數(shù)字共焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)3維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的構(gòu)建

鄧文波,陳 華,聶 雄

(廣西大學(xué) 計(jì)算機(jī)與電子信息學(xué)院,南寧 530004)

引 言

在數(shù)字共焦顯微技術(shù)的研究中，顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的3維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(three-dimensional point spread function，3-D-PSF)的研究對3維顯微圖像復(fù)原有著重要的意義。3-D-PSF的準(zhǔn)確估計(jì)對3維顯微圖像的復(fù)原效果有很大的關(guān)系[1-4]。在3維顯微圖像復(fù)原方法的研究以及實(shí)際工程應(yīng)用中，采用的是理論點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)或者實(shí)驗(yàn)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。理論點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)可以通過光學(xué)系統(tǒng)傳輸函數(shù)模型進(jìn)行構(gòu)建[5-7]，也可以通過高斯型近似理論模型[3]構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)是通過實(shí)驗(yàn)獲取，主要是使用一個(gè)直徑盡可能小的熒光小球作為成像物體，在實(shí)驗(yàn)室條件下通過獲取熒光小球的成像信息構(gòu)建顯微成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)[8-11]。也可以以黑白跳變的圖像作為觀察物，利用CCD像平面上采集圖像進(jìn)行擬合，獲得光學(xué)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)[12]。

由于實(shí)驗(yàn)獲取的3維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)針對特定顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，因此,采用以正確方法獲取圖像復(fù)原處理用的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，比采用理論點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行圖像復(fù)原具有更為準(zhǔn)確的復(fù)原效果。

本文中以熒光微珠模擬點(diǎn)光源，通過數(shù)字共焦顯微鏡采集一系列熒光微珠的圖像，構(gòu)造顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)3維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，采用圖像平均法降低噪聲對點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的影響，獲取圖像復(fù)原處理用的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。

1 光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)

1.1 3維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)理論模型

3-D-PSF在離散空域里可視為一個(gè)3維矩陣。是由沿著3-D-PSF雙錐體中心光軸(z軸)不同的徑向橫截面(x-y面)組成，每一個(gè)橫截面對應(yīng)不同散焦量下的2維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(two-dimensional point spread function，2-D-PSF)，其中z=0處中間截面為焦平面2-D-PSF。

圓形孔徑小散焦光學(xué)傳遞函數(shù)(optical transfer function,OTF)的數(shù)學(xué)公式為[13]：

(1)

式中，α=4πws/λ，βcos-1(q/fc),s=2q/fc,w=δzdNA2/2,J1(x) 為第1類1階貝塞爾函數(shù)，w為最大光程差，λ為發(fā)射光波長，q為頻率，fc為系統(tǒng)截止頻率，dNA為數(shù)值孔徑，δz為樣本空間的沿z軸的散焦距離，即散焦量。當(dāng)散焦量δz取不同值時(shí)，得到不同的光程差w，進(jìn)而通過(1)式得到不同散焦量的光學(xué)傳遞函數(shù)，通過傅里葉逆變換可以得到對應(yīng)散焦量的一系列2-D-PSF，進(jìn)而構(gòu)成3-D-PSF。

1.2 顯微鏡成像原理

將厚度為T的3維樣本用平面模型表示為:

(2)

式中,N=T/Δz,Δz為物體平面沿z軸方向的微小間距。由3維顯微鏡成像系統(tǒng)可知，樣本在焦平面z′處所成像是每個(gè)平面與對應(yīng)2-D-PSF卷積之和，即：

(3)

式中，g為顯微鏡成像，f為原始3維樣本，h為對應(yīng)顯微鏡系統(tǒng)3-D-PSF，h(x,y,z′-iΔz),(i=1,2,…,N)表示散焦量δz為z′-iΔz的光學(xué)系統(tǒng)的脈沖響應(yīng)函數(shù)，即2-D-PSF。當(dāng)f為點(diǎn)光源且位于該焦平面時(shí)，即只有當(dāng)x=0,y=0,iΔz=z′時(shí)，f才有不為0的值，其余情況下都為0，由以上公式可知，點(diǎn)光源通過顯微鏡系統(tǒng)后所得的顯微圖像即為顯微鏡焦平面2-D-PSF。通過改變點(diǎn)光源的位置，即改變(3)式中iΔz的大小，便可以得到一系列不同散焦量的2-D-PSF，進(jìn)而可得出顯微系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)3-D-PSF。

2 3-D-PSF實(shí)驗(yàn)制作

2.1 實(shí)驗(yàn)點(diǎn)光源制作

點(diǎn)光源實(shí)驗(yàn)樣品的制備：本實(shí)驗(yàn)中采用嵌于聚丙乙烯酰胺凝膠中的熒光微珠(F8803，Thermo Fisher公司)作為模擬點(diǎn)光源實(shí)驗(yàn)樣品，熒光微珠直徑為0.1μm，激發(fā)光波長為460nm～485nm，發(fā)射光波長為510nm～525nm。將熒光微珠溶液稀釋1000倍，快速混勻后滴加至載玻片，待凝固后使用。

本實(shí)驗(yàn)是利用尼康Nikon Ti-E顯微鏡在物鏡放大倍數(shù)M=40、數(shù)值孔徑dNA=0.55的條件下對熒光微珠進(jìn)行序列圖像采集。

在使用實(shí)驗(yàn)測量點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)時(shí)，作為成像物體的熒光微珠其直徑應(yīng)盡可能小。根據(jù)顯微鏡成像分辨率的判斷標(biāo)準(zhǔn)，兩個(gè)點(diǎn)光源剛好被分辨出來的條件是兩個(gè)點(diǎn)光源在物平面的距離滿足瑞利距離或者阿貝距離。瑞利距離計(jì)算公式為[14-15]：

δ=0.61λ/dNA

(4)

取發(fā)射波長λ=520nm，則δ=0.57μm，即只要兩個(gè)光源的距離大于0.57μm時(shí)，便可通過顯微鏡進(jìn)行分辨。本實(shí)驗(yàn)中采用的熒光微珠直徑為0.1μm，小于該瑞利距離，表明該熒光微珠可作為空間的一點(diǎn)。

2.2 圖像采集

2.2.1 光學(xué)切片圖像采集 實(shí)驗(yàn)中使用尼康Nikon Ti-E顯微鏡，其搭載的高速電動控制系統(tǒng)，可以縮短圖像獲取的曝光時(shí)間，減少光毒對生物細(xì)胞的影響。該型號通過手柄或控制器可以控制電動XY載物臺和z軸，實(shí)現(xiàn)光軸最小步進(jìn)為0.025μm的3維顯微圖像的采集。

在顯微鏡物鏡放大倍數(shù)M=40、數(shù)值孔徑dNA=0.55條件下，利用型號為Nikon DS-Qi1的非致冷單色CCD對熒光微珠圖像進(jìn)行采集，其中光軸步進(jìn)間隔Δ=0.2μm。圖1為在顯微鏡所采集的熒光微珠圖像。其中圖1b為圖1a中所框熒光微珠對應(yīng)的局部放大圖(圖中灰度值是經(jīng)過歸一化處理，以便顯示和觀察，并非反映實(shí)際強(qiáng)度值,下同)?？梢园l(fā)現(xiàn)，即使稀釋了1000倍，載玻片上的熒光微珠依然較多。在選取微珠研究對象過程中，一是注意要間距,由于散焦的影響，相鄰微珠相互干擾，在選取過程中盡量加大相鄰微珠的間距，以減少相互之間的干擾，提高采集圖像的真實(shí)性;二是要確保所選微珠均有較高能量(亮度),在顯微鏡系統(tǒng)中，系統(tǒng)噪聲不可忽視，隨著散焦的不斷增加，信號越來越弱，當(dāng)信號大小低于噪聲大小時(shí)，主要信息將被噪聲所淹沒。

Fig.1 a—microscope picture of fluorescent microsphere b—partial enlargement

圖2為利用顯微鏡采集的一組不同散焦量的熒光微珠圖像，即不同散焦量的2-D-PSF (圖中數(shù)值為對應(yīng)散焦量δz的值,下同)。通過一系列不同散焦量的2-D-PSF進(jìn)而可以構(gòu)造得到實(shí)驗(yàn)3-D-PSF。由圖2可以明顯看出，隨著散焦量向兩側(cè)的增加，散焦像斑越來越大，圖像越來越模糊，同時(shí)兩側(cè)的散焦像斑存在差異。3維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的3維空間坐標(biāo)系z軸與顯微鏡光軸重合，原點(diǎn)為焦平面中心點(diǎn)。圖3為對應(yīng)實(shí)驗(yàn)3-D-PSF能量分布曲線(縱坐標(biāo)表示圖像進(jìn)行歸一化后像素大小，圖例數(shù)值為對應(yīng)的散焦量δz)。其中圖3a為對應(yīng)實(shí)驗(yàn)3-D-PSF沿著z軸(x=y=0)的能量分布，圖3b為對應(yīng)實(shí)驗(yàn)3-D-PSF沿著徑向(x軸)方向的能量分布。從圖3中曲線可以看出：(1)在光軸方向上，3-D-PSF在z=0的焦面處能量最大，證實(shí)了3-D-PSF的能量主要集中在雙錐體中部的錐頂附近區(qū)域，離開焦面后能量迅速衰減；(2)在徑向方向上，3-D-PSF越遠(yuǎn)離焦面其能量擴(kuò)散范圍越大。

Fig.2 Experimental 3-D-PSF

Fig.3 Energy distribution of experimental 3-D-PSFa—along z axis b—along radial direction

2.2.2 多次采集平均 圖像采集采用的是非致冷CCD傳感器，在采集過程中產(chǎn)生的噪聲影響不可忽略。隨著散焦量的逐步增大，散焦像的亮度會迅速降低，散焦2-D-PSF的分布狀況受影響的程度迅速加大，進(jìn)而影響所構(gòu)建的3-D-PSF的準(zhǔn)確性。為此，本實(shí)驗(yàn)中采用多圖像平均法，對熒光微珠多次圖像采集以進(jìn)行圖像平均運(yùn)算，降低噪聲對所構(gòu)建的3-D-PSF的影響。

本實(shí)驗(yàn)中對熒光微珠進(jìn)行4次圖像采集。圖像采集時(shí)，在同一實(shí)驗(yàn)條件下，以熒光微珠中心區(qū)域設(shè)置為固定的截面定位點(diǎn)，每次圖像采集均以此截面定位點(diǎn)為基準(zhǔn)，沿光軸從距離熒光微珠的上部12μm至下部12μm以0.2μm的步進(jìn)距離進(jìn)行微珠圖像采集，獲取微珠不同散焦量序列切片圖像。之后對4次采集的同一散焦量的4幅切片圖像進(jìn)行圖像平均運(yùn)算，平均后的圖像作為構(gòu)建3-D-PSF的序列2D-PSF。

圖4即為4次采集實(shí)驗(yàn)中3-D-PSF在每個(gè)平面中心點(diǎn)的能量分布情況(縱坐標(biāo)表示圖像實(shí)際像素值，圖例T1～T4分別表示連續(xù)進(jìn)行4次采集對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)3-D-PSF)。圖4b為圖4a中曲線頂點(diǎn)部分局部放大圖，y軸為對應(yīng)采集圖像像素大小。通過曲線可知，在微珠圖像采集過程中，隨著光照時(shí)間增加，熒光微珠受激產(chǎn)生的能量逐漸降低。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在挑選熒光微珠時(shí)，盡可能挑選能量較高、其處于焦面時(shí)的中心能量盡量與CCD最大量化值相接近，同時(shí)盡量縮短單次圖像采集曝光時(shí)間，以降低熒光微珠能量的衰減程度。

Fig.4 Energy distribution of PSF made by 4 experimentsa—energy distribution of center point b—partial enlargement

圖5是利用以上4次采集圖像通過多圖像平均法得出的不同散焦量的微珠序列切片圖像，即2-D-PSF。對比圖2單次采集的3-D-PSF切片圖像可以發(fā)現(xiàn)，利用多次采樣疊加平均法能夠在一定程度上降低顯微鏡系統(tǒng)噪聲對點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的影響。

Fig.5 Experimental 3-D-PSF after several images average

3 圖像復(fù)原

3.1 理論點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)制作

(1)式的光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)傳輸函數(shù)是理論點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的計(jì)算公式，結(jié)合顯微鏡系統(tǒng)相關(guān)參量、物鏡大小、CCD大小，以及顯微鏡成像特性及CCD圖像的數(shù)字化原理，可以通過該式計(jì)算獲得一組任意散焦量間隔的序列理論2-D-PSF。圖6所示為通過理論計(jì)算得到的一系列不同散焦量的2-D-PSF圖像。圖7為由該序列理論2-D-PSF構(gòu)建的理論3-D-PSF能量分布圖(縱坐標(biāo)表示圖像進(jìn)行歸一化后像素大小，圖例數(shù)值為對應(yīng)的散焦量δz)。其中圖7a為理論3-D-PSF能量沿軸向分布，圖7b為理論3-D-PSF能量沿徑向的分布。由圖7與圖3中曲線比較可看出，實(shí)驗(yàn)3-D-PSF與理論3-D-PSF能量都是主要集中在3-D-PSF雙椎體結(jié)構(gòu)的椎頂部分，能量分布沿軸向和徑向方向基本一致，而在局部區(qū)域有所不同。

Fig.6 Theoretical 3-D-PSF

Fig.7 Energy distribution of theoretical 3-D-PSFa—along z axis b—along radial direction

3.2 圖像復(fù)原分析

實(shí)驗(yàn)中熒光微珠和生物熒光組織3維切片間距均為0.2μm；采用3-D-PSF空間大小均為101pixel×101pixel×101pixel，3-D-PSF在z軸間距亦為0.2μm；圖像復(fù)原方法采用迭代盲去卷積(iterative blind deconvolution，IBD)算法[16]，初始3-D-PSF分別為理論3-D-PSF和實(shí)驗(yàn)3-D-PSF，迭代次數(shù)50次。

(5)

(6)

實(shí)驗(yàn)1:對熒光微珠3維切片圖像的復(fù)原。在相同的條件下，分別利用實(shí)驗(yàn)3-D-PSF和理論3-D-PSF對熒光微珠3維顯微鏡圖像進(jìn)行去卷積圖像復(fù)原處理。圖8為對熒光微珠3維顯微圖像復(fù)原的效果。其中圖8a為采集的熒光微珠成像的原始3維重構(gòu)光軸剖面(y-z面)圖，圖8b、圖8c分別為利用理論3-D-PSF和實(shí)驗(yàn)3-D-PSF復(fù)原的微珠圖像3維重構(gòu)光軸剖面圖。

Fig.8 Image restoration of microsphere

a—microsphere image b—theoretical 3-D-PSF restoration result c—experimental 3-D-PSF restoration result

由圖8可知，由于顯微鏡系統(tǒng)散焦的作用，熒光微珠通過顯微鏡成像后在3維空間上形成雙椎體結(jié)構(gòu)，能量集中在椎體附近。采用兩種點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)對熒光微珠3維圖像的復(fù)原均獲得良好的效果，在3維空間復(fù)原為一個(gè)微珠(亮點(diǎn))。同時(shí)復(fù)原圖像的上下兩端均存在一些雜散信息，主要是由于在去卷積過程中，邊界部分無法確定造成的。但是對比發(fā)現(xiàn)，兩者的復(fù)原效果不完全相同，利用實(shí)驗(yàn)3-D-PSF復(fù)原效果要比理論3-D-PSF復(fù)原效果要好。利用理論3-D-PSF復(fù)原的圖像雖然在空間上也形成了一個(gè)亮點(diǎn)，但是在旁邊還存在干擾，且亮度較小，而利用實(shí)驗(yàn)3-D-PSF復(fù)原的圖像在空間中形成的亮點(diǎn)亮度較大，與原始亮度較為接近，且周圍干擾較小。

實(shí)驗(yàn)2:對生物熒光組織3維切片顯微鏡圖像的復(fù)原。在相同的條件下，利用顯微鏡對熒光生物組織進(jìn)行3維切片的采集，然后利用實(shí)驗(yàn)3-D-PSF和理論3-D-PSF對熒光生物組織3維切片圖像進(jìn)行去卷積圖像復(fù)原處理。

圖9中顯示了4組不同切片圖像的復(fù)原效果。圖9a為采集的熒光組織原始切片圖像，圖9b為對應(yīng)利用理論3-D-PSF復(fù)原效果，圖9c為利用實(shí)驗(yàn)3-D-PSF復(fù)原效果。圖10是熒光組織的圖像復(fù)原3維重構(gòu)效果對比圖。其中圖10a為熒光組織原始3維重構(gòu)顯示圖，圖10b、圖10c分別為利用理論3-D-PSF和實(shí)驗(yàn)3-D-PSF復(fù)原的3維重構(gòu)顯示圖。

Fig.9 Image restoration of fluorescent tissue

a—microscope images collected by microscope b—theoretical 3-D-PSF image restoration c—experimental 3-D-PSF image restoration

Fig.10 Image restoration of 3-D fluorescent tissue

a—original fluorescent tissue b—theoretical 3-D-PSF restoration result c—experimental 3-D-PSF restoration result

由圖9和圖10可知，在原始樣本中，由于相鄰層散焦層對焦平面層之間的相互干擾，采集的切片圖像即包含該焦平面圖像信息，又含有相鄰散焦面的信息，使得采集圖像模糊，3維重構(gòu)圖像中無法看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。而通過實(shí)驗(yàn)3-D-PSF和理論3-D-PSF對圖像進(jìn)行復(fù)原時(shí)，能較好去除相鄰散焦面對圖像的影響，處理后圖像在每層中保留了該焦平面的主要信息，均獲得良好的復(fù)原效果，并很好地實(shí)現(xiàn)了生物組織的3維重構(gòu)。另外，實(shí)驗(yàn)3-D-PSF和理論3-D-PSF兩者的復(fù)原效果不完全相同，仔細(xì)觀察，實(shí)驗(yàn)3-D-PSF的復(fù)原效果更好。

4 結(jié) 論

利用熒光微珠實(shí)際測量系統(tǒng)的3-D-PSF，可以彌補(bǔ)理論3-D-PSF無法表征實(shí)際光學(xué)系統(tǒng)在生產(chǎn)制造過程中存在不可避免的偏差問題和噪聲因素的缺陷，使得實(shí)驗(yàn)3-D-PSF更符合該光學(xué)系統(tǒng)的光學(xué)傳遞特性。本文中以熒光微珠模擬點(diǎn)光源，通過數(shù)字共焦顯微鏡對熒光微珠的不同截面和不同散焦量的切片圖像進(jìn)行采集，通過4次采集得到相同的序列熒光微珠圖像，采用多圖像疊加平均法進(jìn)行處理，降低噪聲的影響，構(gòu)建顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)3-D-PSF。以該實(shí)驗(yàn)3-D-PSF與理論3-D-PSF對熒光微珠切片圖像以及熒光生物組織3維切片圖像進(jìn)行去卷積復(fù)原處理和對比分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)3-D-PSF與理論3-D-PSF均獲得良好的復(fù)原效果，而實(shí)驗(yàn)3-D-PSF具有更好的復(fù)原精度。