桑葉和桑枝不同炮制品中1-脫氧野尻霉素的含量測(cè)定

曾媛媛，李 瑤，姜 維，謝艷華，吳建華*，王四旺

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽(yáng) 712000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院，西安 710032；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所，西安 710032)

中藥源于自然界，經(jīng)炮制后方可用于臨床，這一獨(dú)特的加工過(guò)程對(duì)中藥藥效的發(fā)揮是一個(gè)質(zhì)的飛躍，其中關(guān)鍵的技術(shù)保障就是中藥炮制[1]。因此，中藥炮制直接關(guān)系中藥的臨床療效，是聯(lián)系中醫(yī)和中藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。作為一項(xiàng)傳統(tǒng)中藥制藥技術(shù)，中藥炮制的機(jī)制尚不清楚，炮制工藝的規(guī)范尚不完善，因此中藥飲片的質(zhì)量難以保證。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，中藥炮制過(guò)程中的科學(xué)內(nèi)涵不斷被揭示，為中藥飲片的規(guī)范化炮制和臨床合理應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)[3-5]。中藥炮制前后藥性和功效發(fā)生改變的基礎(chǔ)是化學(xué)成分發(fā)生變化，這種變化主要包括化學(xué)成分含量和化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變。由于中藥成分復(fù)雜，對(duì)于中藥炮制前后化學(xué)成分的研究主要集中在定量研究。

桑樹(shù)(MorusalbaL.)在歷代《本草》中被稱為神木，其根皮、果實(shí)、枝和葉皆可入藥[6-7]。桑枝具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、行水氣的功效[8]；桑葉可驅(qū)散風(fēng)熱、清肝明目[9-12]。桑葉味甘、苦、寒，歸肺、肝經(jīng)。桑葉蜜炙能增強(qiáng)潤(rùn)肺止咳的作用，故肺燥咳嗽多用蜜炙桑葉。蒸制具有改變藥物性能、擴(kuò)大用藥范圍的作用。鹽炙藥物，有引藥下行、增強(qiáng)補(bǔ)腎固精、利尿、清熱和滋陰降火涼血等作用，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地加入鹽炙的方法試圖改變桑葉的歸經(jīng)。桑枝味微苦，性平，歸肝經(jīng)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)桑枝采用了相同的炮制方法，最終檢測(cè)桑葉及桑枝不同炮制品中的1-脫氧野尻霉素的含量[13-16]，為進(jìn)一步明確不同炮制品中1-脫氧野尻霉素的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考[3,17-18]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-30AD型高效液相色譜儀(日本SMIMADZU公司，包括SIL-30AC型自動(dòng)進(jìn)樣器和CTO-30A型柱溫箱)；API 4000質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司，包括Analyst Softwara數(shù)據(jù)分析采集軟件)；BP221S型萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；TDZ5-WS高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.2試藥 1-脫氧野尻霉素對(duì)照品(上海盛中醫(yī)藥化工有限公司，CAS號(hào)：19130962)；乙腈為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為自制超純水；鹽酸和甲醇均為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

供試桑葉和桑枝均來(lái)源于陜西省安康市石泉縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授鑒定為?？浦参锷?MorusalbaL.)的干燥葉和干燥嫩枝，經(jīng)檢驗(yàn)，符合《中國(guó)藥典》2015年版該品種項(xiàng)下的規(guī)定。桑葉和桑枝炮制品由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院炮制實(shí)驗(yàn)室加工炮制。

蜜炙：取煉蜜，加適量沸水稀釋，淋入凈制藥材中拌勻，稍悶，置于熱鍋內(nèi)，文火(100～120 ℃)炒至不黏手時(shí)取出，晾干(每100 kg藥材，用煉蜜25 kg)，粉碎，過(guò)60目篩。

鹽炙：取食用鹽，加4倍量水稀釋，淋入凈制藥材中拌勻，潤(rùn)至鹽水被藥材吸盡后，置于鍋內(nèi)用文火炒至發(fā)黃，取出，晾干，粉碎，過(guò)60目篩。

蒸制：取凈藥材，置于籠屜內(nèi)，下墊清潔細(xì)麻布，蒸1 h，取出，曬干，粉碎，過(guò)60目篩。

2 方法與結(jié)果

2.1UPLC-MS/MS測(cè)定條件

2.1.1色譜條件 Agilent HILIC plus色譜柱(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.5 mL·L-1甲酸氨水溶液(10∶90)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子化(ESI)；檢測(cè)方法：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴霧電壓：5 500 V；加熱溫度：550 ℃；載氣：氮?dú)?；流速?20 L·min-1。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液 生品：取原藥材，除去雜質(zhì)，搓碎，去柄，粉碎，過(guò)60目篩。

2.2.2對(duì)照品溶液 準(zhǔn)確稱取10 mg 1-脫氧野尻霉素對(duì)照品，溶于10 mL 100 mL·L-1的乙腈水溶液，配成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。將上述對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋，分別配成質(zhì)量濃度為50，100，200，400，800，1 600和3 200 ng·mL-1的對(duì)照品溶液，用0.22 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，取5 μL，進(jìn)樣。

2.2.3供試品溶液 精密稱取不同炮制品粉末0.1 g，置于10 mL離心管中，加100 mL·L-1乙腈水溶液5 mL漩渦混合2 min，超聲處理30 min，過(guò)濾，以12 000 r·min-1離心30 min，取上清液，殘?jiān)侔凑丈鲜霾襟E重復(fù)提取1次，合并2次上清液，用100 mL·L-1的乙腈水溶液定容至100 mL，用0.22 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，取5 μL，進(jìn)樣。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別將對(duì)照品、樣品按照2.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，得到UPLC-MS/MS色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，物質(zhì)分離度良好。

圖1UPLC-MS/MS圖

A.對(duì)照品；B.桑葉(原藥材)；C.桑葉(生品)；D.桑葉(鹽炙)；E.桑葉(蒸制)；F.桑葉(蜜炙)；G.桑枝(原藥材)；H.桑枝(鹽炙)；I.桑枝(蒸制)；J.桑枝(蜜炙)。

Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms

A.reference substance；B.mulberry leaf (natural medicinal materials)；C.mulberry leaf (the crude)；D.mulberry leaf (fried with salt)；E.mulberry leaf (steamed)；F.mulberry leaf (fried with honey)；G.mulberry twig (natural medicinal materials)；H.mulberry twig (fried with salt)；I.mulberry twig (steamed)；J.mulberry twig (fried with honey).

2.3.2線性關(guān)系考察 取2.2.2項(xiàng)下制備的系列對(duì)照品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，以1-脫氧野尻霉素對(duì)照品的質(zhì)量濃度(x)和色譜峰面積(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性擬合，得到了1-脫氧野尻霉素質(zhì)量濃度與色譜峰面積之間的線性回歸方程y=62.9x+1.62×104，r=0.992 6，結(jié)果表明，1-脫氧野尻霉素質(zhì)量濃度在50～3 200 ng·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將同一供試品溶液在0，2，4，8，16和24 h連續(xù)測(cè)定6次，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定峰面積，峰面積RSD值為0.98%。結(jié)果表明，1-脫氧野尻霉素在乙腈-水(1∶9)溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4精密度實(shí)驗(yàn) 將同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，RSD值為1.49%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 將同一批樣品平行稱取5份，按照2.2.2項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，測(cè)得1-脫氧野尻霉素的質(zhì)量濃度為63.62 μg·mg-1，RSD值為0.94%，結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.3.6加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱取已知含量(5.39%)的桑葉粉末58 mg，精密稱定，分別加入1-脫氧野尻霉素對(duì)照品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備，按照上述含量測(cè)定方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.7最低檢測(cè)限 在所選條件下，以信噪比等于3計(jì)，測(cè)得1-脫氧野尻霉素的最低檢測(cè)限為50 ng·mL-1。

2.4樣品測(cè)定 依法對(duì)桑葉不同炮制品中1-脫氧野尻霉素含量進(jìn)行測(cè)定，桑葉(原藥材)、桑葉(生品)、桑葉(鹽炙)、桑葉(蒸制)、桑葉(蜜炙)、桑枝(原藥材)、桑枝(鹽炙)、桑枝(蒸制)和桑枝(蜜炙)中1-脫氧野尻霉素的含量分別為5.34%，5.39%，2.68%，4.41%，2.95%，13.65%，9.44%，12.46%和10.04%。

表1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 The results of sample recovery test (n=3)

3 討論

3.1提取溶劑的選擇 用不同的提取溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如0.05 mol·L-1HCl、甲醇、稀甲醇、甲醇-水、乙腈-水(3∶7)、乙腈-水(2∶8)等，結(jié)果表明，采用乙腈-水(1∶9)溶液作為提取溶劑時(shí)，峰面積最大，含量最高。

3.2測(cè)定方法的選擇 1-脫氧野尻霉素的測(cè)定，以前多采用熒光檢測(cè)器，但樣品需要先進(jìn)行衍生化反應(yīng)后才可進(jìn)行檢測(cè)，具有操作程序繁瑣、衍生化反應(yīng)不穩(wěn)定等弊端。本文所選的UPLC-MS/MS法，既解決了以上問(wèn)題，又具有高靈敏度，方便了實(shí)驗(yàn)室和檢測(cè)機(jī)構(gòu)的操作，具有較好的應(yīng)用前景。

3.3色譜條件的優(yōu)化 分別比較了Agilent XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent HILIC plus(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)柱，發(fā)現(xiàn)采用前者色譜柱分離1-脫氧野尻霉素時(shí)，分離度較差，峰形呈圓頭或平頭，無(wú)法達(dá)到定量要求，改變流動(dòng)相也無(wú)法達(dá)到想要的結(jié)果，采用后者后，可明顯看到分離度提升，峰形改善且分析時(shí)間縮短。考察流動(dòng)相時(shí)，發(fā)現(xiàn)用甲醇溶解時(shí)峰形有拖尾，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)選后，乙腈比例過(guò)高時(shí)峰形不理想，加大水相可逐漸改善，以乙腈-0.5 mL·L-1甲酸氨水溶液(10∶90)時(shí)峰形最好。

3.4檢測(cè)結(jié)果 由對(duì)桑葉和桑枝不同炮制品的1-脫氧野尻霉素含量測(cè)定結(jié)果可知，桑葉和桑枝炮制后其1-脫氧野尻霉素含量均降低，桑葉生品的含量大于桑葉原藥材中的含量，可能是因?yàn)樯Ｈ~生品是原藥材凈制后揀枝梗的原因。經(jīng)調(diào)查，目前中醫(yī)多采用生品入藥。由此可見(jiàn)，桑葉多生用具有一定的科學(xué)依據(jù)。而本實(shí)驗(yàn)桑枝粉末中1-脫氧野尻霉素的含量普遍高于桑葉粉末中的含量，主要原因是在樣品的處理過(guò)程中1 g桑枝粉末來(lái)源于4.1 g桑枝原藥材，1 g桑葉粉末來(lái)源于1.5 g桑葉原藥材，因而同等質(zhì)量的桑葉原藥材和桑枝原藥材，桑葉中的1-脫氧野尻霉素含量高于桑枝中的1-脫氧野尻霉素含量，這為桑葉中1-脫氧野尻霉素的利用提供了理論依據(jù)。