艾灸關(guān)元穴對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠皮膚氧化應(yīng)激及MMP-1、TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響

靖 媛，張 苗，游世晶

（福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122）

衰老通常是指在正常情況下生物體發(fā)育成熟后，隨著年齡增長(zhǎng)機(jī)體發(fā)生的功能性和器官性衰退的漸進(jìn)過程［1］。皮膚是人體最大的器官，且暴露于體外，擔(dān)負(fù)著保護(hù)、感覺、調(diào)節(jié)體溫、分泌和排泄、吸收、代謝、免疫等諸方面的作用［2-3］，因此皮膚是機(jī)體衰老過程中最為明顯的器官之一。艾灸可以清除自由基、提高免疫功能、調(diào)整脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等以延緩衰老，其中以清除自由基，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激紊亂為首要［4］。 此外，基質(zhì)金屬蛋白酶-1（metalloproteinase-1，MMP-1）和它的組織型抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinase-1，TIMP-1）共同調(diào)節(jié)膠原代謝，維持真皮層的結(jié)構(gòu)，是皮膚松弛衰老的重要指標(biāo)［5］。關(guān)元穴是養(yǎng)生保健要穴，當(dāng)代學(xué)者已從實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了針灸關(guān)元的抗衰老作用［6-8］。因此，本研究選擇艾灸關(guān)元穴，觀察其對(duì)衰老大鼠皮膚衰老指標(biāo)的變化，研究其抗自由基、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激紊亂及對(duì)膠原合成與代謝的影響，對(duì)進(jìn)一步推廣艾灸抗衰老具有重要的基礎(chǔ)和應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡Wistar雄性大鼠60只，購(gòu)自于揚(yáng)州大學(xué)比較生物醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物許可證號(hào)［SCXK（蘇）2017-007］。 在相同光照條件下飼養(yǎng)，室溫控制在18～26℃，濕度65%～70%，自由攝食和飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 D-半乳糖 （美國(guó)Sigma公司），丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒、活性氧（ROS）測(cè)定試劑盒、過氧化物酶（CAT）測(cè)定試劑盒、羥脯氨酸（HYP）測(cè)定試劑盒、過氧化氫（H2O2）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］，膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白ⅢELISA試劑盒（南京百世金生物技術(shù)有限公司），可孚艾絨柱（臨湘市胡香艾生物科技有限公司），華佗牌針灸針（蘇州醫(yī)療用品有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Bio-Rad 550型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），7552型分光光度計(jì)、7500型 RT-PCR儀（美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司），T214s分析天平［梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司］，GL-21M高速冷凍離心機(jī) （湖南湘儀離心機(jī)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，體重（200±20）g，按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、艾灸關(guān)元穴組、針刺關(guān)元穴組、艾灸足三里組、針刺足三里組，每組10只。參照文獻(xiàn)［9］中的造模方法，其中模型對(duì)照組、艾灸關(guān)元穴組、艾灸足三里組、針刺關(guān)元穴組、針刺足三里組大鼠按125 mg／（kg·d）劑量皮下注射 D-半乳糖，正常對(duì)照組大鼠每日注射等量生理鹽水，連續(xù)干預(yù)21 d。

2.2 干預(yù) 參照《大鼠穴位圖譜》定位大鼠關(guān)元、足三里穴位。艾灸關(guān)元穴組、艾灸足三里組灸前將關(guān)元、足三里穴區(qū)直徑約1.0 cm的鼠毛剪干凈，固定大鼠，暴露穴區(qū)皮膚，對(duì)準(zhǔn)穴位，點(diǎn)燃艾炷，艾灸時(shí)間約5 min，灸后局部皮膚略紅，無(wú)發(fā)泡；針刺關(guān)元穴組、針刺足三里組于同樣方法固定后分別取關(guān)元、足三里針刺，留針時(shí)間與艾灸時(shí)間一致，中間及出針前各行針一次；正常對(duì)照組及模型對(duì)照組大鼠只做抓取并固定，時(shí)間與其他治療組一致。各組每周均治療4次，連續(xù)治療3周。

2.3 標(biāo)本采集 選取大鼠適應(yīng)性生長(zhǎng)1周后、造模21 d后及治療7 d、14 d、21 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行眼內(nèi)眥靜脈叢取血，4℃靜置過夜待血液凝固后，4 000 r／min離心 10 min后分離血清，－80℃保存用于氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)42 d后，水合氯醛麻醉下用5%硫化鈉脫毛劑脫毛，切取大鼠頸背部皮膚約2 cm×3 cm，迅速液氮冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 標(biāo)本檢測(cè)

2.4.1 生化指標(biāo)測(cè)定 大鼠血清SOD、MDA、ROS、CAT、H2O2和皮膚SOD、HYP及MDA含量的測(cè)定，參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4.2 皮膚含水量測(cè)定 切取1 cm2皮膚，稱其濕質(zhì)量，隨即將其放入烘箱中，于80℃烘干12 h，稱其干質(zhì)量。

皮膚含水率／%＝［（濕質(zhì)量－干質(zhì)量）／濕質(zhì)量］×100%

2.4.3 皮膚膠原蛋白含量測(cè)定 大鼠皮膚膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ含量測(cè)定，參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4.4 MMP-1、TIMP-1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用Real-time PCR法檢測(cè)，TRIzol提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。目的基因引物MMP-1：上游 5'-CTCCCTTGGACTCACTCATTCTA-3'，下游5'-AGAACATCACCTCTCCCCTAAAC-3'；TIMP-1：上游 5'-TGGCATCCTCTTGTTGCTATC-3'，下游 5'-CGAATCCTTTGAGCATCTTAGTC-3'；內(nèi)參引物βactin：上游 5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游 5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'。 PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、Taq酶 10μL、ddH2O 6μL、上游和下游引物各 0.8μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s，PCR反應(yīng)95℃ 30 s、65 ℃ 30 s（40個(gè)循環(huán)）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 6組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表1。

表1 6組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

表1 6組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組艾灸關(guān)元穴組針刺關(guān)元穴組艾灸足三里組針刺足三里組n 10 10 10 10 10 10時(shí)間造模前造模后治療7 d治療14 d治療21 d造模前造模后治療7 d治療14 d治療21 d造模前造模后治療7 d治療14 d治療21 d造模前造模后治療7 d治療14 d治療21 d造模前造模后治療7 d治療14 d治療21 d造模前造模后治療7 d治療14 d治療21 d SOD／（U／mL）176.33±15.02 178.30±14.89 173.28±20.83 168.99±16.43 173.28±20.83 173.55±25.10 152.42±15.591）150.81±12.87 130.03±30.88 114.10±20.83 173.01±20.96 154.21±19.461）159.40±17.14 148.48±31.382）142.84±20.832）179.10±20.14 151.16±19.741）153.04±18.73 137.73±31.44 132.99±20.83 173.19±23.691）154.57±17.01 146.06±31.59 144.09±21.27 132.09±20.83 177.85±15.27 154.66±17.461）145.25±17.67 135.58±26.53 128.86±21.27 MDA ／（mmol／mL）4.12±0.46 4.31±0.96 4.74±0.72 4.75±0.84 4.80±0.90 4.15±0.77 6.95±1.671）7.71±0.89 9.13±0.67 9.60±1.01 4.49±0.87 6.84±1.061）6.58±1.15 8.02±1.622）6.60±1.272）4.67±1.62 6.87±1.331）7.53±1.40 9.00±1.00 8.42±1.57 4.50±0.971）6.53±1.23 7.81±1.53 8.69±1.25 7.61±1.70 4.35±0.67 6.98±1.721）7.19±1.28 9.00±1.05 8.66±1.50 H2O2／（mmol／L）24.84±4.71 26.14±5.34 27.13±4.37 24.97±3.67 26.36±4.09 25.27±3.89 34.16±5.921）32.69±4.80 30.30±4.51 29.65±3.72 23.63±4.60 34.12±4.981）30.91±5.59 30.48±4.20 32.47±4.862）23.63±4.60 34.12±4.981）30.91±5.59 30.48±4.20 32.47±4.86 23.37±3.861）35.33±4.33 32.77±6.08 31.04±3.76 31.99±2.39 24.49±5.08 36.63±3.661）32.90±3.23 31.65±4.75 32.30±3.88 CAT／（U／mL）23.92±3.73 24.52±4.31 24.39±4.77 22.66±2.89 23.88±3.70 24.84±3.57 14.98±4.171）14.09±3.22 13.76±3.46 12.81±3.54 24.49±3.72 14.41±5.441）14.70±4.49 19.80±5.332）19.23±4.792）23.13±4.22 15.56±4.961）14.56±5.10 15.56±4.96 14.83±5.09 23.68±2.331）14.86±2.61 14.04±3.16 16.66±3.09 16.55±4.66 23.34±4.76 15.32±5.561）15.07±3.98 14.41±5.58 14.42±4.98 ROS／（U／mL）566.73±43.22 570.69±56.76 592.75±45.75 575.76±56.14 560.56±67.15 537.31±58.97 631.42±63.291）636.65±73.85 641.23±46.18 674.10±82.38 574.53±79.39 640.62±109.441）636.65±73.85 609.97±60.662）621.79±29.052）558.61±46.84 657.75±87.901）643.69±71.78 627.26±65.78 658.04±43.72 582.75±60.321）661.03±102.14 630.85±113.38 618.44±61.48 633.51±47.96 568.23±46.88 650.59±95.161）635.42±74.67 647.39±77.26 661.42±42.35

3.2 6組大鼠皮膚組織HYP、MDA含量及SOD活性比較 見表2。

表2 6組大鼠皮膚組織HYP、MDA含量及SOD活性比較（±s）

表2 6組大鼠皮膚組織HYP、MDA含量及SOD活性比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，3） P＜0.01，4） P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組艾灸關(guān)元穴組針刺關(guān)元穴組艾灸足三里組針刺足三里組n 10 10 10 10 10 10 SOD（U ／mgprot）56.16±8.54 40.96±4.711）49.74±10.953）41.29±6.13 44.61±7.094）41.16±5.00 MDA（nmol／mgprot）26.90±4.56 39.88±7.931）30.83±6.534）37.11±5.69 30.53±4.304）35.15±3.49 HYP（μg／mg濕重）7.22±0.58 5.53±0.862）6.54±1.134）5.93±1.32 6.18±0.914）5.80±0.73

3.3 6組大鼠皮膚膠原蛋白含量及皮膚組織含水率比較 見表3。

表3 6組大鼠皮膚膠原蛋白含量及皮膚組織含水率比較（±s）

表3 6組大鼠皮膚膠原蛋白含量及皮膚組織含水率比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組艾灸關(guān)元穴組針刺關(guān)元穴組艾灸足三里組針刺足三里組n 10 10 10 10 10 10膠原蛋白Ⅰ ／（mg／g 濕重）0.135±0.019 0.097±0.0111）0.110±0.0102）0.099±0.008 0.105±0.0112）0.100±0.009膠原蛋白Ⅲ／（mg／g 濕重）0.428±0.052 0.353±0.0341）0.403±0.0652）0.378±0.066 0.389±0.0422）0.364±0.058含水率／%65.87±2.20 61.16±3.841）63.44±3.53 61.11±4.06 62.68±3.53 61.66±3.30

3.4 6組大鼠皮膚組織MMP-1與TIMP-1 mRNA表達(dá)比較 見表4。

表4 6組大鼠皮膚組織MMP-1與TIMP-1 mRNA 表達(dá)比較（±s）

表4 6組大鼠皮膚組織MMP-1與TIMP-1 mRNA 表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組艾灸關(guān)元穴組針刺關(guān)元穴組艾灸足三里組針刺足三里組n 10 10 10 10 10 10 MMP-1 0.243±0.033 0.595±0.0521）0.49±0.0322）0.58±0.034 0.55±0.0452）0.57±0.11 TIMP-1 0.208±0.023 0.577±0.0621）0.762±0.0822）0.620±0.081 0.657±0.0482）0.618±0.042

4 討論

自由基-氧化應(yīng)激學(xué)說是在Denham Hamman提出的自由基學(xué)說基礎(chǔ)上發(fā)展而成，為諸多學(xué)說的中心［10］。自由基過量產(chǎn)生，尤其是活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的堆積，破壞機(jī)體氧化和抗氧化平衡體系，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成衰老的發(fā)生［11］。隨著年齡增長(zhǎng)及外界因素的變化，人體內(nèi)抗氧化物質(zhì)減少，防護(hù)功能減退或發(fā)生障礙，自由基累積性增加，造成體內(nèi)各種大分子損傷，導(dǎo)致機(jī)體的病變和衰老［12］。MDA可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度［13］。ROS可引起脂質(zhì)過氧化，并且耗竭細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，加速皮膚老化，同時(shí)還可以激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞合成MMP-1，降解包括膠原蛋白、彈性蛋白在內(nèi)的多種基質(zhì)成分，從而形成老化性皮膚特有的臨床表現(xiàn)和病理改變。H2O2可以導(dǎo)致持續(xù)的活性氧ROS刺激，加劇氧化應(yīng)激損害，導(dǎo)致人體皮膚細(xì)胞衰老［14］。而SOD、CAT是生物氧化過程中重要的抗氧化酶，其活力可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。

另外，皮膚衰老與真皮層膠原蛋白的含量和性質(zhì)有關(guān)，真皮結(jié)構(gòu)改變是皮膚衰老的主要原因。實(shí)驗(yàn)研究表明，HYP的含量可以直接反映出真皮內(nèi)膠原纖維的含量變化［15］。皮膚中主要含有I型和Ⅲ型膠原蛋白，具有很強(qiáng)的抗張性，維持皮膚的彈性和張力。隨著年齡的增大，膠原蛋白的流失越來越快，尤其25歲以后，皮膚中Ⅲ型膠原蛋白的合成速度趕不上流失速度，最終導(dǎo)致皺紋、松弛等衰老現(xiàn)象。研究認(rèn)為［16］，衰老皮膚中Ⅲ型膠原合成會(huì)減少，當(dāng)皮膚衰老時(shí)，膠原應(yīng)力傳導(dǎo)下降，抗剪切力減弱。

MMP-1是降解I型和Ⅲ型膠原最主要的酶，當(dāng)體內(nèi)MMP-1過度表達(dá)時(shí)，特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，破壞膠原纖維和彈力纖維的正常結(jié)構(gòu)，真皮層結(jié)構(gòu)由于膠原蛋白的分解而遭到破壞［17］。因此MMP-1是導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)皺縮細(xì)紋等衰老癥狀最主要的酶，與TIMP-1共同維持真皮結(jié)構(gòu)［18］。

臨床試驗(yàn)已證實(shí)，抗氧化應(yīng)激治療可以改善皮膚的衰老狀態(tài)［19］。研究認(rèn)為，艾葉燃燒產(chǎn)物的甲醇提取物，有清除自由基作用［20］。施灸局部皮膚中過氧化脂質(zhì)顯著減少，此作用是艾葉燃燒生成物中的抗氧化物質(zhì)，附著在穴位處皮膚上，通過灸熱滲透進(jìn)人體內(nèi)而起作用。

關(guān)元為“人身陰陽(yáng)元?dú)饨魂P(guān)之處，為養(yǎng)生家聚氣凝神之所”，古今都將關(guān)元作為保健的要穴。艾灸關(guān)元可補(bǔ)攝下焦元?dú)?，扶助機(jī)體元陰元陽(yáng)，因而延年益壽。當(dāng)代學(xué)者亦從實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了針灸關(guān)元的抗衰老作用。

針灸抗衰老的實(shí)驗(yàn)研究較多，但延緩皮膚衰老的機(jī)制研究尚少。因此，本實(shí)驗(yàn)以D-半乳糖誘導(dǎo)皮膚衰老大鼠為模型，以氧化應(yīng)激紊亂及MMP-1／TIMP-1基因表達(dá)為客觀指標(biāo)，以艾灸或針刺為施加因素，并針對(duì)不同穴位關(guān)元或足三里作對(duì)照觀察。結(jié)果顯示：模型組血清及皮膚組織SOD、CAT活性顯著低于艾灸關(guān)元穴組，MDA、H2O2及ROS含量顯著高于艾灸關(guān)元穴組，模型組皮膚組織中MMP-1表達(dá)量高于艾灸關(guān)元穴組，關(guān)元穴組低于足三里組，且存在差異（P＜0.05），模型組TIMP-1表達(dá)量顯著低于艾灸關(guān)元穴組，艾灸關(guān)元穴組略高于足三里組。

因此，艾灸關(guān)元穴或足三里可調(diào)節(jié)D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠皮膚組織氧化應(yīng)激紊亂，關(guān)元穴效果優(yōu)于足三里穴位，針對(duì)MMP-1／TIMP-1基因表達(dá)調(diào)節(jié)，艾灸關(guān)元穴效果依然優(yōu)于艾灸足三里組，但針刺組與模型組無(wú)顯著性差異。由此可見，艾灸關(guān)元穴可以通過清除皮膚組織自由基，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激紊亂，調(diào)控MMP-1／TIMP-1在皮膚組織中的表達(dá)，抑制真皮層I、Ⅲ型膠原蛋白的降解等達(dá)到延緩皮膚衰老的效果，其深層次的調(diào)控通路還有待于進(jìn)一步挖掘和探索。