果表明，所選儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12和24 h進樣，測定樣品中芒果苷和辛弗林的峰面積，結果芒果苷和辛弗林的RSD值分別為2.36%和2.45%，結果表明，供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復性實驗 精密稱取土地海苓煎顆粒10.102，10.113，10.245，10.018，10.124和10.112 g，按照2.2.2項下方法制備溶液，并按照2.2.1項下色譜條件進樣測定。樣品中芒果苷和辛弗林的平均含量(n=6)分別為0.058和2.418 mg·g-1；RSD值分別為1.56%和1.48%，結果表明，該方法重復性良好。

2.2.8回收率實驗 取6份已知含量的土地海苓煎顆粒，加入2.2.2項下制備的對照品溶液適量，進行色譜分析，記錄峰面積，計算加樣回收率，結果見表1。

表1回收率實驗結果

Tab.1 Results of recovery test (n=6)

2.2.9含量測定 取10個批次的土地海苓煎顆粒，按照2.2.2項下方法制備溶液，精密吸取對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，按照2.2.1項下色譜條件進行測定，用外標法計算樣品中芒果苷和辛弗林的含量，結果見表2。

表2不同批次土地海苓煎顆粒中芒果苷和辛弗林的含量測定結果

Tab.2 Content determination of mangiferin and synephrine in Tudihailingjian granules from different batches

(n=10)

3 討論

土地海苓煎顆粒的TLC鑒別中考察了不同極性組合的二元系統(tǒng)展開劑，最終確定的方法重復性和專屬性較好，可快速、有效地對土地海苓煎顆粒質量進行控制。HPLC法對成分較復雜的中藥具有良好的分離效果，且能有效提高樣品的分析效率[10-18]。本實驗采用HPLC法測定土地海苓煎顆粒中芒果苷和辛弗林的含量，結果表明，該法操作簡便、重復性好，分離度好，分析時間短。

從土地海苓煎顆粒的紫外掃描圖可知，辛弗林和芒果苷的最大吸收波長分別為285和258 nm，因此本實驗采用二極管陣列檢測器[19]，使用雙波長法同時快速地對土地海苓煎顆粒中2種成分的含量進行測定。

本實驗所建立的土地海苓煎顆粒質量標準TLC法專屬性強，分離度好，斑點顯色清晰；HPLC法分析時間短，準確度高，重復性好。較現(xiàn)行土地海苓煎顆粒質量標準有較大提高，可用于土地海苓煎顆粒的質量控制。