17β-雌二醇/微小核糖核酸-21信號(hào)通路抑制低氧性肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)的機(jī)制研究

沈麗曉，袁博云，王麗，袁雅冬

肺動(dòng)脈高壓（PH）是一種臨床高發(fā)的慢性肺循環(huán)疾病，低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）屬于PH中的第三大類，肺小動(dòng)脈收縮與血管重建是其發(fā)生、發(fā)展的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[1]。雌激素在體內(nèi)主要由卵巢成熟濾泡分泌，行卵巢切除術(shù)后自身分泌的雌激素水平會(huì)明顯降低，而17β-雌二醇（E2）被認(rèn)為是體內(nèi)天然存在的三種雌激素（包括雌二醇、雌酮和雌三醇）中生物活性最強(qiáng)的[2]，關(guān)于其對肺血管保護(hù)作用的研究也日益增多。微小核糖核酸（miRNA）是一組長約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小RNA[3]，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。近期研究顯示，miRNA介導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）增殖的各種分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制在HPH發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[4，5]。本研究旨在建立慢性去勢HPH大鼠模型，研究經(jīng)E2干預(yù)后miRNA-21（miR-21）、增殖細(xì)胞核抗體（PCNA）在肺動(dòng)脈中表達(dá)的變化，并進(jìn)一步體外培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（hPASMC），驗(yàn)證E2對肺血管的保護(hù)作用是否通過下調(diào)miR-21表達(dá)進(jìn)而影響PASMC增殖而實(shí)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

6～7周齡SD雌性大鼠32只，體重（200±10）g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證編號(hào)：1511341）。hPASMC購自美國Sciencell公司。

1.2 試劑及儀器

低氧環(huán)境動(dòng)物試驗(yàn)箱（CJ-DO2245，長沙長錦科技有限公司）；MCO-15AC二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（三洋公司，日本）；Thermo3131三氣培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司，美國）；雙色近紅外成像系統(tǒng)Odyssey CLx（LI-COR公司，美國）；BioTek Cytation 3細(xì)胞成像酶標(biāo)儀（BioTek儀器有限公司，美國）；Powerlab生理記錄儀（AD器械有限公司，澳大利亞）；Gene Amp 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）系統(tǒng)9700（ABI公司，美國）；7500 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（ABI公司，美國）；電泳、電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）；E2（進(jìn)口分析純度， Sigma公司，美國）；兔抗大鼠PCNA抗體（武漢proteintech公司）；近紅外熒光抗兔二抗（Abcam公司，英國）；Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）；實(shí)時(shí)PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司，美國）；引物（Invitrogen公司，美國）。平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基（SMCM）、平滑肌細(xì)胞生長因子（SMCGS）、胎牛血清（FBS）均購自美國Sciencell公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后行卵巢切除術(shù)，術(shù)后1周隨機(jī)分入常氧組、常氧+E2組、低氧組、低氧+E2組，每組8只。兩個(gè)E2干預(yù)組大鼠每日皮下注射E2 20 μg/kg，余組大鼠注射等量生理鹽水。兩個(gè)低氧組大鼠置于氧氣濃度為（10.0±0.5）%的低氧環(huán)境動(dòng)物試驗(yàn)箱中，以鈉石灰和無水氯化鈣吸收多余的CO2和水分，控制CO2濃度＜0.5%，每天持續(xù)低氧24 h，兩個(gè)常氧組置于正?？諝庵酗曫B(yǎng)外，余飼養(yǎng)條件同低氧組。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：將hPASMC在專用培養(yǎng)液（配方：2% FBS、0.5% SMCGS、0.5%青霉素/鏈霉素溶液和SMCM）中培養(yǎng)，隔天換液1次，第5～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長達(dá)50%融合后，用不含F(xiàn)BS的無酚紅培養(yǎng)基孵育24 h，使細(xì)胞生長同步化，傳代后分為3組：常氧組、低氧組、低氧+E2（10-6mol/L）組。常氧組置于37℃、5% CO2、95%空氣的MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，兩個(gè)低氧組置于37℃、5%CO2、92%氮?dú)獾腡hermo3131三氣培養(yǎng)箱中孵育24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 肺小動(dòng)脈形態(tài)觀察及平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）、右心室肥厚指數(shù)（RVHI）測定

飼養(yǎng)8周后，大鼠腹腔內(nèi)麻醉，將連接壓力傳感器的微導(dǎo)管插入鈍性分離的右側(cè)頸外靜脈，連接Powerlab生理記錄儀記錄mPAP。測壓結(jié)束后放血處死，留取左肺上葉制成石蠟標(biāo)本，行蘇木素伊紅（HE）染色鏡下觀察肺小動(dòng)脈形態(tài)；取出大鼠心臟，剪去心房及脂肪、血管等組織，沿室間隔邊緣將右心室游離壁分離，吸干水分后用電子天平分別稱取右心室（RV）和左心室+室間隔（LV+S）的重量，計(jì)算RVHI來反映右心室肥厚程度的變化，公式：RVHI=RV/（LV+S）×100%。留取肺組織并游離出肺動(dòng)脈，待測miR-21及PCNA表達(dá)情況。

1.3.3 四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MMT）檢測細(xì)胞增殖

將細(xì)胞以5 000/孔接種于96孔板上，每孔設(shè)5個(gè)復(fù)孔，周圍設(shè)只加培養(yǎng)液的空白對照孔。同步化處理后常氧組、低氧組、低氧+E2組干預(yù)24 h后每孔加入20 μl MTT溶液（0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），水平搖床上低速避光震蕩10 min，應(yīng)用BioTek Cytation 3細(xì)胞成像酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm處的光密度（OD）值?？瞻卓渍{(diào)零，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三遍。

1.3.4 實(shí)時(shí)PCR檢測肺動(dòng)脈及hPASMC中miR-21、PCNA信使RNA（mRNA）水平

用Trizol法分別提取肺動(dòng)脈及細(xì)胞中的總RNA，應(yīng)用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測定總RNA濃度和純度，理想RNA純度為A260/A280在1.8～2.0之間。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega Goscript A5001）在冰上進(jìn)行操作，將2 μg總RNA加入到20 μl體系中合成cDNA，其中反轉(zhuǎn)miR-21時(shí)需加入特異miRNA的莖環(huán)引物1 μl，應(yīng)用Gene Amp PCR系統(tǒng)9700反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將2 μl cDNA加入到含目的基因上下游引物各 0.5 μl、2×GoTaq qPCR Master Mix 10 μl的20 μl反應(yīng)體系中，在7500 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 2 min預(yù)變性，（95℃15 s，60℃ 1 min）×40個(gè)循環(huán)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，按照F=2-△△ct分析結(jié)果。實(shí)時(shí)PCR檢測中用到的引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測中的引物序列

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s的形式表示，多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較采用方差分析中的LSD和SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.5 免疫印跡法檢測肺動(dòng)脈及hPASMC中PCNA蛋白水平

用加入蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，按說明書分別提取肺動(dòng)脈及細(xì)胞中的總蛋白，NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測定蛋白濃度。將蛋白樣品與SDS-PAGE上樣緩沖液混勻后95℃變性10 min。取等量蛋白樣品，經(jīng)10% SDS-PAGE，80 V恒壓電泳，當(dāng)預(yù)染蛋白marker出現(xiàn)2個(gè)條帶時(shí)將電壓調(diào)至120 V，所有條帶均出現(xiàn)后結(jié)束電泳。恒定電流200 mA 90 min，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。將PVDF膜5%脫脂奶粉的TBS中室溫封閉1 h，分別放入TBST液稀釋的一抗（PCNA 1:1 000，GAPDH 1: 2 000），4℃反應(yīng)過夜，次日TBST洗膜三次，每次10 min，然后放入近紅外熒光（680 nm）抗兔二抗工作液（1: 10 000）中室溫避光孵育1 h，TBST洗膜三次，每次10 min，打開雙色近紅外成像系統(tǒng)Odyssey CLx ，將膜放在該儀器的成像面板上進(jìn)行掃膜，并應(yīng)用其中的Image Studio軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

四組大鼠肺動(dòng)脈組織形態(tài)、mPAP和RVHI比較：8周后，光鏡下常氧組大鼠肺動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)皮細(xì)胞扁平連續(xù)分布均勻，常氧+E2組與常氧組無明顯差異；低氧組大鼠肺動(dòng)脈管壁均增厚，管腔狹窄，肺小動(dòng)脈中膜肥厚，中膜內(nèi)平滑肌細(xì)胞增殖明顯，低氧+E2組管壁厚度明顯低于低氧組（圖1）。低氧組較常氧組mPAP、RVHI均明顯升高（P均＜0.01）；常氧+E2組上述指標(biāo)較常氧組無明顯變化（P均＞0.05）；低氧+E2組上述指標(biāo)明顯低于低氧組（P均＜0.01），見表2和圖2。

圖1 四組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)比較(蘇木素伊紅染色，×40)

表2 四組大鼠平均肺動(dòng)脈壓和右心室肥厚指數(shù)比較(n=8,±s）

表2 四組大鼠平均肺動(dòng)脈壓和右心室肥厚指數(shù)比較(n=8,±s）

注：E2：17β-雌二醇。與常氧組比較*P＜0.01；與低氧組比較△P＜0.01。1 mmHg=0.133 kPa

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圖2 四組大鼠平均肺動(dòng)脈壓（2A）和右心肥厚指數(shù)（2B）比較（n=8）

四組大鼠肺動(dòng)脈中miR-21、PCNA mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（表3、圖3）：與常氧組相比，低氧組miR-21及PCNA mRNA、PCNA蛋白的表達(dá)均明顯上升（P均＜0.01）,常氧+E2組上述指標(biāo)無明顯變化（P均＞0.05）；低氧+E2組上述指標(biāo)雖仍高于常氧組，但已明顯低于低氧組（P均＜0.01）。

表3 四組大鼠肺動(dòng)脈中微小核糖核酸-21與增殖細(xì)胞核抗體表達(dá)水平比較（n=8,±s）

表3 四組大鼠肺動(dòng)脈中微小核糖核酸-21與增殖細(xì)胞核抗體表達(dá)水平比較（n=8,±s）

注：E2：17β-雌二醇。與常氧組比較*P＜0.01；與低氧組比較△P＜0.01

組別 微小核糖核酸-21 增殖細(xì)胞核抗體信使核糖核酸 蛋白常氧組 0.0362±0.0010 0.1015±0.0043 0.4906±0.0242常氧+E2組 0.0358±0.0111 0.1025±0.0034 0.5155±0.0284低氧組 0.1206±0.1642* 0.2677±0.0071* 1.7818±0.1719*低氧+E2組 0.0711±0.0073*△ 0.1777±0.0079*△ 1.1688±0.0645*△

圖3 四組大鼠肺動(dòng)脈中微小核糖核酸-21(3A)、增殖細(xì)胞核抗體信使核糖核酸(3B)和蛋白表達(dá)水平(3C)及蛋白電泳情況(3D)比較(n=8)

三組hPASMC增殖情況比較（表4、圖4）：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，與常氧組相比，低氧組細(xì)胞增殖明顯（P＜0.01），低氧+E2組細(xì)胞增殖程度較低氧組明顯減輕（P＜0.01）。

三組hPASMC中miR-21、PCNA mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（表4、圖5）：與常氧組相比，低氧組hPASMC中miR-21、PCNA mRNA和蛋白的表達(dá)明顯上升（P均＜0.01）；低氧+E2組hPASMC中上述指標(biāo)的表達(dá)雖仍高于常氧組，但較低氧組已明顯下降（P均 ＜0.01）。

表4 三組hPASMC增殖情況及微小核糖核酸-21、增殖細(xì)胞核抗體mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表4 三組hPASMC增殖情況及微小核糖核酸-21、增殖細(xì)胞核抗體mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：hPASMC：人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；mRNA：信使核糖核酸；MTT：四甲基偶氮唑藍(lán)比色法；E2：17β-雌二醇。與常氧組相比*P＜0.01；與低氧組相比△P＜0.01

組別 hPASMC增殖MTT(光密度值) 微小核糖核酸-21 增殖細(xì)胞核抗體信使核糖核酸 蛋白常氧組 0.5613±0.0193 0.0699±0.0060 0.0630±0.0017 0.5027±0.0111

圖4 三組hPASMC增殖情況比較

圖5 三組hPASMC中微小核糖核酸-21（5A）、增殖細(xì)胞核抗體信使核糖核酸（5B）和蛋白表達(dá)水平（5C）及蛋白電泳情況(5D)比較

3 討論

PH以肺血管重構(gòu)、肺血管阻力進(jìn)行性升高和右心功能進(jìn)行性衰竭為特征，病因復(fù)雜，致死率高，目前缺乏有效治療手段[6]。

miRNA是真核細(xì)胞中一組高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小核苷酸片段，長約22個(gè)核苷酸，最早由Lee等[3]在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)。研究表明，多種miRNA與血管再生相關(guān)，如miR-17/92、miR-21、miR-143/145等，其中關(guān)于miR-21的研究最為廣泛。

PH共同的病理改變：肺血管細(xì)胞異常增殖和抗凋亡，從而造成肺血管重構(gòu)。低氧刺激、炎癥反應(yīng)、BMPR2基因突變等多種因素均可導(dǎo)致PH，Parikh等[7]運(yùn)用生物信息網(wǎng)絡(luò)方法證明miR-21在三者聯(lián)系中是一個(gè)關(guān)鍵的miRNA，并在PH患者及多種嚙齒類動(dòng)物PH模型肺組織中表達(dá)上調(diào)。Yang等[8]研究表明在低氧暴露小鼠肺動(dòng)脈遠(yuǎn)端miR-21表達(dá)升高，無論暴露于低氧前或低氧后，降低miR-21表達(dá)均可減弱低氧誘導(dǎo)的PH和肺血管重構(gòu)，反之亦然。并發(fā)現(xiàn)當(dāng)體外培養(yǎng)的hPASMC過表達(dá)miR-21時(shí)，可引起PCNA、細(xì)胞周期素D1、B淋巴細(xì)胞瘤基因（bcl）-xl等增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)。本研究成功建立HPH大鼠模型，并在低氧暴露大鼠的肺動(dòng)脈中觀察到miR-21及與增殖相關(guān)的PCNA的表達(dá)上調(diào)，雖然動(dòng)物模型有差異，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Yang等[8]的研究一致，并進(jìn)一步通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-21的上調(diào)與PASMC增殖相關(guān)。Sarkar等[4]發(fā)現(xiàn)，hPASMC在低氧（3%的氧氣）環(huán)境培養(yǎng)6 h后，miR-21表達(dá)增加了3倍，培養(yǎng)24 h后，只增加2倍。本研究體外細(xì)胞培養(yǎng)24 h后miR-21表達(dá)增加了大約2倍，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中慢性低氧暴露使得肺動(dòng)脈中miR-21表達(dá)上調(diào)達(dá)3倍多。對于動(dòng)物水平與細(xì)胞水平表達(dá)不一致的現(xiàn)象我們考慮有以下幾點(diǎn)原因：（1）低氧處理時(shí)間不同所致。我們在細(xì)胞水平采取的是低氧24 h處理后檢測相應(yīng)指標(biāo)，而如前所述，隨著低氧時(shí)間的延長miR-21表達(dá)會(huì)較峰值有所下降。（2）其他細(xì)胞成分中miR-21的表達(dá)增加參與其中。肺動(dòng)脈血管壁分3層：含有成纖維細(xì)胞的外膜，以PASMC為主的中膜，只有一層內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)膜。且目前認(rèn)為miRNA參與肺血管收縮和重構(gòu)，既調(diào)控PASMC增殖、凋亡及表型轉(zhuǎn)化，又在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡起重要作用[9]。故推測這種組織與細(xì)胞水平增長程度不一致情況，可能與低氧同時(shí)上調(diào)了肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-21表達(dá)有關(guān)。相關(guān)研究表明，miR-21在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（PAEC）中作用機(jī)制復(fù)雜[7,10,11]，但無論在內(nèi)皮細(xì)胞還是平滑肌細(xì)胞，低氧條件下miR-21表達(dá)均上調(diào)，這便能使我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到合理解釋。

前期研究證明，慢性低氧導(dǎo)致去勢的大鼠形成更為嚴(yán)重的PH、肺動(dòng)脈重構(gòu)及右心室的肥厚；進(jìn)一步研究證實(shí)，E2干預(yù)可以緩解慢性低氧性肺動(dòng)脈壓力的升高及肺血管重構(gòu)，在HPH中起保護(hù)作用[12-14]。此次研究結(jié)果與前期研究結(jié)果一致，需要說明的是，在常氧條件下，無論是單純?nèi)萁M還是去勢后又補(bǔ)充E2組，兩組無論是肺血管形態(tài)學(xué)、右心室肥厚程度還是mPAP均處于較一致水平，說明E2在低氧條件下才表現(xiàn)出顯著的肺血管保護(hù)作用。

從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平上，已經(jīng)證實(shí)miR-21參與了低氧誘導(dǎo)的肺血管重構(gòu)，并且多項(xiàng)研究表明其參與hPASMC增殖，那么E2對肺血管的保護(hù)作用是否通過調(diào)節(jié)miR-21來實(shí)現(xiàn)的呢？為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們在動(dòng)物水平及細(xì)胞水平均添加了E2干預(yù)因素，結(jié)果表明E2對肺血管的保護(hù)作用可能是通過下調(diào)miR-21表達(dá)從而抑制PASMC增殖實(shí)現(xiàn)的。E2與miR-21之間存在相關(guān)性，E2通過抑制miR-21表達(dá)發(fā)揮作用早在2009年就被Wickramasinghe等[15]證實(shí)，他們的研究顯示，在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，E2通過激活的雌激素受體（ER）來抑制miR-21的表達(dá)，同時(shí)miR-21的靶基因表達(dá)上調(diào)，其機(jī)制可能是雌激素同源受體ER α和ER β通過與miR-21啟動(dòng)子中具有雌激素效應(yīng)元件的配體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。后來Selcuklu等[16]也報(bào)道了此關(guān)系，但兩者研究的均是乳腺癌細(xì)胞，雌激素直接通過結(jié)合配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子ER α和ER β，間接激活與細(xì)胞膜相關(guān)的ER來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而不斷激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級導(dǎo)致基因的異常表達(dá)[17]。那么在肺血管細(xì)胞中E2與miR-21之間是否也通過ER α、ER β或者GPR30受體來實(shí)現(xiàn)相互作用，抑或存在其他信號(hào)通路？另外鑒于miR-21同時(shí)存在于PASMC及PAEC中，該實(shí)驗(yàn)未進(jìn)一步體外培養(yǎng)PAEC檢測相應(yīng)指標(biāo)變化，故不能確定E2是否也調(diào)節(jié)了PAEC中miR-21的表達(dá)，這一系列問題尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。